Summary
Traditionelle metoder til vurdering af adipogenic differentiering er billig og nem at bruge, men er ikke specifikke for ændringer i genekspression. Vi har udviklet en analyse for at kvantificere mesenchymale Celledifferentiering af modne adipocytter ved hjælp af en slægt specifikke markør. Denne analyse har forskellige programmer på tværs af grundforskning og klinisk medicin.
Abstract
Flere farvestoffer er i øjeblikket tilgængelig for brug i forbindelse med afsløring differentiering af mesenchymale celler adipocytter. Farvestoffer, såsom olie røde O, er billig, nem at bruge og bredt udnyttet af laboratorier, der analyserer adipogenic potentialet af mesenchymale celler. De er imidlertid ikke specifikke ændringer i genet transskription. Vi har udviklet en gen-specifikke differentiering analyse til at analysere når en mesenchymale celler har skiftet sin skæbne til en adipogenic afstamning. Immuno-mærkning mod fedtsyre bindende protein-4 (FABP4), en slægt-specifikke markør for adipogenic differentiering, aktiveret visualisering og kvantificering af differentierede celler. Evnen til at kvantificere adipogenic differentiering potentiale af mesenchymale celler i en 96 godt mikrotiterplade format har lovende konsekvenser for en række applikationer. Hundredvis af kliniske forsøg indebærer brug af voksne mesenchymale stromale celler og er det i øjeblikket vanskeligt at korrelere terapeutiske resultater inden for og især mellem sådanne kliniske forsøg. Denne enkle høj overførselshastighed FABP4 analyse giver en kvantitativ analyse til vurdering af patient-afledte celler differentiering potentiale og er en robust værktøj til at sammenligne forskellige isolation og udvidelse metoder. Dette er især vigtigt i betragtning den stigende anerkendelse af heterogenitet af de celler, der administreres til patienter i mesenchymale celler produkter. Analysen har også potentielle nytte i høj overførselshastighed stof screening, især i fedme og præ-diabetes forskning.
Introduction
En af de vigtigste krav fastsat af det internationale samfund for cellulære terapi (ISCT) til at definere en Multipotente mesenchymale stromale celle er, at cellerne skal have mulighed for at differentiere i adipogenic, osteogenic og chondrogenic slægter 1. konventionelle metoder til måling af differentiering af disse tre slægter stole på påvisning af makromolekylære produkter ved hjælp af kemiske farvestoffer1. Farvestoffer såsom olie røde O (som pletter fedt dråber i celler, der har undergået adipogenesis), er billig og nem at bruge; men de undlader at registrere de specifikke ændringer i genekspression, der opstår, når mesenchymale celler differentiere i hver respektive lineage2. Her, har vi udviklet en differentiering assay, der kvantificerer protein udtryk for en adipogenic slægt-specifikke markør, fatty syre-bindende protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 blev oprindeligt fundet i murine 3T3-L1 adipocytter3 og blev senere opdaget skal udtrykkes i menneskelige subcutan fedtvæv6. Det er en cytosole protein, der fungerer som en anstandsdame til at guide fedtsyre optagelse af celler og er involveret i processen med lipolyse4.
De forløber celler til differentiering assays blev fedt afledt mesenchymale stromale celler (ASCs)7,8. ASCs deler mange egenskaber med knoglemarv-afledte mesenchymale stamceller (BM-msc), en større mesenkymale stamceller befolkning i voksne8,9. ASCs tilbyder flere fordele i forhold til BM-MSCs i en klinisk anvendelse, som større udbytte af celler kan isoleres fra mere lettilgængelig væv kilder8,9. En isoleret celle befolkning skal opfylde visse kriterier, der defineres som ASCs. Først, skal de vise overholdelse af plast vævskultur fartøjer i standard kultur betingelser1. De skal også vise specifikke overflade antigen udtryk1. Ukultiveret ASCs er kendetegnet ved positiv overflade antigen udtryk for CD34, CD73, CD90, lav udtryk for CD105 og negative udtryk for CD45 og HLA-DR10. ASCs renset ved dyrkning på plastik i 28 dage (tilhænger renset ASCs) vise positive udtryk for CD73, CD90 og CD105 og negative udtryk af CD34, CD45 og HLA-DR10. Endelig skal celler bevare muligheden for at differentiere i forskellige lineages1,7,8.
Adipogenic differentiering protokoller fremkalde slående opregulering af FABP4 udtryk blandt andre adipocyt lineage gener, så vi brugte immunochemistry for at visualisere FABP4 protein i cellerne, og derefter kvantificeret FABP4 udtryk på enkelt celle-niveau ved hjælp af en automatiseret Fluorescerende høj-indhold screening mikroskop. Denne metode er fordelagtige over traditionel farvestoffer, da det giver mulighed for meget specifikke bekræftelse af adipocyt-lineage differentiering. Sådanne gen specifikke lineage assays kombineret med højt indhold af screening-metoder også aktiverer kvantificering af andelen af celler i en heterogen celle forberedelse, der er i stand til at differentiering ned en bestemt slægt. I vores undersøgelser brugte vi FABP4 analysen for at bekræfte tab af adipogenic differentiering potentiale af frisk isolerede ASCs efter cellekultur.
Protocol
1. forberede differentiering Assays til ASCs
- Forberede vævskultur reagenser og håndtere levende celler i en steril vævskultur hætte.
- Forberede A0 medium: Dulbecco ændret Eagle Medium og Hams F12 Medium (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x penicillin/streptomycin.
- Udarbejde komplette ASC medium: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penicillin/streptomycin, 10% føtal bovint serum.
- Brug tilhænger renset ASCs, udvidet i en T75 kultur kolbe. Bekræfte renheden af ASCs bruge fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)10.
- Frigør celler ved at fjerne alle medium fra T75 kultur kolbe og tilsætning 2 mL af celle dissociation enzym.
- Forlade kultur kolben i inkubator (37 ° C, fugtet, 5% CO2) for 5-10 min. Tage kultur kolben ud af rugemaskinen og tryk fast på siden af kolben. Check, hvis cellerne har løsrevet fra kultur kolben ved hjælp af en omvendt mikroskop.
- Tilføje 13 mL A0 medium til en T75 kultur kolbe.
- 15 mL overføres til en 15 mL centrifugeglas, og der centrifugeres ved 400 x g i 5 min.
- Supernatanten og genopslæmmes celle pellet i 1 mL af komplet ASC medium.
- Udføre en celletal, ved hjælp af hemocytometer.
- Fortyndet cellesuspension til en koncentration af 25.000 celler mL-1 i komplet ASC medium.
- Tilføje 200 µL af A0 medium til alle periferien wells af 96 godt plade (flad bund). Dette reducerer fordampning sats af brønde med celler i midten.
- Overføre 200 µL af cellesuspension til en microwell plade til at opnå en endelig celle tæthed af 5 x 103 celler pr. brønd. Fire brønde er nødvendige for hver behandling (tredobbelt tekniske gentagelser og en ingen primære antistofkontrol for immuncytokemi (ICC)).
- Forlade microwell plade i inkubator (37 ° C, fugtet, 5% CO2) indtil celler reach sammenløbet (3-4 dage).
2. inducere differentiering af ASCs
- Forberede adipogenic differentiering mellem ved at supplere komplet ASC medium med 1 µM dexamethasome, 10 µM insulin og 200 µM indomethacin. Komplet differentiering medium er stabilt på 4 ° C i 1 måned, så kun gøre som krævet for 1 assay. Butik ved 4 ° C, og når det påkræves varme en alikvot til 37 ° C i vandbad.
- Efter 3-4 dage, tage microwell plade ud af inkubator og erstat halvdelen af substratet med adipogenic differentiering medium.
- Udføre en mellemlang Skift hver 2-3 dage.
Bemærk: Optimale adipogenic differentiering kræver 14 dage af kultur i differentiering medium. Differentierede celler er analyseret ved hjælp af traditionelle farvestofbaseret pletter og gen-specifikke pletter.
3. farvning for differentiering - traditionelle Dye baseret pletter
- Forbered 4% formaldehyd løsning af fortynding 16% formaldehyd med PBS. Fortynd kun nødvendige for eksperiment beløb og butik tæt forseglet i et centrifugeglas.
Forsigtig: Formaldehyd er en potentiel kræftfremkaldende og kan forårsage irritation af næse, hals og lungerne ved indånding. Udføre alle procedurer vedrørende formaldehyd i et stinkskab. - Forberede olie røde O stamopløsning ved at opløse 300 mg i 100 mL isopropanol.
- Tage microwell pladen ud af varmeskabet. Følgende trin kan udføres i en ikke-sterile omgivelser.
- Fjerne alle medium fra brønde og løse celler med 4% formaldehyd i 30 min.
- Under inkubationstiden, forberede olie røde O brugsopløsning. Brugsopløsning består af 6 dele olie røde O lager med 4 dele destilleret vand (dH2O). Bland godt og lad sidde ved stuetemperatur i 20 min, før filtrering ved hjælp af 0,2 µm filterenhed. Arbejder løsning er kun stabil for 2 h.
- Fjern alle formaldehyd fra brønde ved pipettering.
- Vaske cellerne en gang med 60% isopropanol og lad brøndene tørre helt, før du fortsætter.
- Tilsæt 50 µL af olie røde O brugsopløsning til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
- Fjerne olie røde O løsning og straks tilføje dH2O. Wash med dH2O 4 gange før visning under lysmikroskop.
4. farvning for differentiering - gen specifikke antistoffer
- Forberede stamopløsning af Tris bufferet saltvand (TBS) ved at opløse 80 g NaCl, 2 g af KCl og 30 g af Tris Base til 1 L med dH2O (pH 8). Forberede brugsopløsning ved fortynding 1:10 med dH2O. butik ved stuetemperatur.
- Forberede immunobuffer (IB) (1% føtal bovint serum (FBS) i TBS). Etiket 15 mL centrifugeglas med dato og opbevares ved 4 ° C. IB kan bruges i 1 uge fra indgivelse.
- Forberede 0,25% kasein blocker ved at opløse 0,5 g af kasein og 0.195 g natriumazid i 200 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Opløses fuldstændigt ingredienserne af omrøring natten over. Alikvot i 15 mL centrifugeglas og opbevares i en-20 ° C fryser. Optøede kasein løsninger kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
- Forberede DAPI løsning ved at fortynde stock DAPI 1:200 i TBS. butik ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
- Forberede lager thimerosal løsning (10 mg mL-1) ved at opløse thimerosal i steril PBS. Opbevares ved 4 ° C og fortyndes passende beløb til 0,4 mg mL-1 til brug.
- Fix og permeabilize celler med iskold methanol (96 godt plade) for 5 min. vaske cellerne en gang med 200 µL af TBS.
- Blok med 50 µL af 0,25% kasein ved stuetemperatur i 10 min og vask en gang med TBS.
- Tilsæt 50 µL af primære antistoffer fortyndet i IB (Se tabel 1 for antistof detaljer), og der inkuberes med lågene lukket for 1 h.
- Vask en gang med 200 µL af TBS, og derefter 3 gange med TBS for 5 min med blid vuggende.
- Tilsæt 50 µL af sekundære antistoffer fortyndet i IB (Se tabel 2 for antistof detaljer) med 1: 2000 DAPI i hver, inkuberes med lågene lukket for 1 h. dække pladen med folie for at forhindre, at foto-blegning.
- Vask en gang med TBS, og derefter to gange med TBS for 15 min med blid vuggende.
- Fjern alle TBS og tilsæt 200 µL af thimerosal løsning.
- Gemme plade ved 4 ° C, beskyttet mod lys indtil billeddannelse.
5. imaging celler ved hjælp af en høj overførselshastighed mikroskop
- Analysere celler farves med gen specifikke antistoffer og fluorophore konjugeret sekundære antistoffer (immunofluorescens) ved hjælp af en høj indhold screening mikroskop kontrolleret med tilhørende software.
- Indlæse microwell plade i mikroskop fase. Vælg billede på mellemlang rækkevidde forstørrelse (10 X mål linse) på kontrolelementet plade erhvervelse. Kontroller, at billederne er taget fra midten af hver brønd med 50 µm afstand i mellem hver site til at sikre, at en celle ikke vises i to tilstødende felter.
- Vælg brønde til billede.
- Vælg den passende kanal kombinationer, eksponeringstid og z-offset parametre. Henvises til tabel 3 for mere detaljerede oplysninger om hver filtre (supplerende tabel 2).
- Erhverve analysen ved hjælp af guiden erhvervelse (billeder gemmes automatisk til Database-server).
- Brug alternative kanal kombinationer at erhverve plader farves med olie røde O. (supplerende tabel 3).
6. analysere erhvervet billede
Bemærk: Fjernadgang til database server muliggør nem og hurtig evaluering af billederne erhvervet og brugen af billede analyse software.
- Åbne celle Scoring modul på den analyse programmel.
- Opdage cellekerner bruger DAPI kanal (nukleare markør) og segment kerner af interesse med brugerdefinerede parametre for størrelse og signalere intensitet over baggrunden.
- Registrere FABP4 signal ved hjælp af FITC kanal. Segmentere differentierede celler med brugerdefinerede parametre for størrelse og signal intensitet over baggrunden for at vælge alle FABP4 positive regioner i hvert billede.
- Åben Transfluor modul på den analyse programmel hen til analysere plader farves med olie røde O.
- Angiv størrelse og intensitet af olie røde O farves regioner som 'pitten'.
Representative Results
I denne undersøgelse, adipogenic differentiering potentiale ASCs med 3 forskellige metoder blev målt. Immunfluorescent mærkning af FABP4, viste, at denne markør lokaliseret til cytoplasma af differentierede celler og mærkning overlappede med DAPI-mærkede cellekerner (figur 1A). Automatiseret billedanalyse afslørede en 24.6 fold stigning i % af FABP4 positive celler i den opdelte gruppe i tidlige passage celler sammenlignet med 6,9 fold stigning i sene passage celler (figur 1B). Olie røde O farvning var lokaliseret til fedt dråber spredt cytosol af differentierede celler og mærkning sjældent overlappede med DAPI-mærkede cellekerner; der er dog fra besigtigelse, færre cellekerner er forbundet med olie røde O fedt dråber i de sene passage celler i forhold til tidlige passage celler (figur 2A). Automatiseret billedanalyse afslørede en 11,1 fold stigning inden for olie røde O farvning pr. celle i tidlige passage celler og en 53.9 fold stigning i farvning areal pr. celle i slutningen passage celler (figur 2B). Billeddannelse af begge pletter blev udført, og derefter kvantificeres ved hjælp af celle Scoring (FABP4) eller Transfluor (olie røde O) modul i software (tillægs figur 1, supplerende tabel 2-5). Opregulering af FABP4 udtryk blev bekræftet af Western blot analyse (figur 3, supplerende figur 5). Alle 3 analysemetoder, der afslørede, at tidlig passage ASCs har højere adipogenic differentiering potentielle end sent passage celler. Adipogenic differentiering påvirkede ikke cellen total antal pr. brønd (tillægs figur 2, 3). Kerner størrelse af FABP4-positive differentierede celler var dog betydeligt mindre end kontrol celler for sent passage ASCs kun (supplerende figur 3).
Vi vist, at celler blev udvidet i kultur, eller passaged, procentdelen af celler i den kultur, der er i stand til at adipogenic differentiering nedsat, i overensstemmelse med tidligere udgivne data11. Det er vigtigt at bemærke, at faktorer som alder, BMI og tidligere sygehistorie12 ikke kunne kontrolleres i denne undersøgelse og sandsynligvis bidraget til variabiliteten observeret mellem forskellige donor prøver (supplerende tabel 1).
Figur 1 : FABP4 immunolabelling viser, at tidlig passage celler har større differentiering potentielle end senere passage celler. A) repræsentative billeder af tidlige og sene passage, kontrol og differentierede celler mærket med DAPI (nukleare pletten) og FABP4 er vist sammen med Flet og segmentering billeder. Segmenteringen billeder vise opdelte celler med en grøn overlay og udifferentierede celler med en rød overlay. B) en betydelig stigning i FABP4 udtrykker celler blev observeret med adipogenic differentiering i tidlige og sene passage celler, men tidlig passage celler vist betydeligt større stigning i differentiering end sent passage celler (Mann-Whitney test * betegner P < 0,05 og *** betegner P < 0,001). De viste data er gennemsnitlige på tværs af tidlige passage (p4; n = 8) eller sent passage (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Olie røde O farvning viser, at tidlig passage celler har større differentiering potentielle end senere passage celler. A) de repræsentative billeder af DAPI (nukleare pletten) og olie røde O (grå, lipid droplet pletten) er vist sammen med Flet og segmentering billeder. Segmentering billeder skildrer alle kerner med grønne overlay og olie røde O farves lipid dråber med en rød overlay. B) en betydelig stigning i olie røde O farvning område blev observeret med adipogenic differentiering. Tidlige passage celler viste større område af olie røde O pletten pr. celle i forhold til sen passage celler. Område af olie røde O farvning pr. celle (μm2) bruges her som et mål for adipogenic differentiering potentielle. De viste data er gennemsnitlige på tværs af tidlige passage (p4; n = 8) eller sene passage (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM (Mann-Whitney test * betegner P = < 0,05 og *** betegner P = < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Western blot analyse af FABP4 protein udtryk niveau af differentierede tidligt og sent passage ASCs. Semi-kvantitative analyse af Ekstinktionen af FABP4 bands som forholdet mellem total protein lastning kontrol, beta actin (ACTB), viste, at FABP4 immunolabelling var steget betydeligt i tidlige passage og til en mindre grad forsinkede passage differentieret celler. De viste data er gennemsnitlige på tværs af tidlige passage (p4; n = 8) eller sene passage (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM (Mann-Whitney test * betegner P = < 0,05 og *** betegner P = < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Target antigen | Isotype (klon) | Arter | Fortynding |
| FABP4 | Polyklonale | Kanin | 1: 100 |
Tabel 1: Primære antistof
| Målretning antistof | Fluorophore etiket | Arter | Fortynding |
| Kanin IgG | Alexa fluoro 488 | Ged | 1:200 |
Tabel 2: Sekundær antistof
Tillægs figur 1: oversigt over billede analyse virtuelle miljø. De farvede celler blev afbildet ved hjælp af en automatiseret, høj overførselshastighed fluorescerende mikroskop til at undgå enhver kilde til bias. Billeder blev anskaffes ved hjælp af ImageXpress Micro XLS, gemt direkte til MDCStore Data Manager-databasen, og stilles til rådighed for visning via virtuelle desktop slægtskaber, som brugerne kan bruge til at optimere og teste deres specifikke analyseparametre. Billeder blev analyseret med en dedikeret 'bil'-forekomst, som giver mulighed for flere forskellige brugere til at sende 'jobs' til autorun kø. Brugere kan hente deres data via den virtuelle forekomst, når deres 'job' er afsluttet. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Tillægs figur 2: sammenligning af samlede celle tæller pr. brønd af kontrol og differentieret brønde for tidlige og sene passage ASCs, ved hjælp af FABP4 plettet plade. De viste data er gennemsnitlige på tværs af tidlige passage (p4; n = 8) eller sent passage (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem kontrol og differentierede celler for både tidlige og sene passage ASCs. Der var flere celler pr. brønd for tidlige passage celler i forhold til sen passage celler. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 3: sammenligning af samlede celle tæller pr. brønd af kontrol og differentieret brønde for tidlige og sene passage ASCs, ved hjælp af olie røde O farves plade. De viste data er gennemsnitlige på tværs af tidlige passage (p4; n = 8) eller sent passage (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem kontrol og differentierede celler for både tidlige og sene passage ASCs. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 4: på senere passager, differentierede celler, der var FABP4 positive havde betydeligt mindre kerner område end celler i kontrolhullerne. Der var ingen statistisk signifikant forskel i kerner område mellem kontrol og differentierede celler i tidlige passage. De viste data er gennemsnitlige på tværs af tidlige passage (p4; n = 8) eller sent passage (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. (uparret t test. *** betegner P = < 0,001). Gennemsnit ± SEM er vist.) Venligst klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 5: billeder af Western blot geler. Røde kanal skildrer beta-actin. Grøn kanal skildrer FABP4 immunolabelling. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Supplerende tabel 1: Clinicopathological oplysninger om donorer Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Imaging indstillinger (FABP4) Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 3: Imaging indstillinger (olie røde O) Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 4: oversigt over analyseparametre brugt (FABP4). Celle Scoring modul. Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 5: tabel af analyseparametre anvendes (olie røde O). Trans Fluor modul. Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Dette papir viser nytte og fordele af FABP4 immunolabelling til præcist at detektere og kvantificere modne adipocytter afledt af mesenchymale stromale celler. FABP4 er købedygtig opdager ændringer i udtryk et lineage specifikke protein3,,4,5 i modne adipocytter, i strid med andre almindeligt anvendte farvestoffer som etiket makromolekylære ændrer13,14 olie røde O15, Nile rød16 og Sudan sort17. FABP4 immunolabelling giver mulighed for visualisering og analyse af ændringer i cellulære morfologi. Dette er en markant fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder ved hjælp af kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR), der analyserer ændringer på udskrift plan uden nogen visualisering5,18,19 ,20, eller flowcytometri, der kræver celler i suspension20eller Western blotting der kræver celler til at være mængden for at isolere protein19,20. FABP4 immunolabelling er stabilt i faste celler, sive ikke ud i løsning og at være en cytosole protein når mærket i en vedhængende éncellelag af celler, vil overlappe kerne giver mulighed for nem visualisering og tilføjet nøjagtighed i den automatiserede analyse.
High-indhold screening er fordelagtig, fordi den er hurtig, nøjagtig, reproducerbare og objektive. Det giver en platform for omkostningseffektiv brug af reagenser og forsker tid, da billede erhvervelse og analyse kræver minimal manuel manipulation og stole på den automatiske behandling af instrumentet. Flere faktorer blev identificeret som kritiske nøjagtigheden og reproducerbarhed af high-indhold screening-undersøgelser,31. Kvantificering af antigen udtryk er afhængig af billedkvaliteten. For vellykket billedanalyse, billeder fra hver kanal pr. brønd skal være i fokus og falder inden for en optimal dynamikområde til grå værdier (Auto afsløre indstillinger er ideel). Ud af fokus eller mættede billeder føre til fejlagtige resultater.
Nogle potentielle begrænsninger af de metoder, der beskrives i denne artikel omfatter følgende. Krav til specialiseret imaging udstyr og analyse software. Mens uden for anvendelsesområdet for denne artikel, kan alternative open source software muligheder (for eksempel ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) bruges til at udføre lignende billedsegmentering opgaver; men de kræver færdigheder enten hente og skræddersy makroer tilgængelig online eller skrive makroer/kommandoer for deres specifikke analyse rørledninger. Iboende til alle automatiske imaging analyse rørledninger er et niveau af baggrundsstøj. Dette kan i vid udstrækning tilskrives vragrester, dårlig billede kvalitet eller analyse fejl, understreger behovet for omhyggelig prøveforberedelsen og omhyggelig opsætning af billedbehandling og analyse-platformen. FABP4 etiket i mus er blevet fundet for at opdage udifferentierede stamfaderen30; mens kontrolelementerne i denne undersøgelse (som består af udifferentierede celler) er blottet for specifikke FABP4 farvning. Denne manglende scores nødvendigheden af kontrol FABP4 udtryk udifferentierede ophav i hver biologisk kontekst hvor analysen er ansat.
For at drage gyldige sammenligninger mellem FABP4 mærkning og olie røde O farvning, output målinger fra billedanalyse skulle være biologisk relevante. Derfor, måling, '% positive celler' blev brugt til FABP4, og 'område af farvning pr. celle' blev brugt til olie røde O. Det er bemærkelsesværdigt, at foranstaltning '% positive celler' ikke blev brugt til olie røde O mærket celler i vores undersøgelse, fordi det ikke var muligt at tilskrive de mærkede fedt dråber præcist til en given kerne; de fedt dråber varierede betydeligt i størrelse, antal og fordeling på tværs af cellen kroppen og sjældent overlappede med kernen. Olie røde O farvning variation der findes mellem celler, der stammer fra forskellige væv kilder; mens % positive celler foranstaltning ikke var egnet til den igangværende undersøgelse, en anden gruppe har brugt det med succes for at kvantificere adipocytter stammer fra menneskelige kirtel stamceller22 hvor olie røde O farvning optrådte som en stor fedt droplet, som strakte sig over de cytoplasma og overlappede med kerner og gør det muligt data der skal fremlægges som % positive celler.
Derimod er morfologi af FABP4 immunolabelling konsekvent i adipocytter stammer fra en række forskellige væv kilder23,24,25. Evnen til at kvantificere andelen af celler i en kultur, der er i stand til at differentieringen har en række anvendelser. Voksen mesenchymale stromale celler holder betydelig lovende for en bred vifte af terapeutiske anvendelsesmuligheder. Et vigtigt spørgsmål, som er opstået med kliniske oversættelse er den iboende variation i evne til disse celler mellem patienter26, mellem lokaliteter af isolation27,28, og mellem metoder til isolering12 og udvidelse af celle numre12 til terapeutisk brug. Det har været vist tidligere kulturer af vedhængende stromale celler er ofte heterogene, med nogle celler i stand til differentiering og nogle ikke 12,17 som vores FABP4 analysen viser for ASC kulturer. Undersøgelser, som dette, kombineret med berigelse teknikker, vil hjælpe med at identificere delpopulationer i heterogene kulturer kan afstamning-specifikke differentiering. At have en standardiseret, kvantificerbare assay som denne FABP4 assay indeholder en enkel metode til sammenligning mellem alle disse variabler, og potentiale til at evaluere terapeutiske resultater inden for og mellem kliniske forsøg.
Kvantificering af FABP4 i en semi-automatiseret måde giver objektivitet og reproducerbarhed i analyse på tværs af mange donor sager og prøver. Desuden som etiketten er cytoplasmatisk, kan det potentielt blive anvendt til at analysere hypertrofi (udvidelse af adipocyt størrelse) ud over hyperplasi (stigning i adipocyt række), en sondring, der er af stor betydning i fedme forskning, hvor hypertrofi er stærkt forbundet med fedt dysfunktion i fede personer21. Fedmeepidemien har ansporet en betydelig interesse i at identificere stoffer i stand til at kontrollere lipid opbevaring. Denne FABP4 analyse giver også en enkelt udlæsning til screening af tusindvis af forbindelser for deres evne til at hæmme lipid ophobning.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for donorer af fedtvæv og forskning fagfolk, der indsamler og giver os denne ressource for forskning brug. Vi vil gerne anerkende finansieringen støtte af Allergan. Vi er også taknemmelige til University of Auckland, Faculty of Medical og Health Sciences ydeevne baseret forskning Fund for finansiering af omkostningerne ved videoing og redigering for indgivelse af denne artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
