Summary
Adipogenic 차별 평가의 전통적인 방법은 저렴 하 고 사용 하기 쉬운, 하지만 특정 유전자 발현에서 변화 하지 않습니다. 성숙한 adipocytes 계보 특정 마커를 사용 하 여에 중간 엽 세포 분화 척도를 분석 결과 개발 했습니다. 이 분석 결과 기초 연구 및 임상 의학에 걸쳐 다양 한 응용 프로그램 있다.
Abstract
여러 가지 염료 검출 하는 adipocytes에 중간 엽 세포의 분화에서 사용 하기 위해 현재 사용할 수 있습니다. 염료, 기름 빨간 O, 등 있으며 저렴 한, 사용 하기 쉽고 널리 사용 중간 엽 세포의 adipogenic 잠재력을 분석 하는 실험실에 의해. 그러나, 그들은 유전자 녹음 방송에 있는 변화에 특정 되지 않습니다. 들어오면 중간 엽 세포는 그것의 운명 adipogenic 계보를 분석 하는 유전자 특정 차별화 분석 결과 개발 했습니다. 지방산 바인딩 단백질-4 (FABP4), adipogenic 차별화의 계보 특정 표식에 대 한 면역 라벨 시각화 및 차별화 된 셀의 정량화를 사용할 수 있습니다. Adipogenic 96 잘 microplate 형태로 중간 엽 세포의 감 별 법 잠재력을 계량 수 응용 프로그램의 수에 대 한 유망한 의미를 갖는다. 성인 중간 엽 기질 세포의 사용을 포함 하는 임상 시험의 수백 그리고 현재 시간과 같은 임상 시험의 사이 특히 치료 결과 연관 어렵다. 이 간단한 높은 처리량 FABP4 분석 결과 환자 파생 된 세포의 분화 가능성을 평가 대 한 양적 분석 결과 제공 하 고 다른 격리 및 확장 메서드를 비교 하기 위한 강력한 도구입니다. 이것은 특히 중요 한 엽 셀 제품에 환자에 게 투여 되 고 세포의이 성분의 증가 인식 주어진입니다. 분석 결과 또한 비만 사전 당뇨병 연구에서 특히 높은 처리량 마약 검사에서 잠재적인 유틸리티가 있다.
Introduction
세포 치료 (ISCT) 정의 multipotent mesenchymal stromal 세포를 국제 사회에 의해 설립 하는 주요 요구 사항 중 하나는 셀 adipogenic, osteogenic chondrogenic 혈통으로 차별 하는 능력 있어야 1. 화학 염료1를 사용 하 여 고분자 제품의 검색에 의존 하는이 3 개의 계보에 차별화를 측정의 전통적인 방법. (어떤 지질을 받은 세포에 있는 뚱뚱한 작은 물방울 얼룩) 기름 빨간 O 같은 염료는 저렴 하 고 사용 하기 쉬운; 그러나 그들은 각 각각 리니지2로 중간 엽 세포 분화 때 발생 하는 유전자 발현에서 특정 변경 내용을 검색 하지. 여기, 우리는 지방산 바인딩 단백질-4 (FABP4)3,,45adipogenic 계보 관련 마커 단백질 식을 단정 차별화 분석 결과 개발 했습니다. FABP4 murine 3T3-L1 adipocytes3 에서 처음 발견 하 고 인간의 피하 지방 조직6에 표현 될 나중에 발견 되었다. 그것은 세포에 의해 지방산 통풍 관을 안내 하는 보호자 역할을 하며 lipolysis4과정 참여 cytosolic 단백질.
전조 세포 감 별 법 분석 실험에 사용 했다 지방이 많은 파생된 mesenchymal stromal 세포 (ASCs)7,8. ASCs 골 수 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSCs BM), 성인8,9주요 중간 엽 줄기 세포 인구와 많은 속성을 공유. ASCs 제공 임상 응용 프로그램에 여러 이점이 BM MSCs 셀의 큰 수확량 더 쉽게 액세스할 수 조직 소스8,9에서 고립 될 수 있다. 고립 된 세포 인구 ASCs로 정의할 수 특정 기준을 충족 해야 합니다. 첫째, 그들은 표준 문화 조건1플라스틱 조직 문화 배 준수를 제시 해야 합니다. 그들은 또한 특정 표면 항 원 식1을 제시 해야 합니다. 뱀과 ASCs 긍정적인 표면 항 원 표현 CD34, CD73, CD90, 낮은 표현의 CD105, CD45 그리고 HLA-DR10의 부정적인 표현 특징입니다. ASCs (점착 정화 ASCs) 28 일에 대 한 플라스틱에 경작에 의해 순화 CD73 CD90, CD105 긍정적인 표현과 CD34, CD45 그리고 HLA-DR10의 부정적인 표현을 표시 합니다. 마지막으로, 세포는 다양 한 계보1,,78로 분화 하는 능력을 유지 해야 합니다.
그래서 우리는 FABP4, 세포 내에서 단백질을 시각화 하기 위해 immunochemistry를 사용 하 고 다음 단일 셀 수준에 FABP4 식 계량 Adipogenic 차별화 프로토콜 다른 체형 혈통 유전자 사이 FABP4 식의 눈에 띄는 upregulation 유도 자동화 된 형광이 콘텐츠 심사 현미경을 사용 하 여. 이 메서드는 전통적인 염료에 유리한 체형 혈통 차별화의 매우 구체적인 확인 하면. 이러한 유전자 특정 계보 분석 심사 방법 또한 높은 콘텐츠와 결합 사용 특정 계보를 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 준비 내의 셀의 비율의 정량화. 우리의 연구에서 우리는 세포 배양 후 갓 격리 ASCs의 adipogenic 감 별 법 잠재력의 손실을 확인 하 FABP4 분석 결과 사용.
Protocol
1. 준비 ASCs 차별화 분석
- 조직 배양 시 약을 준비 하 고 메 마른 조직 문화 후드에 라이브 셀 처리.
- A0 매체 준비: Dulbecco 수정이 글 매체와 햄의 F12 매체 (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x 페니실린/스.
- 완전 한 ASC 매체 준비: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x 페니실린/스, 10% 태아 둔감 한 혈 청.
- 사용 하 여 점착 ASCs, T75 문화 플라스 크에 확장 정화. ASCs 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)10을 사용 하 여의 순도 확인 합니다.
- T75 문화 플라스 크에서 모든 매체를 제거 하 고 세포 분리 효소의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 분리 합니다.
- 5-10 분 (37 ° C, 습도, 5% CO2) 인큐베이터에서 문화 플라스 크를 둡니다. 인큐베이터에서 배양 플라스 크 하 고 플라스 크의 측면을 단단히 누릅니다. 세포는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 문화 플라스 크에서 분리가 확인 하십시오.
- T75 문화 플라스 크를 A0 매체의 13 mL를 추가 합니다.
- 15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기에 15 mL를 전송 합니다.
- 상쾌한 삭제 하 고 다시 완전 한 ASC 매체의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.
- Hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 수행 합니다.
- 완전 한 ASC 매체에 25000 셀 mL-1 의 농도에 세포 현 탁 액을 희석.
- 96 잘 접시 (플랫 바닥)의 모든 주변 우물에 A0 매체의 200 µ L를 추가 합니다. 이 센터에 있는 셀을 포함 하는 우물의 증발 속도 줄일 수 있습니다.
- 잘 당 5 x 103 셀 마지막 셀 밀도 달성 하기 위해 microwell 플레이트에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 전송 합니다. 4 개의 우물 (triplicate 기술 반복 및 immunocytochemistry (ICC)에 대 한 1 차적인 항 체 제어 하지) 각 치료 그룹에 대 한 필요 합니다.
- 남겨 주세요 인큐베이터 (37 ° C, 습도, 5% CO2)에서 microwell 플레이트 세포까지 도달 합류 (3-4 일).
2. 유도 ASCs의 차별화
- 1 µ M dexamethasome, 10 µ M 인슐린 및 200 µ M indomethacin 완전 한 ASC 매체를 보완 하 여 adipogenic 차별화 매체를 준비 합니다. 완전 한 차별화 매체 1 분석 결과 대 한 필요에 따라 1 개월에 4 ° C, 그래서 유일한에서 안정적입니다. 저장소 4 ° C에서 필요한 경우는 약 수 물 목욕에서 37 ° C에 열.
- 3-4 일 후 인큐베이터에서 microwell 접시 고 adipogenic 차별화 매체 문화 매체의 절반을 바꿉니다.
- 2-3 일 마다 중간 변화를 수행 합니다.
참고: 최적의 adipogenic 차별화 차별화 매체에 문화의 14 일 필요합니다. 차별화 된 셀 기반으로 하는 전통적인 염색 얼룩과 유전자 특정 얼룩을 사용 하 여 분석 된다.
3. 얼룩 차별화-전통 염료 기반 얼룩
- 준비 하 여 4% 포름알데히드 솔루션 PBS 가진 16% 포름알데히드를 diluting. 실험에 필요한 금액 및 원심 분리기 튜브에 단단히 밀봉 되 게 희석.
주의: 포름알데히드는 잠재적인 발암 물질 이며, 코, 목 구멍, 흡입 시 폐에 염증을 일으킬 수 있습니다. 증기 두건에서 포름알데히드와 관련 된 모든 절차를 수행 합니다. - 300 mg의 소 프로 파 놀 100 mL에 용 해 하 여 기름 빨간 O 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 인큐베이터에서 microwell 접시를 가져가 라. 다음 단계는 비 살 균 환경에서 수행할 수 있습니다.
- 우물에서 모든 매체를 제거 하 고 30 분 동안 4% 포름알데히드와 셀을 수정.
- 인큐베이션 기간 동안, 기름 빨간 O 작업 솔루션을 준비 합니다. 작업 솔루션 6 부품 기름 빨간 O 주식 4 부분 증 류 물 (dH2O)로 구성 되어 있습니다. 잘 혼합 하 고 0.2 µ m 필터 단위를 사용 하 여 필터링 하기 전에 20 분 동안 실내 온도에 앉아 보자. 솔루션 작동만 2 시간에 대 한 안정적입니다.
- Pipetting으로 우물에서 모든 포름알데히드를 제거 합니다.
- 셀 60% 소 프로 파 놀과 우물 진행 하기 전에 완전히 건조 하자 한 번 씻는 다.
- 각 잘 하 기름 빨간 O 작업 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 기름 빨간 O 솔루션을 제거 하 고 즉시 dH2오 워시 가벼운 현미경에서 전에 dH2O 4 번을 추가 합니다.
4. 차별화-유전자 특정 항 체 얼룩이 지기
- NaCl, KCl의 2 세대와 트리 스 (pH 8) dH2O의 1 L 자료의 30 g의 80 g을 용 해 하 여 버퍼링 트리 스 염 분 (TBS)의 재고 솔루션을 준비 합니다. DH2O. 저장소를 사용 하 여 실 온에서 1시 10분을 diluting 하 여 작업 솔루션을 준비 합니다.
- Immunobuffer (IB) 준비 (1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) TBS에서). 날짜와 15 mL 원심 분리기 튜브 라벨 및 4 ° c.에 저장 IB는 만든 날짜에서 1 주 동안 사용할 수 있습니다.
- 카 제인의 및 0.195 g의 나트륨 아 지 드 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 200 mL에 0.5 g을 용 해 하 여 0.25% 카 제인 차단기를 준비 합니다. 완전히 하룻밤에 감동 하 여 재료를 분해. 15 mL 원심 분리기 튜브와-20 ° C 냉동 고에서 약 수. 해 동된 카 세 인 솔루션 1 개월 4 ° C에서 보관 될 수 있습니다.
- 재고 DAPI 1: 200 tbs. 저장소에 4 ° C, 빛에서 보호에 diluting 하 여 DAPI 솔루션을 준비 합니다.
- 살 균 PBS에서 thimerosal을 용 해 하 여 재고 thimerosal 솔루션 (10 mL-1)를 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 하 고 0.4 mg mL-1 사용 하기 위해 적절 한 금액을 희석.
- 수정 하 고 차가운 메탄올 (96 잘 접시) tbs.의 200 µ L 한번 5 분 세척 세포와 세포를 permeabilize
- 10 분 동안 실내 온도에 0.25% 카 제인의 50 µ L를 차단 하 고 tbs.로 한 번 씻어
- IB에서 희석 하는 주 항 체의 50 µ L 추가 (항 체 자세한 표 1 참조)와 1 시간 동안 폐쇄 뚜껑 품 어.
- 200 µ L, TBS와 TBS와 부드러운 락으로 5 분 동안 다음 3 번 한 번 씻어.
- IB에 희석 이차 항 체의 50 µ L 추가 (항 체 정보는 표 2 참조) 1: 2000 DAPI 각, 뚜껑 사진 표백 방지 하기 위해 호 일 1 h. 커버 플레이트에 대 한 폐쇄 품 어.
- TBS, 함께 한 번 세척 그리고 TBS와 두 번 부드러운 락과 15 분 동안.
- 모든 TBS를 제거 하 고 thimerosal 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.
- 4 ° C, 영상까지 빛에서 보호에서 접시를 저장.
5. 영상 높은 처리량 현미경을 사용 하 여 세포
- 세포 유전자 특정 항 체와 fluorophore 스테인드 활용된 2 차 항 체 (면역 형광) 높은 콘텐츠 심사 현미경 제어 소프트웨어를 함께 사용 하 여 분석 합니다.
- 현미경 단계를 microwell 접시를 로드 합니다. 플레이트 수집 컨트롤에서 중간 범위 확대 (10 X 렌즈)에서 이미지를 선택 합니다. 이미지의 각, 한 셀을 두 개의 인접 한 필드에 표시 되지 않습니다 보장 하기 위해 각 사이트 사이 50 µ m 간격을 가진 센터에서 가져온 다는 것을 확인 하십시오.
- 웰 스의 이미지를 선택 합니다.
- 적절 한 채널 조합, 노출 시간 및 z-오프셋 매개 변수를 선택 합니다. 각 필터 (보충 표 2)의 자세한 내용은 표 3 을 참조 하십시오.
- (이미지는 자동으로 데이터베이스 서버에 저장 된) 수집 마법사를 사용 하 여 분석 결과 획득 합니다.
- 대체 채널 조합을 사용 하 여 오일 레드 오 (보충 표 3) 물 접시를 취득.
6. 획득된 한 이미지 분석
참고: 원격 데이터베이스 서버 수 있습니다 신속 하 고 쉽게 평가 이미지 획득 및 이미지 분석 소프트웨어의 사용을 액세스.
- 오픈 셀 득점 모듈 분석 소프트웨어에서.
- 세포 핵 크기에 대 한 사용자 정의 매개 변수 DAPI 채널 (핵 마커)와 관심의 세그먼트 핵 사용을 감지 하 고 신호 강도 배경 위에.
- FITC 채널을 사용 하 여 FABP4 신호를 감지 합니다. 각 이미지에 모든 FABP4 긍정적인 영역을 선택 하는 배경 위에 크기 및 신호 강도 대 한 사용자 정의 매개 변수를 가진 차별화 된 셀 세그먼트.
- 오일 레드 오 물 접시를 분석 하기 위해 분석 소프트웨어에 Transfluor 모듈
- 크기와 기름 빨간 O 스테인드 지역 '구 덩이'로 강도 지정 합니다.
Representative Results
이 연구는 adipogenic 차별화의 잠재력 ASCs 3 다른 방법으로 측정 되었다. 이 표시의 세포질을 지 방화 했다 FABP4의 immunofluorescent 라벨 세포, 분화 그리고 DAPI 이라는 핵 (그림 1A)와 겹쳐 있는 라벨. 자동된 이미지 분석 공개 늦은 통로 세포 (그림 1B)의 6.9 배 증가에 비해 초기 통로 세포에 차별화 된 그룹에서 FABP4 긍정적인 세포의 %에서 24.6 배 증가 했다. 뚱뚱한 작은 물방울의 차별화 된 셀, cytosol에 걸쳐 분산에 지역화는 기름 빨간 O 얼룩 그리고 DAPI 이라는 핵;와 거의 겹쳐는 라벨 그러나 시력 검사에서 초기 통로 세포 (그림 2A)에 비해 늦은 통로 세포에 있는 뚱뚱한 작은 물방울을 기름 빨간 O와 관련 된 적은 세포 핵이 있다. 자동된 이미지 분석 공개 기름 빨간 O 셀 초기 통로 세포에 및 늦게 통과 셀 (그림 2B)에 셀 당 지역 얼룩에 53.9 배 증가 당 얼룩의 영역에서 11.1 배 증가 했다. 두 얼룩의 이미징 수행한, 그리고 (그림 1의 보충, 보충 표 2-5) 소프트웨어에 셀 점수 (FABP4) 또는 Transfluor (기름 빨간 O) 모듈을 사용 하 여 계량. FABP4 식의 upregulation는 서쪽 오 점 분석 (그림 3, 보충 그림 5)에 의해 확인 됐다. 모든 3 분석 방법 초기 통로 ASCs 늦은 통로 세포 보다 잠재적인 더 높은 adipogenic 차별화는 밝혔다. Adipogenic 차별화는 잘 (보충 그림 2, 3) 당 총 세포 수에 영향을 미치지 않았다. 그러나, FABP4-긍정적인 분화 세포의 핵 크기는 늦게 통과 ASCs만에 대 한 제어 셀 보다 훨씬 작습니다 (보충 그림 3).
셀 문화, 확장 또는 passaged, adipogenic 분화 감소, 이전 게시 된 데이터11일치의 문화 내의 셀의 비율으로 증명 하는. 그것은 나이, 몸 대량 색인 또는 이전 병력12 같은 요인 수 하지 수이 연구에 대 한 제어 및 가능성이 다른 기증자 샘플 (보충 표 1) 사이 관찰 하는 다양성에 기여 해야 합니다.
그림 1 : FABP4 immunolabelling 초기 통로 세포 나중 통로 셀 보다 큰 차별화 가능성을 있음을 보여준다. A) 대표 이미지 초기와 후반 통로, 제어 및 DAPI (핵 얼룩)와 FABP4 이라는 차별화 된 셀 병합 및 분할 이미지와 함께 표시 됩니다. 이미지 표시 세분화 녹색 오버레이 셀과 빨간색 오버레이 미 분화 세포 분화. 그러나 셀을 표현 FABP4 B)는 크게 증가 adipogenic 분화 초기와 후반 통로 세포에 관찰 했다, 초기 통로 셀 늦게 통과 셀 (맨 휘트니 보다 차별화에 상당히 큰 증가 설명 하는, 테스트 * P를 나타냅니다 < 0.05와 * * * P를 나타냅니다 < 0.001). 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10, n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 초기 통로 세포 나중 통로 셀 보다 큰 차별화 가능성을 있음을 보여준다 기름 빨간 O 얼룩. A) DAPI (핵 얼룩) 및 기름 빨간 O (회색, 지질 작은 물방울 얼룩)의 대표 이미지 병합 및 분할 이미지와 함께 표시 됩니다. 분할 이미지 묘사 녹색 오버레이 모든 핵 및 기름 빨간 O 스테인드 빨간색 오버레이 지질 방울. B) 기름 빨간 O 얼룩 지역에서 크게 증가 adipogenic 차별화로 관찰 되었다. 초기 통로 셀 늦은 통로 세포에 비해 세포 당 기름 빨간 O 얼룩의 더 중대 한 지역으로 나타났다. 기름 빨간 O 셀 (μ m2) 당 얼룩의 지역 사용 adipogenic 감 별 법 잠재력의 측정으로 여기. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10; n = 4) 기증자 샘플, ± SEM (맨 휘트니 테스트 * P를 나타냅니다 = < 0.05와 * * * P는 = < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : FABP4 단백질 식 수준 차별화 일찍 하 고 늦게 통과 ASCs의 서쪽 오 점 분석. 총 단백질 로딩 제어, 베타 걸 (ACTB), 이른 대목에서 고 분화 낮은 정도 늦게 통로에 FABP4 immunolabelling는 크게 증가 했다의 비율으로 FABP4 밴드의 광학 밀도의 반 정량 분석 셀입니다. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10; n = 4) 기증자 샘플, ± SEM (맨 휘트니 테스트 * P를 나타냅니다 = < 0.05와 * * * P는 = < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 대상 항 원 | Isotype (복제) | 종 | 희석 |
| FABP4 | Polyclonal | 토끼 | 1: 100 |
표 1: 1 차적인 항 체
| 항 체를 대상으로 | Fluorophore 레이블 | 종 | 희석 |
| 토끼 IgG | 알 렉 사 플 루 오로 488 | 염소 | 1: 200 |
표 2: 이차 항 체
보충 그림 1: 이미지 분석 가상 환경의 개요. 얼룩진된 셀 편견의 모든 소스를 피하기 위해 자동화, 높은 처리량 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데 있었다. 이미지는 ImageXpress 마이크로 XLS를 사용 하 여 인수, MDCStore 데이터 관리자 데이터베이스에 직접 저장 및 사용자 최적화 하 고 그들의 특정 분석 매개 변수 테스트를 사용 하 여 가상 데스크톱 연결을 통해 볼 수 있도록 공개 했다. 이미지는 여러 다른 사용자가 자동 실행 큐에 '작업'을 보낼 수 있는 전용된 '자동 실행' 인스턴스를 함께 분석 했다. 사용자는 그들의 '작업이 완료 되 면 가상 인스턴스를 통해 데이터를 검색할 수 있습니다. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: 총의 비교 제어의 당 수를 세포 및 분화 초기와 후반 통로 ASCs, FABP4 접시 스테인드를 사용 하 여에 대 한 웰 스. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10, n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. 제어 및 초기와 후반 통과 ASCs 위해 차별화 된 셀 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 늦은 통로 세포에 비해 초기 통로 세포에 대 한 잘 당 더 많은 셀을 확인 하 고 있었다. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3: 총의 비교 제어의 당 수를 세포 및 분화 초기와 후반 통로 ASCs, 기름 빨간 O 묻은 접시를 사용 하 여에 대 한 웰 스. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10, n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. 제어 및 초기와 후반 통과 ASCs 위해 차별화 된 셀 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 4: 나중 구절에서 FABP4 긍정적인 했다 차별화 된 셀 컨트롤 스에서 세포 보다 훨씬 작은 핵 영역을 했다. 초기 통로에 제어 및 차별화 된 셀 사이의 핵 영역에서 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10; n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. (홀된 t 테스트 * * * P는 = < 0.001). 평균 ± SEM 표시 됩니다.) 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 5: 이미지의 서쪽 오 점 젤. 빨강 채널 베타 걸 보여준다. 녹색 채널 묘사 FABP4 immunolabelling. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 1: 기증자의 Clinicopathological 정보 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 2: 이미징 설정 (FABP4) 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 3: 이미징 설정 (기름 빨간 O) 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 4: 분석 매개 변수 사용 (FABP4)의 테이블. 셀 점수 모듈입니다. 이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 5: 테이블 분석 매개 변수 사용 (기름 빨간 O). 트랜스 형 석 모듈입니다. 이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 문서는 유틸리티와 정확 하 게 감지 하 고 계량 성숙한 adipocytes mesenchymal stromal 세포에서 파생 된 FABP4 immunolabelling의 장점을 보여 줍니다. FABP4 염료 고분자는 레이블이 변경13,14 사용 하는 계보 특정 단백질3,4,5 다른 일반적으로 반대로 성숙 adipocytes의 표현에 변화를 감지할 수 있다 기름 빨간 O15, 나 일 레드16 , 수단 블랙17등. FABP4 immunolabelling의 세포질 형태학 변화 분석과 시각화 수 있습니다. 이것은 양이 많은 반전 녹음 방송 모든 시각화5,18,19 없이 대 본 수준에서 변경 내용을 분석 하는 PCR (RT-정량)를 사용 하 여 앞에서 설명한 방법에 독특한 이점을 ,20또는 정지20일 또는 하 더럽혀 서 세포를 필요로 하는 cytometry 필요 단백질19,20을 lysed 세포. FABP4 immunolabelling 안정 된 고정 셀에서, 솔루션에서 밖으로 누출 되지 않습니다 이며 쉽게 시각화에 대 한 허용 하 고 자동화 된 분석에서 정확도 추가 핵 겹칠 것입니다 cytosolic 단백질 때 세포의 부착 단층에서 분류 되 고.
이 콘텐츠 심사 빨리, 정확 하 고, 재현 고 객관적 이기 때문에 유리 하다. 이미지 수집 및 분석 최소한의 수동 조작이 필요로 악기의 자동 처리에 의존 하 고 이후 그것은 시 약 및 연구원 시간, 비용 효율적인 사용을 위한 한 플랫폼을 제공 합니다. 이 콘텐츠 심사의 재현성 분석 실험31와 여러 가지 요인 정확성에 중요 한 발견 했다. 항 원 식의 정량화는 이미지 품질에 의존합니다. 성공적인 이미지 분석에 대 한 이미지 잘 당 각 채널에서 고 해야 합니다 초점에 회색 값에 대 한 최적의 동적 범위 내에서을 (자동 노출 설정을 이상적입니다). 초점 또는 잘못 된 결과를 포화 이미지 리드 아웃.
이 문서에서 설명 하는 방법의 몇 가지 잠재적인 한계는 다음과 같다. 전문된 이미징 장비 및 분석 소프트웨어에 대 한 요구 사항. 이 문서의 범위 밖에 다른 오픈 소스 소프트웨어 옵션 (예: ImageJ32,33, 피지34, CellProfiler32,35) 비슷한 이미지 세분화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 작업; 그러나 그들은 다운로드 하 고 온라인 사용할 수 매크로 맞게 하거나 매크로/명령 그들의 특정 분석 파이프라인에 대 한 작성 능력 필요지 않습니다. 모든 자동된 이미징 분석 파이프라인에 배경 잡음의 수준이 이다. 이 크게 파편, 표시 될 수 있습니다 주의 샘플 준비와 이미징 및 분석 플랫폼의 주의 설정에 대 한 필요성을 강조 하 고 불 쌍 한 이미지 품질 또는 분석 오류. 쥐에 FABP4 레이블 undifferentiated 창시자30; 감지 발견 되었습니다. (어떤 미 분화 세포의 구성) 본이 연구에서는 컨트롤 특정 FABP4 얼룩이 없는 동안. 이 아래 점수 FABP4 식 검사의 필요성 undifferentiated 분석 결과 고용은 각 생물 학적 맥락에서 창시자.
순서는 FABP4 라벨 및 얼룩, 기름 빨간 O 생물학으로 관련 될 필요가 이미지 분석에서 출력 측정 사이의 비교를 그립니다. 따라서, 측정, '% 긍정적인 세포' FABP4를 위해 사용 되었다 그리고 '셀 당 얼룩의 영역' 기름 빨간 o.를 위해 사용 되었다 그것은 측정 '% 긍정적인 세포' 기름 빨간 o 이라는 지방 방울을 정확 하 게 주어진된 핵; 특성 수 없었기 때문에 우리의 연구에 셀을 표시 사용 되지 않았습니다. 지방 방울 셀 몸 전체 크기, 수 및 배포에서 상당히 다양 하 고 거의 핵과 겹쳐. 기름 빨간 O 가변성 얼룩 다른 조직 소스;에서 파생 된 세포 사이 존재 반면 긍정적인 세포 법안은 현재 연구에 대 한 적절 한 %, 또 다른 그룹 사용 하고있다 성공적으로 adipocytes 인간의 동맥 줄기 세포22 에서 파생 된 척도를 스팬을 하나의 큰 뚱뚱한 작은 물방울으로 나타나 기름 빨간 O 얼룩은 세포질 및 핵 및 활성화 데이터 % 긍정적인 세포로 제시를 겹쳐.
대조적으로, FABP4 immunolabelling의 형태학은 다른 조직 소스23,,2425의 범위에서 파생 하는 adipocytes에 일치. 차별화의 문화 내의 셀의 비율을 정할 수는 응용 프로그램의 수 있습니다. 성인 중간 엽 기질 세포 치료 사용의 다양 한 범위에 대 한 중요 한 약속을 잡으십시오. 임상 번역 생겨났다는 중요 한 문제는 환자26사이, 절연27,28, 사이트 간에 그리고 격리12 방법 사이의 이러한 세포의 기능에 내재 된 변동성 및 치료 용 세포 숫자12 의 확장. 그것은 표시 되었습니다 이전 부착 stromal 세포의 문화는 자주 다른 유형의 일부 세포 분화 및 일부 12,17 우리의 FABP4로 분석 결과 ASC 문화에 대 한 방법을 보여 줍니다. 이 같은 분석 실험, 농축 기술로 결합, 이질적인 문화 계보 관련 차별화의 능력 안에서 하위 인구를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 데이 FABP4 분석 결과 등 표준화, 정량 분석 결과 모든 변수, 그리고 시간과 사이 임상 치료 결과 평가 하는 잠재력 사이 비교에 대 한 간단한 방법을 제공 한다.
반자동 방식에서 FABP4의 정량화는 많은 경우에 기증자 및 샘플 객관성과 재현성 분석에서을 수 있습니다. 또한 라벨은 세포질, 그것은 잠재적으로 수 비만 연구에 상당한 중요성의 구별 증식 (증가 체형), 비 (체형 크기의 확대) 분석을 사용할 어디 비 뚱뚱한 개인21에 많은 장애에 강력 하 게 연관 됩니다. 비만 약물 제어 지질 저장의 식별에 대 한 관심의 상당한을 했다 있다. 이 FABP4 분석 결과 또한 지질 축적을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 화합물의 수천을 심사에 대 한 간단한 판독을 제공 한다.
Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 지방 조직 및 수집 하 고 연구 사용에 대 한 우리에 게이 리소스를 제공 하는 연구 전문가의 기증자에 게 감사. 우리는 자금 지원을 러간에 의해 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 videoing 및이 문서의 제출에 대 한 편집 비용 자금에 대 한 오클랜드 대학, 학부의 의료 및 건강 과학 성능 기반 연구 기금 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
