Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering og kvantifisering av Mesenchymal celle Adipogenic differensiering potensial med en slektslinje spesifikk markør

Published: March 31, 2018 doi: 10.3791/57153
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 4,5, 1, 1,6, 1,7
1School of Biological Sciences, The University of Auckland, 2Research School of Biology, The Australian National University, 3Auckland Cancer Society Research Centre, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 4Department of Plastic Surgery, Counties Manukau District Health Board, 5Department of Surgery, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 6Biomedical Imaging Research Unit, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 7Maurice Wilkins Centre, The University of Auckland

Summary

Tradisjonelle metoder for å vurdere adipogenic differensiering er billig og enkel å bruke, men er ikke spesifikke for endringer i genuttrykk. Vi har utviklet en analysen for å kvantifisere mesenchymal celledifferensiering i eldre adipocytter med en slektslinje spesifikk markør. Denne analysen har forskjellige programmer over grunnleggende forskning og klinisk medisin.

Abstract

Flere fargestoffer er tilgjengelige for bruk i å oppdage differensiering av mesenchymal celler i adipocytter. Fargestoffer, som olje Red O, er billig, lett å bruke og vidt utnyttet av laboratorier analysere adipogenic potensialet av mesenchymal celler. Men er de ikke spesifikke for endringer i genet transkripsjon. Vi har utviklet en gen-spesifikke differensiering analysen analysere når en mesenchymal celle har byttet sitt skjebnen til en adipogenic avstamning. Immuno-merking mot fettsyrer bindende protein-4 (FABP4), en slektslinje kundespesifikk markør for adipogenic differensiering, aktivert visualisering og kvantifisering av differensierte celler. Evne å kvantifisere adipogenic differensiering potensialet i mesenchymal celler i 96 godt microplate format har lovende implikasjoner for en rekke applikasjoner. Hundrevis av kliniske studier innebærer bruk av voksen mesenchymal stromal celler og det er foreløpig vanskelig å korrelere terapeutiske resultater innenfor og spesielt mellom slike kliniske studier. Denne enkle høy gjennomstrømming FABP4 analysen gir en kvantitativ analyse for å vurdere differensiering potensialet i pasient-avledet celler og er et kraftig verktøy for å sammenligne ulike isolasjon og utvidelse metoder. Dette er spesielt viktig gitt den økende erkjennelsen av heterogenitet cellene blir administrert til pasienter i mesenchymal celler. Analysen har også potensielle verktøyet i høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening, spesielt i fedme og pre-diabetes.

Introduction

En av de viktigste kravene av det internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi (ISCT) til å definere en multipotent mesenchymal stromal celle er at cellene må ha evnen til å differensiere i adipogenic, osteogenic og chondrogenic linjene 1. konvensjonelle metoder for måling differensiering inn disse tre linjene er avhengige av gjenkjenning av macromolecular produkter med kjemiske fargestoffer1. Fargestoffer som olje Red O (som flekker fett dråper i celler som har gjennomgått adipogenesis), er billig og lett å bruk; men de ikke klarer å oppdage de bestemte endringene i genuttrykk som oppstår når mesenchymal cellene skille i hver respektive lineage2. Her har vi utviklet en differensiering analysen som quantifies protein uttrykk for en adipogenic avstamning-spesifikk markør, fettsyrer bindende protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 ble først funnet i murine 3T3-L1 adipocytter3 og ble senere oppdaget å bli uttrykt i menneskelig subkutan fettvev6. Det er en cytosolic proteiner, som fungerer som en Anstandsdame lede fettsyrer opptak ved celler og er involvert i prosessen med lipolyse4.

De forløper cellene brukes for differensiering analyser var adipose avledede mesenchymal stromal celler (ASCs)7,8. ASCs deler mange egenskaper med Ben margtransplantasjon-avledet stamceller (BM-MSCs), en stor mesenchymal stamceller befolkning i voksne8,9. ASCs tilbyr flere fordeler sammenlignet med BM-MSCs i en klinisk anvendelse, som større avkastning celler som kan isoleres fra lettere tilgjengelig vev kilder8,9. En isolert celle befolkningen må oppfyller visse kriterier skal defineres som ASCs. Først må de vise tilslutning til plast vev kultur fartøy i standard kultur forhold1. De må også vise spesifikke overflate antigen uttrykk1. Uncultured ASCs er preget av positiv overflate antigen uttrykk for CD34, CD73, CD90, lav uttrykk for CD105 og negativ uttrykk CD45 og HLA-DR10. ASCs renset ved dyrking på plast i 28 dager (tilhenger renset ASCs) viser positive uttrykk for CD73, CD90 og CD105 og negativ uttrykk for CD34 og CD45 HLA-DR10. Til slutt, cellene må beholde evnen til å differensiere i ulike linjene1,7,8.

Adipogenic differensiering protokoller indusere slående oppregulering av FABP4 uttrykk blant andre adipocyte avstamning gener, så vi brukt immunochemistry for å visualisere FABP4 protein i celler, og deretter kvantifisert FABP4 uttrykk på enkeltcelle nivå bruker en automatisert fluorescerende høyt innhold screening mikroskop. Denne metoden er fordelaktig over tradisjonell fargestoffer som gjør at svært spesifikke bekreftelse på adipocyte-lineage differensiering. Slike genet bestemt avstamning analyser kombinert med høyt innhold screening metoder også aktivere kvantifisering av andelen av celler innenfor en heterogen celle forberedelse som kan differensiering ned en bestemt avstamning. I våre studier brukte vi FABP4 analysen for å bekrefte tap av adipogenic differensiering potensialet i fersk isolert ASCs etter cellekultur.

Protocol

1. forbereder ASCs differensiering analyser

  1. Forberede vev kultur reagenser og håndtere levende celler i sterilt vev kultur hette.
  2. Forberede A0 medium: Dulbecco endret Eagle Medium og Ham F12 Medium (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x penicillin/streptomycin.
  3. Forberede komplett ASC medium: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penicillin/streptomycin, 10% fosterets bovin serum.
  4. Bruk tilhenger renset ASCs, i en MT75 kultur kolbe. Bekreft renheten av ASCs med sortering (FACS)10fluorescens-aktivert-cellen.
  5. Koble celler ved å fjerne alle medium fra MT75 kultur kolbe og legge 2 mL av cellen dissosiasjon enzym.
  6. La kultur kolbe i inkubator (37 ° C, fuktet, 5% CO2) i 5-10 min. Ta kultur kolbe ut av inkubatoren og fast trykker på siden av kolbe. Sjekk hvis cellene har løsrevet fra kultur flasken med en invertert mikroskop.
  7. Legge til 13 mL A0 medium i en MT75 kultur kolbe.
  8. Overføring 15 mL til en 15 mL sentrifuge rør og sentrifuge 400 x g for 5 min.
  9. Forkast nedbryting og å suspendere celle pellet i 1 mL av komplett ASC medium.
  10. Utføre en celletall bruker hemocytometer.
  11. Fortynne celle suspensjon å en konsentrasjon av 25.000 celler mL-1 komplett ASC medium.
  12. Legge til 200 µL av A0 medium alle periferi brønner av 96 godt plate (flat bunn). Dette reduserer Fordampningshastighet av brønnene som inneholder cellene i midten.
  13. Overføre 200 µL av cellen suspensjon til en microwell plate for å oppnå en siste celle tetthet 5 x 103 celler per brønn. Fire brønner er nødvendig for hver behandlingsgruppe (tre eksemplarer tekniske gjentar og en ingen primære antistoff kontroll for immunocytochemistry (ICC)).
  14. La microwell plate i inkubator (37 ° C, fuktet, 5% CO2) til cellene nå samløpet (3-4 dager).

2. inducing differensiering av ASCs

  1. Klargjør adipogenic differensiering medium ved supplere komplett ASC medium med 1 µM dexamethasome, 10 µM insulin og 200 µM indomethacin. Komplett differensiering mediet er stabilt på 4 ° C for en måned, så bare gjør som kreves for 1 analysen. Butikken på 4 ° C og varme en aliquot 37 ° c i vannbad.
  2. Etter 3-4 dager, ta microwell plate ut av inkubatoren og erstatte halvparten av kultur medium med adipogenic differensiering medium.
  3. Utføre en medium endring hver 2-3 dager.
    Merk: Optimal adipogenic differensiering krever 14 dager kultur i differensiering medium. Differensierte celler analyseres ved hjelp av tradisjonelle fargestoff basert flekker og gen-spesifikke flekker.

3. farging differensiering - tradisjonelle fargestoff basert flekker

  1. Forberede 4% formaldehyd løsning ved å fortynne 16% formaldehyd med PBS. Fortynne bare beløpet som trengs for eksperimentet og store tett forseglet i en sentrifuge rør.
    FORSIKTIG: Formaldehyd er et potensielt karsinogen og kan forårsake irritasjon i nese, hals og lungene ved innånding. Utfør alle prosedyrer for formaldehyd i avtrekksvifte.
  2. Klargjør olje Red O lagerløsning ved oppløsning 300 mg i 100 mL isopropanol.
  3. Ta microwell plate av inkubator. Følgende trinn kan utføres i et ikke-sterilt miljø.
  4. Fjern alle medium fra brønner og fikse celler med 4% formaldehyd i 30 min.
  5. Inkubasjon samtidig forberede olje Red O fungerende løsning. Fungerende løsning består av 6 deler olje Red O lager med 4 deler destillert vann (dH2O). Bland godt og la sitte i romtemperatur i 20 minutter, før filtrering bruker 0,2 µm filter enhet. Working løsning er bare stabil for 2T.
  6. Fjern alle formaldehyd fra brønner ved pipettering.
  7. Vask celler når med 60% isopropanol og la brønnene tørke helt før du fortsetter.
  8. Legg til 50 µL av olje Red O fungerende løsning i hver brønn og ruge ved romtemperatur for 10 min.
  9. Fjerne olje Red O løsning og umiddelbart legge dH2O. Wash med dH2O 4 ganger før visning under lys mikroskop.

4. farging for differensiering - genet spesifikke antistoffer

  1. Klargjør lagerløsning Tris bufret saltoppløsning (SS) ved oppløsning 80 g NaCl, 2 g av KCl og 30 g Tris base til 1 L av dH2O (pH 8). Klargjør fungerende løsning ved å fortynne 1:10 bruker dH2O. butikken ved romtemperatur.
  2. Forberede immunobuffer (IB) (1% fosterets bovin serum (FBS) i TBS). Etiketten 15 mL sentrifuge røret med dato og lagre på 4 ° C. IB kan brukes i 1 uke fra dato laget.
  3. Klargjør 0,25% kasein blokkering ved oppløsning 0,5 g av casein og 0,195 g Natriumazid i 200 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS). Løse ingrediensene av rør over natten. Aliquot 15 mL sentrifuge rør og oppbevar i en 20 ° C fryseren. Tinte kasein løsninger kan holdes på 4 ° C for 1 måned.
  4. Klargjør DAPI løsning ved å fortynne lager DAPI 1:200 i TBS. butikken ved 4 ° C, beskyttet mot lyset.
  5. Klargjør lager thimerosal løsning (10 mg mL-1) ved oppløsning thimerosal i sterilt PBS. Lagre på 4 ° C og fortynne passende mengder til 0,4 mg mL-1 for bruk.
  6. Fastsette og permeabilize celler med iskald metanol (96 godt plate) for 5 min. vask cellene gang med 200 µL av TBS.
  7. Blokkere med 50 µL av 0,25% casein ved romtemperatur for 10 min og vaskes en gang med TBSen.
  8. Legge til 50 µL av primære antistoffer fortynnet i IB (se tabell 1 for antistoff detaljer) og Inkuber med lokk lukket 1t.
  9. Vask en gang med 200 µL av SS, og deretter 3 ganger med TBS i 5 min med milde rocking.
  10. Legge til 50 µL av sekundær antistoffer fortynnet i IB (se tabell 2 for antistoff detaljer) med 1:2000 DAPI i hver, ruge med lokk lukket for 1 h. Cover plate med folie å hindre Foto-bleking.
  11. Vask en gang med SS, og deretter to ganger med TBS i 15 min med milde rocking.
  12. Fjern alle TBS og legge 200 µL av thimerosal løsning.
  13. Lagre platen på 4 ° C, beskyttet fra lys til bildebehandling.

5. imaging celler med høy gjennomstrømming mikroskop

  1. Analysere celler beiset med gene spesifikke antistoffer og fluorophore konjugert sekundære antistoffer (immunofluorescence) bruker en høy innhold screening mikroskop kontrollert med medfølgende programvare.
  2. Legg microwell platen i mikroskopet scenen. På plate oppkjøpet kontrollen, velger du bilde på medium rekkevidde forstørrelse (10 X linsen). Kontroller at bildene er Hentet fra midten av hver brønn, med 50 µm mellomrom mellom hvert område slik at en celle ikke vises i to tilstøtende felt.
  3. Velg brønnene å image.
  4. Velg den aktuelle kanalen kombinasjoner, eksponeringstid og z-forskyvningen parametere. Se tabell 3 for mer detaljert informasjon om hver filtre (supplerende tabell 2).
  5. Få analysen ved hjelp av veiviseren oppkjøp (bildene lagres automatisk Database Server).
  6. Bruke alternative kanal kombinasjoner for å kjøpe plater med olje Red O. (supplerende tabell 3).

6. analysere ervervet bilde

Merk: Ekstern tilgang til database server gir rask og enkel evaluering av bildene ervervet og bruk av bildet analyseprogramvare.

  1. Åpne cellen Scoring modul på analyseprogramvare.
  2. Merker cellen kjerner bruker DAPI kanal (kjernefysisk markør) og segmentet kjerner rundt med brukerdefinerte parametere for størrelse og signalisere intensitet over bakgrunnen.
  3. Finne FABP4 signal bruker FITC kanal. Segmentere differensierte celler med brukerdefinerte parametere for størrelse og signal intensitet over bakgrunnen å velge alle FABP4 positive regioner i hvert bilde.
  4. Åpne Transfluor modul på analyseprogramvare å analysere plater med olje Red O.
  5. Angi størrelse og intensitet av olje Red O farget regioner som "gropene".

Representative Results

I denne studien adipogenic differensiering potensialet i ASCs 3 forskjellige metoder ble målt. Immunofluorescent merking av FABP4, viste at denne markøren lokalisert til cytoplasma av differensierte celler og merking overlappet DAPI-merket kjerner (figur 1A). Automatiserte image analyse viste en 24,6 fold økning i % FABP4 positive celler i gruppen differensiert i tidlig passering celler sammenlignet med 6,9 fold økning i slutten passasje celler (figur 1B). Olje Red O flekker var lokalisert til fett dråper spredt over hele stoffer av differensierte celler og merking sjelden overlappet DAPI-merket kjerner; men fra visuell inspeksjon, det er færre celle kjerner forbundet med olje Red O fett dråper i slutten passasje cellene sammenlignet med tidlig passering celler (figur 2A). Automatiserte image analyse viste en 11,1 fold økning i området av olje Red O flekker per celle i tidlig passering celler og en 53.9 fold økning i flekker området per celle i slutten passasje celler (figur 2B). Bildebehandling av både flekker ble utført, og deretter kvantifisert med cellen Scoring (FABP4) eller Transfluor (olje Red O) modul i programvaren (supplerende figur 1, utfyllende tabell 2-5). Oppregulering av FABP4 uttrykk ble bekreftet av Western blot analyse (Figur 3, utfyllende figur 5). Alle 3 analyseteknologi avslørte at tidlig passering ASCs har høyere adipogenic differensiering potensielle enn slutten passasje celler. Adipogenic differensiering påvirke ikke totale celle nummer per brønn (supplerende figur 2, 3). Kjerner størrelsen på FABP4-positive differensiert cellene var imidlertid betydelig mindre enn kontroll celler for sent passasje ASCs bare (supplerende figur 3).

Vi viste at celler ble utvidet i kultur, eller passaged, prosentandelen av celler i kulturen i stand til å adipogenic differensiering redusert, konsekvent med tidligere publiserte data11. Det er viktig å merke seg at faktorer som alder, kroppsmasseindeks eller tidligere medisinsk historie12 ikke kan kontrolleres i denne studien og trolig bidratt til variasjon observert mellom forskjellige donor eksempler (supplerende tabell 1).

Figure 1
Figur 1 : FABP4 immunolabelling viser at tidlig passering cellene har større differensiering potensielle enn senere passasje celler. A) representant bilder tidlig og sent passasje, kontroll og differensierte celler merket med DAPI (kjernefysisk flekken) og FABP4 vises sammen med flette og segmentering bilder. Segmentering bildene viser differensierte celler med en grønn overlegg og udifferensierte celler med en rød overlegg. B) en betydelig økning i FABP4 uttrykker celler ble observert med adipogenic differensiering i tidlig og sent passasje celler, tidlig passering celler viste imidlertid betydelig større økning i differensiering enn slutten passasje celler (Mann Whitney teste * angir P < 0,05 og *** betyr P < 0,001). Dataene er gjennomsnittlig over tidlig passering (p4, n = 8) eller sent passasje (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Olje Red O flekker viser at tidlig passering cellene har større differensiering potensielle enn senere passasje celler. A) representant bilder av DAPI (kjernefysisk flekken) og olje Red O (grå, lipid slippverktøy flekken) vises sammen med flette og segmentering bilder. Segmentering stikkene viser alle kjerner med grønne overlegg og olje Red O farget lipid dråper med en rød overlegg. B) en betydelig økning i olje Red O flekker området ble observert med adipogenic differensiering. Tidlig passering celler viste større område av olje Red O flekken per celle sammenlignet sent passasje celler. Området for olje Red O flekker per celle (μm2) brukes her som et mål på adipogenic differensiering potensielle. Dataene er gjennomsnittlig over tidlig passering (p4; n = 8) eller sent passasje (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM (Mann Whitney test * angir P = < 0,05 og *** betyr P = < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Western blot analyse av FABP4 protein uttrykk nivå av differensiert tidlig og sent passasje ASCs. Semi kvantitativ analyse av optisk densitet FABP4 band som et forhold mellom totalt protein lasting kontroll, beta utgangen (ACTB), viste at FABP4 immunolabelling var betydelig økt i tidlig passering og en mindre grad sent passasje differensiert celler. Dataene er gjennomsnittlig over tidlig passering (p4; n = 8) eller sent passasje (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM (Mann Whitney test * angir P = < 0,05 og *** betyr P = < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Målet antigen Isotype (klone) Arter Fortynning
FABP4 Polyklonale Kanin 1: 100

Tabell 1: Primære antistoff

Målretting antistoff Fluorophore etikett Arter Fortynning
Kanin IgG Alexa fluoro 488 Geit 1:200

Tabell 2: Sekundær antistoff

Supplerende figur 1: oversikt over bildet analyse virtuelle miljøet. Fargede celler ble fotografert med en automatisert, høy gjennomstrømming fluorescerende mikroskop for å unngå noen kilde til skjevhet. Anskaffes ved hjelp av ImageXpress Micro XLS ble, lagret direkte i MDCStore Data Manager-databasen og gjøres tilgjengelig for visning på virtuelle skrivebord, som brukerne benytter til å optimalisere og teste deres spesifikke analyseparametrene. Bildene ble analysert med en dedikert "Autokjør" forekomst som gir flere forskjellige brukere sende 'jobber' til bilen køen. Brukerne kan hente data via den virtuelle forekomsten når jobben"er fullført. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 2: sammenligning av totalt celle teller per brønn kontroll og differensiert brønner for tidlige og sene passasje ASCs, bruker FABP4 farget plate. Dataene er gjennomsnittlig over tidlig passering (p4, n = 8) eller sent passasje (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom kontrollen og differensierte celler for både tidlig og sent passasje ASCs. Det var flere celler per brønn for tidlig passering celler sammenlignet sent passasje celler. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 3: sammenligning av totalt celle teller per brønn kontroll og differensiert brønner for tidlige og sene passasje ASCs, bruker olje Red O farget plate. Dataene er gjennomsnittlig over tidlig passering (p4, n = 8) eller sent passasje (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom kontrollen og differensierte celler for både tidlig og sent passasje ASCs. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 4: senere passasjer, differensierte celler som var FABP4 positive hadde betydelig mindre kjerner området enn celler i kontroll brønner. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i kjerner området mellom kontrollen og differensierte celler i tidlige passasje. Dataene er gjennomsnittlig over tidlig passering (p4, n = 8) eller sent passasje (p10; n = 4) donor prøver, ± SEM. (kort t test. *** angir P = < 0,001). Gjennomsnittlig ± SEM vises.) Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 5: bilder av Western blot gels. Røde kanalen viser beta-utgangen. Grønne kanalen viser FABP4 immunolabelling. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende tabell 1: Clinicopathological informasjon givere Klikk her for å laste ned denne tabell.

Supplerende tabell 2: Imaging innstillinger (FABP4) Klikk her for å laste ned denne tabell.

Supplerende tabell 3: Imaging innstillinger (olje Red O) Klikk her for å laste ned denne tabell.

Supplerende tabell 4: tabell med analyse parametere brukt (FABP4). Cellen Scoring modul. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Supplerende tabell 5: tabell med analyse parametere brukt (olje Red O). Trans Fluor modul. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Discussion

Dette dokumentet demonstrerer av og fordelene med FABP4 immunolabelling å nøyaktig oppdage og kvantifisere moden adipocytter avledet fra mesenchymal stromal celler. FABP4 er kjøpedyktig merker endringer i uttrykk for en slektslinje bestemt protein3,4,5 i eldre adipocytter, i motsetning til andre ofte brukte fargestoffer som etiketten macromolecular endres13,14 som olje Red O15, Nilen Red16 og Sudan svart17. FABP4 immunolabelling gir visualisering og analyse av endringer i mobilnettet morfologi. Dette er en særegen fordel over beskrevet tidligere metoder ved hjelp av kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) som analyserer endringer på transkripsjon nivå uten noen visualisering5,18,19 ,20eller flowcytometri som krever celler i suspensjon20eller Western blotting som krever cellene være lysed for å isolere protein19,20. FABP4 immunolabelling er stabilt i fast celler, lekke ikke ut i løsningen og blir en cytosolic proteiner når merket i en tilhenger monolayer av celler, overlapper med kjernen tillater enkel visualisering og lagt til nøyaktighet i automatisk analyse.

Høyt innhold screening er en fordel fordi det er rask, nøyaktig, reproduserbare og objektiv. Det gir en plattform for kostnadseffektiv bruk reagenser og forsker, siden bildeopptak og analyse krever minimal manuell manipulasjon og stole på den automatiske behandlingen av instrumentet. Flere faktorer ble identifisert som kritisk nøyaktigheten og reproduserbarhet av høyt innhold screening søk31. Kvantifisering av antigen uttrykk er avhengig av bildekvalitet. For vellykket bildeanalyser, bilder fra hver kanal per brønn må være i fokus og innenfor en optimal dynamikkområdet grå verdier (automatisk vise innstillinger er ideell). Ut av fokus eller mettede bilder føre til feilaktige resultater.

Noen potensielle begrensninger av metodene i denne artikkelen omfatter følgende: Behovet for spesialisert tenkelig utstyr og analyse. Mens du er utenfor omfanget av denne artikkelen, kan alternativ åpen kildekode programvarealternativer (for eksempel ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) brukes til å utføre lignende bildesegmentering oppgaver. men de krever kompetanse til å enten laste ned og skreddersy makroer tilgjengelig online eller skrive makroer/kommandoer for deres spesifikke analyse rørledninger. Iboende til alle automatisert tenkelig analyse rørledninger er et nivå av bakgrunnsstøy. Dette kan i stor grad tilskrives rusk, dårlig bilde kvalitet eller analyse feil, understreker behovet for forsiktig utvalg forberedelse og forsiktig oppsett av bildebehandling og analyse plattform. FABP4 etiketten i mus har blitt funnet for å oppdage udifferensierte progenitors30; mens kontrollene i denne studien (som består av udifferensierte celler) er blottet for bestemte FABP4 flekker. Dette under score nødvendigheten av å sjekke FABP4 uttrykk i udifferensierte progenitors i hver biologisk sammenheng der analysen er ansatt.

For å trekke gyldig sammenligninger mellom FABP4 merking og olje Red O flekker, belastningsstyring fra bildeanalyser måtte være biologisk relevant. Følgelig måling, '% positiv celler' ble brukt for FABP4 og 'området av flekker per celle' ble brukt olje Red O. Det er bemerkelsesverdig at tiltaket '% positiv celler' ikke ble brukt olje Red o merket celler i vår studie fordi det ikke var mulig å tillegge de merket fett dråpene nøyaktig til en gitt kjerne; de fett dråpene variert betydelig i størrelse, antall og distribusjon over celle kroppen og sjelden overlappet kjernen. Olje Red O flekker variasjon eksisterer mellom celler fra ulike vev kilder; mens % positiv celler mål ikke var riktig for denne studien, en annen gruppe har brukt det med hell for å kvantifisere adipocytter avledet fra menneskelige kjertel stamceller22 der den olje Red O flekker dukket opp som en stor feit slippverktøy som spredte den cytoplasma og overlappende med kjerner og aktivere data presenteres som % positiv celler.

Morfologi av FABP4 immunolabelling er derimot konsekvent i adipocytter fra en rekke ulike vev kilder23,24,25. Evne å kvantifisere andelen av celler innenfor en kultur kan differensiering har en rekke programmer. Voksen mesenchymal stromal celler holde store løftet for en rekke ulike terapeutisk bruk. Et betydelig problem som har oppstått med klinisk oversettelse er iboende variasjon i evnen til disse cellene mellom pasienter26mellom områder av isolasjon27,28og mellom metoder for isolasjon12 og utvidelse av celle tall12 for terapeutisk bruk. Det har vist tidligere at kulturer tilhenger stromal celler er ofte heterogene, med noen celler kan differensiering og noen ikke 12,17 som vår FABP4 analysen demonstrerer for ASC kulturer. Søk som dette, kombinert med berikelse teknikker, vil bidra til å identifisere Sub-populasjoner i ulike kulturer kan slektslinje kundespesifikk differensiering. Å ha en standardisert, målbare analysen som denne FABP4 analysen gir en enkel metode for sammenligning mellom alle disse variablene, og potensial til å evaluere terapeutiske resultater innenfor og mellom kliniske studier.

Kvantifisering av FABP4 på en semi-automatisert måte kan objektivitet og reproduserbarhet analyse over mange donor tilfeller og eksempler. Videre som etiketten er cytoplasmatiske, kan det potensielt bli brukt til å analysere hypertrophy (utvidelse av adipocyte størrelse) i tillegg til hyperplasia (økning i adipocyte tall), et skille som er av stor betydning i fedme forskning, der hypertrofi er sterkt assosiert med adipose dysfunksjon i overvektige personer21. Fedme-epidemien har ansporet betydelig interesse identifisere narkotika kan styre lipid lagring. Denne FABP4 analysen gir også en enkel avlesning for screening tusenvis av forbindelser for sin evne til å hemme lipid akkumulering.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for givere liggende under adipose vev og forskning fagfolk som samler inn og gir denne ressursen oss til forskningsbruk. Vi ønsker å erkjenne finansiering støtter Allergan. Vi er også takknemlige til Universitetet i Auckland, Fakultet for medisinsk og Health Sciences ytelse basert Research Fund for finansiering filmet og redigering for innlevering av denne artikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Base Invitrogen 15504-020 Tris buffered saline
Sodium Chloride Merck 1064041000 Tris buffered saline
Potassium Chloride Merck 1049360500 Tris buffered saline
Sodium Azide Scharlau SO0091 Casein blocker solution
Casein Sigma C7078-500G Casein blocker solution
PBS tablet Sigma P4417-100TAB Phosphate buffered saline
DMEM/F12 Gibco 11330-032 Cell culture
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122 Cell culture
Glutamax Gibco 35050-061 Cell culture
Fetal bovine serum Gibco 10091-148 Cell culture
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red Gibco 12563-029 Cell dissociation enzyme
96 well plate (flat bottom) Falcon FAL353072 Cell culture equipment
T75 culture flask, with filter cap Greiner 658175 Cell culture equipment
Insulin Sigma  19278-5ML Adipogenic differentiation media
dexamethasone Sigma D2915-100MG Adipogenic differentiation media
indomethacin sigma I7378-5G Adipogenic differentiation media
Oil-Red O Sigma O-0625 Classic stain for adipogenesis
Isopropanol Merck 1.09634 Classic stain for adipogenesis
16% formaldehyde Pierce 28908 Cell fixation
Acetone Merck 100983 Cell fixation
DAPI Sigma D9542 Immunocytochemistry
Anti rabbit IgG alexa 488 Molecular Probes A11008 Immunocytochemistry
Thimerosal Sigma T5125-10G Immunocytochemistry
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody Cayman Chemicals 10004944 Marker of adipogenesis
Centrifuge tubes (15mL) Greiner GR188271 General
Centrifuge tubes (50mL) Greiner GR227261-P General
ImageXpress Micro XLS Molecular Devices high content screening machine
MetaXpress Molecular Devices high content screening software, version 5.4.01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  2. Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
  3. Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
  4. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
  5. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
  6. Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
  7. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  8. Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  9. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
  10. Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
  11. Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
  12. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
  13. Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
  14. Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
  15. Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
  16. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  17. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
  18. Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
  19. Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
  20. Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  21. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  22. Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
  23. Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
  24. Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
  25. LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
  26. Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
  27. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  28. Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
  29. Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
  30. Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
  31. Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
  32. Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
  33. Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).

Tags

Biologi problemet 133 liggende under Adipose avledet stromal celler differensiering adipogenesis bildebehandling immunocytochemistry immunofluorescence kvantifisering høyt innhold screening
Visualisering og kvantifisering av Mesenchymal celle Adipogenic differensiering potensial med en slektslinje spesifikk markør
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eom, J., Feisst, V., Ranjard, L.,… More

Eom, J., Feisst, V., Ranjard, L., Loomes, K., Damani, T., Jackson-Patel, V., Locke, M., Sheppard, H., Narayan, P., Dunbar, P. R. Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker. J. Vis. Exp. (133), e57153, doi:10.3791/57153 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter