Summary
Traditionella metoder för att bedöma adipogena differentiering är billiga och lätt att använda, men är inte specifika för förändringar i genuttryck. Vi har utvecklat ett test för att kvantifiera mesenkymala celldifferentiering i mogen adipocyter använder en härstamning specifik markör. Denna analys har applikationsmöjligheter över grundforskning och klinisk medicin.
Abstract
Flera färgämnen är tillgängliga för användning i att upptäcka differentiering av mesenkymala celler in adipocyter. Färgämnen, såsom olja röd O, är billigt, lätt att använda och allmänt utnyttjad av laboratorier analysera adipogena potential av mesenkymala celler. Men är de inte specifika för förändrad transkription av gener. Vi har utvecklat en gen-specifika differentiering analysen att analysera när en mesenkymala cell gått sitt öde till en adipogena härstamning. Immuno-märkning mot fettsyra bindande protein-4 (FABP4), en härstamning-specifik markör för adipogena differentiering, möjliggjort visualisering och kvantifiering av differentierade celler. Möjligheten att kvantifiera adipogena differentiering potential mesenkymala celler i en 96 väl mikroplattan format har lovande konsekvenser för ett antal applikationer. Hundratals kliniska prövningar innebär användning av vuxna mesenkymala stromaceller och det är för närvarande svårt att korrelera terapeutiska resultat inom och särskilt mellan sådana kliniska prövningar. Denna enkla hög genomströmning FABP4 analys ger ett kvantitativt test för bedömning av differentiering potential patientderiverade celler och är en robust verktyg för att jämföra olika metoder för isolering och expansion. Detta är särskilt viktigt med tanke på det ökande erkännandet av heterogenitet cellerna som administreras till patienter av mesenkymala celler produkter. Analysen har också potentiella verktyg i hög genomströmning drogkontroll, särskilt i fetma och pre-diabetes forskning.
Introduction
En av de viktigaste kraven som fastställts av den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT) definiera en multipotenta mesenkymala stromaceller cell är att cellerna måste ha förmågan att skilja in i adipogena, Osteogena och chondrogenic härstamningar 1. konventionella metoder för att mäta differentiering in dessa tre utvecklingslinjerna lita på detektion av makromolekylära produkter använder kemiska färgämnen1. Färgämnen som olja röd O (som fläckar feta liten droppe i celler som har genomgått adipogenesis), är billig och lätt att använda; men de misslyckas med att identifiera de specifika förändringarna i genuttryck som uppstår när mesenkymala celler differentieras till varje respektive lineage2. Här har vi utvecklat en differentiering-analysen som kvantifierar proteinuttryck för en adipogena härstamning-specifik markör, fettsyra bindande protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 hittades ursprungligen i murina 3T3-L1 adipocyter3 och upptäcktes senare skall uttryckas i mänskliga subkutan fettvävnad6. Det är ett cytosoliskt protein, som fungerar som ett förkläde att vägleda fettupptaget av celler och är involverat i processen lipolys4.
Av prekursorceller som används för differentiering analyserna var fett härledda mesenkymala stromaceller (ASCs)7,8. ASCs delar många egenskaper med benmärg-derived mesenkymala stamceller (BM-msc), en större mesenkymala stamceller befolkning i vuxna8,9. ASCs erbjuder flera fördelar jämfört med BM-MSCs i en klinisk tillämpning, som större avkastning av celler kan isoleras från mer lättillgängliga vävnad källor8,9. En isolerad cell befolkning måste uppfylla vissa kriterier för att definieras som ASCs. De måste först Visa adherencen till plast vävnadsodling fartyg i standard kultur villkor1. De måste också visa specifika ytantigen uttryck1. Obildade ASCs karakteriseras av positiva ytantigen uttryck av CD34, CD73, CD90, lågt uttryck av CD105 och negativa uttryck för CD45 och HLA-DR10. ASCs renas genom odling på plast i 28 dagar (anhängare renat ASCs) visar positivt uttryck av CD73, CD90 och CD105 och negativa uttryck av CD34, CD45 och HLA-DR10. Slutligen måste celler kvar möjligheten att differentieras till olika härstamningar1,7,8.
Adipogena differentiering protokoll inducera slående uppreglering av FABP4 uttryck bland andra fettceller härstamning gener, så vi använde immunkemi för att visualisera FABP4 protein i cellerna, och sedan kvantifieras FABP4 uttryck på enstaka cellnivå använda en automatiserad fluorescerande hög-innehåll screening mikroskopet. Denna metod är en fördel över traditionella färgämnen som gör det möjligt för mycket specifik bekräftelse av fettceller-lineage differentiering. Sådana gen specifika härstamning analyser kombineras med hög halt screeningmetoder också möjliggöra kvantifiering av andelen celler inom en heterogen cell beredning som klarar av differentiering ner en viss härstamning. I våra studier använde vi FABP4 analysen för att bekräfta förlusten av adipogena differentiering potential av nymalen isolerade ASCs efter cellodling.
Protocol
1. förbereda ASCs för differentiering analyser
- Förbereda vävnadsodling reagenser och hantera levande celler i en steril vävnadsodling huva.
- Förbereda A0 medium: Dulbecco modifierade Eagle Medium och Hams F12 Medium (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x penicillin/streptomycin.
- Förbereda komplett ASC medium: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penicillin/streptomycin, 10% fetalt bovint serum.
- Användning anhängare renat ASCs, expanderade i en T75 kultur kolv. Kontrollera renheten av ASCs med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS)10.
- Lossa cellerna genom att avlägsna alla från T75 kultur kolven och lägga till 2 mL av cell dissociation enzym.
- Låt kultur kolven i inkubatorn (37 ° C, fuktad, 5% CO2) i 5-10 min. Ta kultur kolven ur inkubatorn och tryck fast på sidan av kolven. Kontrollera om cellerna har lossnat från kultur kolven med ett inverterat Mikroskop.
- Lägg till 13 mL A0 medium till en T75 kultur-kolv.
- Överföra 15 mL i en 15 mL centrifugrör och centrifugera vid 400 x g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och slamma cellpelleten i 1 mL av komplett ASC medium.
- Utföra en cell sammanräkning med hemocytometer.
- Späd cellsuspensionen till en koncentration av 25.000 celler mL-1 i komplett ASC medium.
- Tillsätt 200 µL av A0 medium till alla periferin brunnar i 96 väl plattan (platt botten). Detta minskar avdunstningen av brunnarna som innehåller celler i centrum.
- Överföra 200 µL cellsuspension till en mikrobrunn tallrik för att uppnå en slutlig cell densiteten av 5 x 103 celler per brunn. Fyra brunnar behövs för varje behandlingsgrupp (tre exemplar tekniska repetitioner och en ingen primär antikropp-kontroll för immuncytokemi (ICC)).
- Lämna mikrobrunn plattan i inkubatorn (37 ° C, fuktad, 5% CO2) tills cellerna reach sammanflödet (3-4 dagar).
2. inducerar differentiering av ASCs
- Förbered adipogena differentiering medium genom att komplettera komplett ASC medium med 1 µM dexamethasome, 10 µM insulin och 200 µM indometacin. Komplett differentiering mediet är stabil vid 4 ° C i 1 månad, så bara göra som krävs för 1 assay. Butik vid 4 ° C och när det behövs värme en alikvot till 37 ° C i vattenbadet.
- Efter 3-4 dagar, ta mikrobrunn plattan ur inkubatorn och ersätta hälften av odlingssubstratet med adipogena differentiering medium.
- Utföra en medellång förändring varje 2-3 dagar.
Obs: Optimal adipogena differentiering kräver 14 dagar av kultur i differentiering medium. Differentierade cellerna analyseras med traditionell färgämne baserat fläckar och gen-specifika fläckar.
3. färgning för differentiering - traditionella färgämnet baserade fläckar
- Förbered 4% formaldehydlösning av späda 16% formaldehyd med PBS. Späd endast beloppet för experiment och store tätt tillsluten i ett centrifugrör.
FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är potentiellt cancerframkallande och kan orsaka irritation i näsan, halsen och lungorna vid inandning. Utför alla procedurer som avser formaldehyd i dragskåp. - Förbereda olja röd O stamlösning av upplösning 300 mg i 100 mL isopropanol.
- Ta mikrobrunn plattan ur inkubatorn. Följande steg kan utföras i en icke-steril miljö.
- Ta bort alla medium från brunnar och fixa celler med 4% formaldehyd i 30 min.
- Under inkubationstiden, förbereda olja röd O fungerande lösning. Fungerande lösning består av 6 delar olja röd O lager med 4 delar destillerat vatten (dH2O). Blanda väl och låt stå i rumstemperatur i 20 min, innan filtrering använder 0,2 µm filterenhet. Arbetar lösning är bara stabil i 2 h.
- Ta bort alla formaldehyd från brunnarna genom pipettering.
- Tvätta cellerna en gång med 60% isopropanol och låt brunnarna torka helt innan du fortsätter.
- Tillsätt 50 µL av olja röd O fungerande lösning till varje brunn och odla i rumstemperatur i 10 min.
- Ta bort olja röd O lösning och omedelbart lägga till dH2O. Wash med dH2O 4 gånger innan visning under ljusmikroskop.
4. färgning för differentiering - gen specifika antikroppar
- Förbereda stamlösning Tris buffrad koksaltlösning (TBS) genom upplösning 80 g NaCl, 2 g av KCl och 30 g för Tris Base till 1 L dH2O (pH 8). Förbereda fungerande lösning genom spädning 1:10 med dH2O. Store vid rumstemperatur.
- Förbereda immunobuffer (IB) (1% fetalt bovint serum (FBS) i TBS). Märka det 15 mL centrifugröret med datum och förvaras vid 4 ° C. IB kan användas för 1 vecka från den dag som gjort.
- Förbereda 0,25% kasein blockerare genom upplösning 0,5 g kasein och 0,195 g natriumazid i 200 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lös upp ingredienserna genom omrörning över natten. Delprov i 15 mL centrifugrör och förvaras i-20 ° C. Tinade kasein lösningar kan förvaras vid 4 ° C i 1 månad.
- Bered DAPI genom att späda ut lager DAPI 1: 200 i TBS. Store vid 4 ° C, skyddas från ljus.
- Förbereda lager timerosal lösning (10 mg mL-1) genom upplösning timerosal i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Förvaras vid 4 ° C och späd lämpliga uppgår till 0,4 mg mL-1 för användning.
- Fixa och permeabilize celler med iskall metanol (96 väl plattan) för 5 min. Tvätta cellerna en gång med 200 µL av TBS.
- Block med 50 µL av 0,25% kasein i rumstemperatur i 10 min och tvätta en gång med TBS.
- Tillsätt 50 µL av primära antikroppar utspätt i IB (se tabell 1 för antikropp Detaljer) och inkubera med lock stängt för 1 h.
- Tvätta en gång med 200 µL av TBS och sedan 3 gånger med TBS för 5 min med mild gunga.
- Tillsätt 50 µL av sekundära antikroppar utspätt i IB (se tabell 2 för antikropp Detaljer) med 1: 2000 DAPI i varje, inkubera med lock stängt för 1 h. täcka plåten med folie för att förhindra foto-blekning.
- Tvätta en gång med TBS, och sedan två gånger med TBS för 15 min med mild gunga.
- Ta bort alla TBS och tillsätt 200 µL av timerosal lösning.
- Förvara plattan vid 4 ° C, skyddas från ljus tills imaging.
5. imaging celler med hög genomströmning Mikroskop
- Analysera celler fläckade gen specifika antikroppar och fluorophore konjugerade sekundära antikroppar (immunofluorescens) med hög innehåll screening Mikroskop kontrolleras med medföljande programvara.
- Läsa in mikrobrunn plattan i Mikroskop scenen. Om plattan förvärv kontroll, Välj bild på medellång räckvidd förstoring (10 X objektiv). Kontrollera att bilderna tas från mitten av varje brunn, med 50 µm mellanrum mellan varje plats för att säkerställa att en cell inte visas i två intilliggande fält.
- Välj brunnarna till bild.
- Välj rätt kanal kombinationer, exponeringstid och z-offset parametrar. Se tabell 3 för mer detaljerad information för varje filter (kompletterande tabell2).
- Förvärva analysen med guiden förvärv (bilder lagras automatiskt till databasservern).
- Använda alternativa kanal kombinationer för att förvärva pläterar färgas med Oil Red O. (kompletterande tabell3).
6. analysera förvärvade bild
Obs: Avlägsen tillträde till databasen server möjliggör snabb och enkel utvärdering av bilderna förvärvade och användning av programvaran bild analys.
- Öppen Cell Scoring modul på analys programvara.
- Identifiera cellkärnor DAPI kanal (nukleära markör) och segment kärnor av intresse med användardefinierade parametrar för storlek och signal intensiteten ovan bakgrund.
- Identifiera FABP4 signal med FITC-kanal. Segmentera differentierade celler med användardefinierade parametrar för storlek och signal intensitet över bakgrunden till Markera alla FABP4 positiva regioner i varje bild.
- Öppna Transfluor modul på analys programvara att analysera pläterar färgas med Oil Red O.
- Ange storlek och intensitet av olja röd O målat regioner som 'gropar'.
Representative Results
I denna studie mättes adipogena differentiering potential ASCs med 3 olika metoder. Immunofluorescerande märkning av FABP4, visade att denna markör lokaliserad till cytoplasman i differentierade celler och märkning överlappas med DAPI-märkt atomkärnor (figur 1A). Automatiserad bildanalys visade en 24,6 faldig ökning i % av FABP4 positiva celler i differentierade gruppen i tidig passage celler jämfört med 6,9-faldig ökning sen passage celler (figur 1B). Olja röd O färgning var lokaliserad till fett droppar spridda över hela cytosolen differentierade celler, och sällan märkning överlappas med DAPI-märkt kärnor; men från okulärbesiktning, det finns färre cellkärnor som är associerad med Oil Red O fett droppar i slutet passagen cellerna jämfört med tidig passage celler (figur 2A). Automatiserad bildanalys avslöjade en 11,1 faldig ökning i området av olja röd O färgning per cell i tidig passage celler och en 53,9 faldig ökning färgning areal per cell i slutet passagen celler (figur 2B). Avbildning av både fläckar utfördes, och sedan kvantifieras med hjälp av Cell Scoring (FABP4) eller Transfluor (olja röd O) modul i programvaran (kompletterande bild1, kompletterande tabell 2-5). Uppreglering av FABP4 uttryck bekräftades genom Western blot analys (figur 3, kompletterande figur 5). Alla 3 analysmetoder avslöjade att tidig passage ASCs har högre adipogena differentiering potentiella än slutet passagen celler. Adipogena differentiering påverkade inte totala mobilnummer per brunn (kompletterande diagram 2, 3). Atomkärnor storleken på FABP4-positiv differentierade celler var dock betydligt mindre än kontroll celler för sena passage ASCs endast (kompletterande diagram 3).
Vi visade att celler var expanderat i kultur, eller passaged, andelen celler inom kulturen kan adipogena differentiering minskade, överensstämmer med tidigare publicerade data11. Det är viktigt att notera att faktorer som ålder, BMI eller tidigare sjukdomshistoria12 inte kunde kontrolleras för i denna studie och sannolikt bidragit till variationer mellan olika givare prover (kompletterande Tabell1).
Figur 1 : FABP4 immunolabelling visar att tidig passage celler har större differentiering potentiella än senare passage celler. (A) representativa bilder av tidiga och sena passage, kontroll och differentierade celler märkta med DAPI (nukleära fläcken) och FABP4 visas tillsammans med merge och segmentering bilder. Segmenteringen bilder visas differentierade celler med en grön overlay och odifferentierade celler med en röd overlay. (B) en betydande ökning FABP4 uttrycker celler observerades med adipogena differentiering i tidiga och sena passage celler, dock tidig passage celler visade signifikant större ökning av differentiering än slutet passagen celler (Mann Whitney testa * betecknar P < 0,05 och *** betecknar P < 0,001). De data som visas är genomsnittet över tidig passage (p4; n = 8) eller sena passage (p10; n = 4) givare prover, ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Olja röd O färgning visar att tidig passage celler har större differentiering potentiella än senare passage celler. (A) de representativa bilderna av DAPI (nukleära fläcken) och olja röd O (grå, lipid droplet fläcken) visas tillsammans med merge och segmentering bilder. Segmentering bilderna visar alla atomkärnor med gröna overlay och olja röd O målat lipid droppar med en röd overlay. (B) en betydande ökning av olja röd O färgning området observerades med adipogena differentiering. Tidig passage celler visade större område av olja röd O fläcken per cell jämfört med sena passage celler. Området i olja röd O färgning per cell (μm2) används här som ett mått på adipogena differentiering potentiella. De data som visas är genomsnittet över tidig passage (p4; n = 8) eller sena passage (p10; n = 4) givare prover, ± SEM (Mann-Whitney test * betecknar P = < 0,05 och *** betecknar P = < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Western blot analys av FABP4 protein uttryck nivå av differentierade tidigt och sent passage ASCs. Semikvantitativ analys av FABP4 band optiska densitet i förhållande till totalt protein lastning kontroll, beta aktin (ACTB), visade att FABP4 immunolabelling var ökat betydligt i tidig passage och till en lesser grad sena passage differentierade celler. De data som visas är genomsnittet över tidig passage (p4; n = 8) eller sena passage (p10; n = 4) givare prover, ± SEM (Mann-Whitney test * betecknar P = < 0,05 och *** betecknar P = < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Målet antigen | Isotyp (klon) | Arter | Utspädning |
| FABP4 | Polyklonala | Kanin | 1: 100 |
Tabell 1: Primär antikropp
| Inriktning antikropp | Fluorophore etikett | Arter | Utspädning |
| Kanin IgG | Alexa fluoro 488 | Goat | 1: 200 |
Tabell 2: Sekundär antikropp
Kompletterande Figur1: översikt över den virtuella miljön bild analys. De färgade cellerna var avbildas med en automatiserad, hög genomströmning fluorescerande mikroskopet för att undvika någon källa av partiskhet. Bilder var förvärvade med ImageXpress Micro XLS, sparas direkt till databasen MDCStore Data Manager och göras tillgängliga för visning genom virtuella stationära anslutningar, som användarna använder för att optimera och testa deras specifika analysparametrar. Bilder analyserades med en dedikerad ”autorun” instans som möjliggör flera olika användare att skicka 'jobb' till ärendekön autorun. Användare kan hämta sina data via den virtuella instansen när deras 'jobb' är klar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: jämförelse av totala blodkroppar per brunn av kontroll och differentierade brunnar för tidiga och sena passage ASCs, använder FABP4 målat plattan. De data som visas är genomsnittet över tidig passage (p4; n = 8) eller sena passage (p10; n = 4) givare prover, ± SEM. Fanns ingen statistiskt signifikant skillnad mellan kontroll och differentierade celler för både tidiga och sena passage ASCs. Det fanns fler celler per brunn för tidig passage celler jämfört med sena passage celler. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: jämförelse av totala blodkroppar per brunn av kontroll och differentierade brunnar för tidiga och sena passage ASCs, med Oil Red O målat plattan. De data som visas är genomsnittet över tidig passage (p4; n = 8) eller sena passage (p10; n = 4) givare prover, ± SEM. Fanns ingen statistiskt signifikant skillnad mellan kontroll och differentierade celler för både tidiga och sena passage ASCs. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 4: på senare passager, differentierade celler som var FABP4 positiva hade betydligt mindre kärnor område än celler i kontrollbrunnarna. Fanns ingen statistiskt signifikant skillnad i atomkärnor område mellan kontroll och differentierade celler i tidig passage. De data som visas är genomsnittet över tidig passage (p4; n = 8) eller sena passage (p10; n = 4) givare prover, ± SEM. (oparat t-test. *** betecknar P = < 0,001). Medelvärde ± SEM visas.) Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 5: bilder av Western blot geler. Röda kanalen skildrar beta-aktin. Gröna kanalen skildrar FABP4 immunolabelling. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande Tabell1: Clinicopathological information av givare Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Kompletterande Tabell2: Imaging inställningar (FABP4) Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Kompletterande Tabell3: Imaging inställningar (olja röd O) Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Kompletterande Tabell4: tabell över analysparametrar används (FABP4). Cell Scoring modul. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Kompletterande Tabell5: tabell över analysparametrar används (olja röd O). Trans Fluor modul. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Discussion
Detta papper visar nyttan och fördelarna med FABP4 immunolabelling att exakt identifiera och kvantifiera mogen adipocyter härrör från mesenkymala stromaceller. FABP4 är kunna upptäcka förändringar i uttrycket av en härstamning specifikt protein3,4,5 i mogen adipocyter, tvärtemot andra vanligen används färgämnen som makromolekylära ändras13,14 såsom olja röd O15, Nile röd16 och Sudan svart17. FABP4 immunolabelling möjliggör visualisering och analys av förändringar i cellulära morfologi. Detta är en distinkt fördel jämfört med tidigare beskrivna metoder använder kvantitativa omvänd Transkription PCR (RT-qPCR) som analyserar förändringar på nivån avskrift utan någon visualisering5,18,19 ,20, eller flödescytometri som kräver celler i suspension20eller Western blotting som kräver celler att vara lyserat för att isolera protein19,20. FABP4 immunolabelling är stabil i fasta celler, läcker inte i lösning och att vara ett cytosoliskt protein när märkas i en vidhäftande enskiktslager av celler, överlappar med kärnan möjliggör enkel visualisering och noggrannhet i den automatiserad analysen.
Hög-innehåll screening är fördelaktigt eftersom den är snabb, korrekt, reproducerbar och sakligt. Det ger en plattform för kostnadseffektiv användning av reagenser och forskare tid, eftersom bild förvärv och analys kräver minimal manuell manipulation och förlita sig på automatisk behandling av instrumentet. Flera faktorer identifierades som kritiska till noggrannheten och reproducerbarheten av hög-innehåll screening analyser31. Kvantifiering av antigen uttryck är beroende av bildkvalitet. För framgångsrika bildanalys, bilder från varje kanal per brunn måste vara i fokus och faller inom en optimal dynamiska omfånget för gråvärden (Auto exponera inställningar är perfekt). Out-of-fokus eller mättade bilder leda till felaktiga resultat.
Vissa potentiella begränsningar av de metoder som beskrivs i denna artikel omfattar följande: Kravet för specialiserade bildgivande utrustning och analysprogram. Utanför tillämpningsområdet för denna artikel, kan alternativa öppen källkod programvarualternativ (till exempel ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) användas för att utföra liknande bild segmentering uppgifter. men de kräver kompetens att antingen hämta och skräddarsy makron tillgängliga online eller skriva makron/kommandon för deras särskild analys rörledningar. Inneboende till alla automatiserade imaging analys rörledningar är en nivå av bakgrundsbrus. Detta kan till stor del tillskrivas skräp, dålig bild kvalitet eller analys fel, betonar behovet av noggrann provberedning och noggrann inställning av bildbehandling och analys-plattformen. FABP4 etiketten i möss har visat för att upptäcka odifferentierade föräldraparets30; medan de kontroller i denna studie (som består av odifferentierade celler) saknar specifika FABP4 färgning. Detta under Poäng nödvändigheten av att kontrollera FABP4 uttryck odifferentierade stamfäder i varje biologiska sammanhang där analysen är anställd.
För att dra giltiga jämförelser mellan FABP4 märkning och olja röd O färgning, utgång mätningarna från bildanalys behövde vara biologiskt relevanta. Följaktligen, mätning, '% positiva celler' användes för FABP4, och 'area av färgning per cell' användes för Oil Red O. Det är anmärkningsvärt att måttet '% positiva celler' inte användes för olja röd O märkt celler i vår studie eftersom det inte var möjligt att exakt tillskriva märkta fett droppar en viss kärna; de feta liten dropparna varierade betydligt i storlek, antal och fördelning mellan cellkroppen och sällan överlappas med kärnan. Olja röd O färgning variation finns mellan celler som härrör från olika vävnad källor; medan % positiva celler åtgärd inte var lämpligt för den aktuella studien, en annan grupp har använt det framgångsrikt för att kvantifiera adipocyter härrör från mänskliga körtel stamceller22 där olja röd O färgningen uppträdde som ett stort fett droplet som sträckte sig över de cytoplasman och överlappade med kärnor och aktivera data som ska presenteras som procent positiva celler.
Morfologi av FABP4 immunolabelling är däremot konsekvent adipocyter härrör från en rad olika vävnad källor23,24,25. Möjligheten att kvantifiera andelen celler inom en kultur som är kapabel av differentiering har ett antal applikationer. Adult mesenkymala stromaceller håll betydande löfte för en rad olika terapeutiska användningar. Ett betydande problem som har uppstått med kliniska översättning är det inneboende variabilitet i kapaciteten hos dessa celler mellan patienter26, mellan platser av isolering27,28och mellan metoder för isolering12 och expansion av cell nummer12 för terapeutiskt bruk. Det har tidigare visat att kulturer av vidhäftande stromaceller är ofta heterogen, med vissa celler kan differentiering och några inte 12,17 som våra FABP4 visar analysen för ASC kulturer. Analyser som detta, kombinerat med anrikning tekniker, kommer att hjälpa till att identifiera subpopulationer inom heterogen kulturer kan härstamning-specifika differentiering. Att ha en standardiserad, kvantifierbara analys såsom denna FABP4 analys ger en enkel metod för jämförelse mellan alla dessa variabler, och potential att utvärdera terapeutiska resultat inom och mellan kliniska prövningar.
Kvantifiering av FABP4 på ett halvautomatiskt sätt möjliggör objektivitet och reproducerbarhet i analysen över många givare fall och prover. Vidare som etiketten är cytoplasmiska, det kan potentiellt vara används för att analysera hypertrofi (förstoring av fettceller storlek) förutom hyperplasi (ökning fettceller nummer), en distinktion som är av avsevärd betydelse för fetma forskning, där hypertrofi är starkt förknippad med fett dysfunktion hos överviktiga individer21. Fetmaepidemin har sporrat en betydande mängd intresse att identifiera droger kan styra lipid lagring. Denna FABP4 analys ger också en enkel avläsning för screening tusentals föreningar för sin förmåga att hämma lipid ackumulering.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att donatorerna till erhållsgenom och forskning proffs som samlar in och förse oss med denna resurs för forskningsändamål. Vi skulle vilja erkänna finansieringsstöd av Allergan. Vi är också tacksamma till University of Auckland, Faculty of Medical och Health Sciences prestanda baserat forskningsfond för att finansiera kostnaderna för videoing och redigering för inlämning av denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
