Summary
Los métodos tradicionales de evaluación de diferenciación adipogenic son baratos y fácil de usar, pero no son específicos a los cambios en la expresión génica. Hemos desarrollado un ensayo para cuantificar la diferenciación de células mesenquimales en adipocytes maduros usando un marcador específico de linaje. Este ensayo tiene diversas aplicaciones en investigación básica y la medicina clínica.
Abstract
Varios colorantes están disponibles para su uso en la detección de la diferenciación de células mesenquimales en adipocitos. Tintes, tales como aceite rojo O, son baratos, fáciles de usar y ampliamente utilizada por laboratorios analizar el potencial de adipogenic de células mesenquimales. Sin embargo, no son específicos a los cambios en la transcripción del gene. Hemos desarrollado un ensayo de diferenciación gene-específico para analizar cuando una célula mesenquimal ha cambiado su destino a un linaje de adipogenic. Inmuno-etiquetado contra ácidos grasos Unión proteína-4 (FABP4), un marcador de linaje-específicas de diferenciación adipogenic, permitió la visualización y cuantificación de células diferenciadas. La capacidad de cuantificar adipogenic potencial de diferenciación de células mesenquimales en un formato de 96 microplate pozo tiene implicaciones prometedoras para un número de aplicaciones. Cientos de estudios clínicos involucran el uso de células estromales mesenquimales adultas y es actualmente difícil correlacionar los resultados terapéuticos dentro y sobre todo entre estos ensayos clínicos. Este ensayo de FABP4 simple de alto rendimiento ofrece un ensayo para evaluar el potencial de diferenciación de células derivadas del paciente y es una robusta herramienta para comparar diferentes métodos de aislamiento y expansión. Esto es particularmente importante dado el creciente reconocimiento de la heterogeneidad de las células siendo administrado a los pacientes en los productos de células mesenquimales. El análisis también tiene utilidad potencial en la detección de drogas de alto rendimiento, particularmente en la investigación de la obesidad y la diabetes.
Introduction
Uno de los requisitos fundamentales establecidos por la sociedad internacional de terapia celular (ISCT) para definir una células estromales mesenquimales multipotentes es que las células tienen la capacidad de diferenciarse en la adipogenic osteogénica y condrogénica linajes 1. métodos convencionales de medición de diferenciación en estos tres linajes se basan en la detección de productos macromoleculares con tintes químicos1. Tintes como el aceite O rojo (que las manchas de gotitas de grasa en las células que han sufrido la adipogénesis), son baratos y fácil de usar; sin embargo no llegan a detectar los cambios específicos en la expresión génica que ocurren cuando las células mesenquimales se diferencian en cada respectivo linaje2. Aquí, hemos desarrollado un ensayo de diferenciación que cuantifica la expresión de la proteína para un marcador de linaje específico adipogenic, ácidos grasos Unión proteína-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 fue encontrado inicialmente en adipocitos de ratón 3T3-L13 y fue descubierto más adelante para ser expresado en el tejido adiposo subcutáneo humano6. Es una proteína citosólica, que actúa como un acompañante para guiar la absorción de ácidos grasos por las células y participa en el proceso de lipólisis4.
Las células del precursor utilizadas para los ensayos de diferenciación eran células estromales mesenquimales derivadas adiposas (ASCs)7,8. ASCs comparten muchas propiedades con médula ósea células madre mesenquimales (MSCs-BM), una población de células mesenquimales principales en adultos8,9. ASCs ofrecen varias ventajas sobre los BM-MSCs en una aplicación clínica, como mayor rendimiento de las células puede ser aislado del tejido más accesibles fuentes8,9. Una población aislada de la célula debe cumplir ciertos criterios para definir como ASC. En primer lugar, deben demostrar cumplimiento de recipientes de cultivo de tejido plástico en condiciones de cultivo estándar1. También deben demostrar expresión de antígeno específico de la superficie1. ASCs incultos se caracterizan por la expresión del antígeno de superficie positivo de CD34, CD73, CD90, baja expresión de CD105 y negativa expresión de CD45 y HLA-DR10. ASCs purificadas por cultivo en plástico durante 28 días (adherente purificada ASCs) muestran expresión positiva de CD73, CD90 y CD105 y negativa expresión de CD34 y CD45, HLA-DR10. Por último, las células deben conservar la capacidad de diferenciarse en varios linajes1,7,8.
Protocolos de diferenciación de Adipogenic inducen llamativa upregulation de FABP4 expresión entre otros genes del linaje de adipocito, así que utilizado inmunoquímica para visualizar FABP4 proteína dentro de las células y luego cuantifica FABP4 expresión a nivel unicelular utilizando un microscopio de proyección de alto contenido fluorescente automatizado. Este método es ventajoso sobre tintes tradicionales ya que permite la confirmación específica de la diferenciación del adipocito-linaje. Tales ensayos de linaje específico de genética combinados con alto contenido métodos de cribado también permiten la cuantificación de la proporción de células dentro de una preparación de células heterogéneas que son capaces de diferenciación por un linaje particular. En nuestros estudios hemos utilizado el ensayo FABP4 para confirmar la pérdida del potencial de diferenciación de adipogenic de ASCs recientemente aisladas después de cultivo celular.
Protocol
1. preparación de ASCs para los ensayos de diferenciación
- Preparar los reactivos de cultivo de tejidos y manipular células vivas en una campana de cultivo estériles para tejidos.
- Preparar medio A0: medio de Eagle modificado Dulbecco y Ham F12 medio (DMEM/F12), glutamax de x 1, x 1 penicilina/estreptomicina.
- Preparar el medio completo ASC: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penicilina/estreptomicina, 10% suero bovino fetal.
- Adherente de uso purificada ASCs, ampliados en un matraz de cultivo T75. Confirmar la pureza de ASCs usando celular activado por fluorescencia (FACS)10de la clasificación.
- Separar las células eliminando todo medio del frasco de cultura T75 y añadir 2 mL de enzima de disociación celular.
- Deje el frasco de cultivo en la incubadora (37 ° C, humidificado, 5% CO2) por 5-10 minutos. Tome el frasco de cultura fuera de la incubadora y golpee firmemente al lado del frasco. Comprobar si las células han separado del frasco de cultivo utilizando un microscopio invertido.
- Añadir 13 mL de medio de A0 a un matraz de cultivo T75.
- Transferir 15 mL en un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.
- Deseche el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de medio completo de ASC.
- Realizar un conteo mediante hemocitómetro.
- Diluir la suspensión de células a una concentración de 25.000 células mL-1 en medio completo de ASC.
- Añadir 200 μL de medio de A0 a todos los pocillos de periferia de la placa de la pozo 96 (fondo plano). Esto reduce la tasa de evaporación de los pozos que contienen células en el centro.
- Transfiera 200 μL de la suspensión celular a una placa de pocillos para lograr una densidad final de la célula de 5 x 103 células por pocillo. Se necesitan cuatro pozos para cada grupo de tratamiento (repeticiones técnicas por triplicado y sin control de anticuerpo primario para inmunocitoquímica (ICC)).
- Deje la placa de micropocillos de la incubadora (37 ° C, humidificado, 5% CO2) hasta las células confluencia de alcance (3-4 días).
2. inducir la diferenciación de ASCs
- Preparar medio de diferenciación de adipogenic complementando el medio ASC completo con 1 μm dexamethasome, insulina μm 10 y 200 indometacina μm. El medio de diferenciación completa es estable a 4 ° C durante 1 mes, hace tan solamente como sea necesario para el 1 ensayo. Tienda a 4 ° C y cuando es necesario calentar una alícuota a 37 ° C en baño de agua.
- Después de 3-4 días, tomar la placa de micropocillos de incubadora y sustituir la mitad de medio de cultivo con medio de diferenciación adipogenic.
- Realizar un cambio medio cada 2-3 días.
Nota: Diferenciación de adipogenic óptima requiere 14 días de cultivo en medio de la diferenciación. Las células diferenciadas se analizan con gene-específico manchas y manchas de tinte tradicional basado.
3. tinción de diferenciación - tinte tradicional basado en las manchas
- Preparar la solución de formaldehído 4% por diluir el 16% de formaldehído con PBS. Diluir únicamente la cantidad necesaria para el experimento y almacén cerrado en un tubo de centrífuga.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es un carcinógeno potencial y puede causar irritación en nariz, garganta y los pulmones por inhalación. Realizar todos los procedimientos relacionados con el formaldehído en una campana de humos. - Preparar solución stock aceite rojo O disolviendo 300 mg en 100 mL de isopropanol.
- Tomar la placa de micropocillos de la incubadora. Los siguientes pasos pueden realizarse en un ambiente no estéril.
- Quite todo medio de pozos y las células con formaldehído al 4% durante 30 minutos.
- Durante el tiempo de incubación, preparar la solución de trabajo de aceite rojo O. Solución de trabajo consta de 6 piezas stock de aceite rojo O con 4 partes de agua destiladas agua (dH2O). Mezcle bien y deje reposar a temperatura ambiente por 20 min, antes de filtrar con unidad de filtro de 0,2 μm. Solución sólo es estable durante 2 h.
- Eliminar formaldehído todos de pozos mediante pipeteo.
- Lavar las células una vez con isopropanol al 60% y dejar que los pozos se secan antes de proceder.
- Añadir 50 μl de solución de trabajo de aceite rojo O a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Quitar aceite rojo O solución y agregar inmediatamente dH2O. Wash con tiempos de2O 4 dH antes de observación bajo microscopio de luz.
4. tinción de diferenciación - Gene específico anticuerpos
- Prepare solución de solución salina tamponada con Tris (TBS) disolviendo 80 g de NaCl, 2 g de KCl y 30 g de Tris Base a 1 L de dH2O (pH 8). Preparar solución de trabajo diluyendo 1:10 con dH2O. almacén a temperatura ambiente.
- Preparar immunobuffer (IB) (1% suero bovino fetal (FBS) de TB). El tubo de centrífuga de 15 mL con fecha de la etiqueta y almacenar a 4 ° C. IB puede utilizarse para 1 semana a partir de la fecha.
- Preparar bloqueador de caseína 0.25% disolviendo 0.5 g de caseína y 0,195 g de azida de sodio en 200 mL de tampón fosfato salino (PBS). Disolver completamente los ingredientes revolviendo durante la noche. Alicuotar en tubos de centrífuga de 15 mL y almacenar en un congelador de-20 ° C. Soluciones de caseína descongelada pueden conservarse a 4 ° C durante 1 mes.
- Preparar la solución DAPI diluyendo stock DAPI 1: 200 en TBS. almacén a 4 ° C, protegido de la luz.
- Preparar solución stock de timerosal (10 mg mL-1) disolviendo timerosal en PBS estéril. Almacenar a 4 ° C y diluir cantidades apropiadas a 0.4 mg mL-1 para su uso.
- Fijar y permeabilizar las células con metanol helada (96 placa bien) para las células de lavado de 5 minutos una vez con 200 μL de TBS.
- Bloque con 50 μl de caseína de 0.25% a temperatura ambiente durante 10 min y lavar una vez con TBS.
- Añadir 50 μl de anticuerpos primarios diluido en IB (ver tabla 1 para datos de anticuerpos) e incubar con las tapas cerradas de 1 h.
- Una vez lavado con 200 μL de TBS y luego 3 veces con TBS por 5 min con suave balanceo.
- Añadir 50 μl de anticuerpos secundarios diluido en IB (ver tabla 2 para detalles de anticuerpos) con 1: 2000 DAPI en cada uno, incubar con tapas de cerrado de 1 h. tapa la placa con papel para evitar blanqueo de foto.
- Lave una vez con TBS y luego dos veces con TBS durante 15 min con suave balanceo.
- Retire los TBS y añadir 200 μL de solución de timerosal.
- Almacenar a 4 ° C, protegido de la luz hasta la proyección de imagen de la placa.
5. proyección de imagen de las células utilizando un microscopio de alto rendimiento
- Análisis de células teñidas con fluoróforo y gene específico anticuerpos anticuerpos secundarios conjugados (inmunofluorescencia) utilizando un microscopio de alta proyección de contenido controlado con el software de acompañamiento.
- Cargue la placa de micropocillos en la platina del microscopio. En el control de la adquisición de la placa, selecciona la imagen con un aumento de mediano alcance (10 X objetivo). Asegúrese de que imágenes son tomadas desde el centro de cada pozo, con 50 μm espaciado entre cada sitio para garantizar que una celda no aparece en dos campos adyacentes.
- Seleccione los pozos a la imagen.
- Seleccione las combinaciones de canal, tiempo de exposición y los parámetros z offset. Consulte la tabla 3 para información más detallada de cada filtros (tabla 2 suplementaria).
- Adquirir el ensayo utilizando al asistente de adquisición (imágenes se guardan automáticamente al servidor de base de datos).
- Utiliza combinaciones de canales alternativos para adquirir las placas teñidas con Oil Red o (complementario tabla 3).
6. analizar la imagen adquirida
Nota: Acceso remoto a la base de datos servidor permite fácil y rápida evaluación de las imágenes adquiridas y el uso del software de análisis de imagen.
- Módulo celular puntuación abierta en el software de análisis.
- Detectar núcleos celulares utilizando el canal DAPI (marcador nuclear) y segmento núcleos de interés con parámetros definidos por el usuario para tamaño y señal de intensidad por encima del fondo.
- Detectar la señal de FABP4 utilizando canal de FITC. Segmento de células diferenciadas con parámetros definidos por el usuario para tamaño y señal de intensidad por encima de fondo para seleccionar todas las regiones positivas de FABP4 en cada imagen.
- Abra el módulo Transfluor en el software de análisis para analizar las placas teñidas con Oil Red O.
- Especificar el tamaño y la intensidad del aceite rojo O manchado regiones como 'hoyos'.
Representative Results
En este estudio, se midió el potencial de diferenciación de adipogenic de ASCs con 3 métodos diferentes. Etiquetado inmunofluorescente de FABP4, demostrada que este marcador localizado en el citoplasma de células diferenciadas, y el etiquetado están comprometidos con los núcleos etiquetados de DAPI (figura 1A). Análisis de imagen automatizado revelaron un aumento de 24.6 veces mayor en el % de células positivas FABP4 en el grupo distinguido en las células de paso temprano en comparación con el aumento de 6,9 veces mayor en últimas células de paso (figura 1B). Aceite rojo O tinción fue localizada a gotitas de grasa dispersadas en el citosol de las células diferenciadas, y raramente el etiquetado coincidía con DAPI-labelled núcleos; sin embargo desde la inspección visual, hay pocos núcleos celulares asociados con gotitas de aceite rojo O grasa en las células de paso tardío en comparación con células de paso temprano (figura 2A). Análisis de imagen automatizado revelaron un aumento de 11,1 veces en la zona de aceite rojo O manchas por celular en las células de paso temprano y un aumento de 53,9 veces mayor en la coloración de la zona por la célula en células de paso finales (figura 2B). Proyección de imagen de ambas manchas fue realizada y luego cuantificados usando celular puntuación (FABP4) o Transfluor (aceite rojo O) módulo del software (figura 1 complementaria, suplementaria tabla 2-5). La regulación al alza de FABP4 expresión fue confirmada por análisis de Western blot (figura 3, figura 5 complementario). Todos los métodos de análisis 3 revelaron que temprano paso ASC tiene mayor diferenciación de adipogenic potencial que las células finales de paso. La diferenciación de adipogenic no afectó el número total de células por pozo (figura suplementaria 2, 3). Sin embargo, fue significativamente menor que las células del control último paso ASC sólo el tamaño de los núcleos de células diferenciadas de FABP4 positivas (suplementario Figura 3).
Hemos demostrado las células fueron ampliadas en cultura, o pasadas, el porcentaje de células dentro de la cultura capaz de diferenciación adipogenic disminuida, de conformidad con datos previamente publicados11. Es importante tener en cuenta que factores como edad, índice de masa corporal o historial médico anterior12 no podrían ser controladas para este estudio y contribuyó probablemente a la variabilidad observada entre muestras de diferentes donantes (complementario tabla 1).
Figura 1 : FABP4 immunolabelling demuestra que células de paso temprano potencial mayor diferenciación que las células de paso más adelante. A) se muestran imágenes representativas de temprano y último paso, el control y las células diferenciadas con DAPI (tinción nuclear) y FABP4 junto a combinación y segmentación de imágenes. La segmentación de imágenes Mostrar distinguido células con un recubrimiento verde y las células no diferenciadas con un recubrimiento rojo. B) un aumento significativo de FABP4 expresando células observó con adipogenic diferenciación en células de paso precoz y tardía, sin embargo, las células de paso temprano demostraron aumento significativamente mayor diferenciación que las células finales paso (Mann Whitney prueba * denota P < 0.05 y *** denota P < 0,001). Los datos que muestra están el medio a través de paso temprano (p4; n = 8) o finales (p10; n = 4) las muestras de donantes, ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Aceite rojo O tinción demuestra que células de paso temprano potencial mayor diferenciación que las células de paso más adelante. A) las imágenes representativas de DAPI (tinción nuclear) y aceite rojo O (gris, mancha de gotas de lípidos) se muestran junto a combinación y segmentación de imágenes. Las imágenes de segmentación representan todos los núcleos con superposición de verde y aceite rojo O manchado de gotas lipídicas con un recubrimiento rojo. B) un aumento significativo en el área de tinción aceite rojo O fue observado con la diferenciación de adipogenic. Primeras células paso demostradas una mayor área de mancha de aceite rojo O por célula en comparación con las células finales de paso. La zona de aceite rojo O manchas por la célula (μm2) se usa aquí como una medida de diferenciación adipogenic potencial. Los datos que muestra están el medio a través de paso temprano (p4; n = 8) o finales (p10; n = 4) muestras de donantes, ± SEM (test de Mann Whitney * denota P = < 0.05 y *** indica P = < 0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de Western blot de FABP4 nivel de expresión de proteína de paso distinguido temprano y tardío ASCs. Análisis semicuantitativo de la densidad óptica de FABP4 bandas como una relación de control de carga de proteína total, actina beta (ACTB), demostrada que FABP4 immunolabelling fue aumentado en pasaje temprano y a un menor paso finales de grado diferenciado células. Los datos que muestra están el medio a través de paso temprano (p4; n = 8) o finales (p10; n = 4) muestras de donantes, ± SEM (test de Mann Whitney * denota P = < 0.05 y *** indica P = < 0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Antígeno blanco | Isotipo (clon) | Especies | Dilución |
| FABP4 | Policlonal | Conejo | 1: 100 |
Tabla 1: Anticuerpo primario
| Anticuerpos dirigidos a | Etiqueta del fluoróforo | Especies | Dilución |
| IgG de conejo | Fluoro Alexa 488 | Cabra | 1: 200 |
Tabla 2: Anticuerpo secundario
Suplementario Figura 1: Resumen del entorno virtual de análisis de imagen. Las células fueron fotografiadas con un microscopio de fluorescencia automatizado, de alto rendimiento para evitar cualquier fuente de sesgo. Imágenes adquiridas con ImageXpress Micro XLS, guardan directamente en la base de datos de administrador de datos de MDCStore y disponibles para su visualización a través de conexiones de escritorio virtuales, que utilizan los usuarios para optimizar y comprobar sus parámetros de análisis específico. Imágenes se analizaron con una instancia dedicada 'autorun' que permite a varios usuarios diferentes enviar 'jobs' a la cola de autorun. Los usuarios pueden recuperar sus datos a través de la instancia virtual terminada su 'trabajo'. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplementario Figura 2: comparación del total cuenta por pozo de control de la célula y distinguido pozos para temprano y último paso ASCs, usando FABP4 manchado placa. Los datos que muestra están el medio a través de paso temprano (p4; n = 8) o finales (p10; n = 4) las muestras de donantes, ± SEM. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre el control y las células diferenciadas para temprano y último paso ASC. Hubo más células por pocillo para las células de paso temprano en comparación con las células finales de paso. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplementario Figura 3: comparación del total cuenta por pocillo de control de la célula y distinguido pozos para temprano y último paso ASCs, utilizando aceite rojo O manchado placa. Los datos que muestra están el medio a través de paso temprano (p4; n = 8) o finales (p10; n = 4) las muestras de donantes, ± SEM. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre el control y las células diferenciadas para temprano y último paso ASC. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplementario figura 4: en pasos más adelante, las células diferenciadas que eran FABP4 positivo tenían área de núcleos significativamente más pequeña que las células en pocillos de control. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa en el área de núcleos entre control y células diferenciadas en pasaje temprano. Los datos que muestra están el medio a través de paso temprano (p4; n = 8) o finales (p10; n = 4) muestras de donantes, ± SEM. (test t no pareado. *** indica P = < 0.001). Media ± SEM se muestran.) Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplementario Figura 5: imágenes de Western blot geles. Canal rojo representa beta-actina. Canal verde representa immunolabelling FABP4. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Complementario tabla 1: información clinicopatológica de donantes Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Complementario tabla 2: proyección de imagen ajustes (FABP4) Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Complementario tabla 3: proyección de imagen ajustes (aceite rojo O) Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Adicional cuadro 4: tabla de parámetros de análisis utilizados (FABP4). Módulo de Scoring la célula. Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla.
Complementario tabla 5: tabla de parámetros de análisis utilizados (aceite rojo O). Módulo de trans Fluor. Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla.
Discussion
Este trabajo muestra la utilidad y ventajas de FABP4 immunolabelling para detectar y cuantificar adipocytes maduros derivados de células estromales mesenquimales exactamente. FABP4 es capaz de detectar cambios en la expresión de un linaje específico proteína3,4,5 en adipocytes maduros, contrario a otros comúnmente utilizan tintes que etiqueta macromolecular cambia13,14 como aceite rojo O15, Nilo rojo16 y17de Sudán negro. FABP4 immunolabelling permite la visualización y análisis de cambios en la morfología celular. Esto es una ventaja distintiva sobre métodos previamente descritos cuantitativa transcripción reversa PCR (RT-qPCR) que analiza los cambios en el nivel de transcripción sin cualquier visualización5,18,19 ,20o citometría de flujo que requiere que las células en suspensión20o Western Blot que necesita para la lisis para aislar proteínas19,20. FABP4 immunolabelling es estable en las células fijas, no se escapa hacia fuera en la solución y que es una proteína citosólica cuando etiquetados en una monocapa adherente de las células, se traslapará con el núcleo que permite fácil visualización y añade precisión en el análisis automatizado.
Proyección de alto contenido es ventajoso porque es rápido, preciso, reproducible y objetiva. Proporciona una plataforma para el uso rentable de los reactivos y el tiempo del investigador, desde análisis y adquisición de imágenes requieren mínima manipulación manual y se basan en el procesamiento automático del instrumento. Varios factores fueron identificados como críticos para la exactitud y reproducibilidad de la investigación de alto contenido ensayos31. La cuantificación de la expresión del antígeno depende de la calidad de imagen. Para el análisis acertado de la imagen, las imágenes de cada canal por bien deben en foco y caen dentro de un rango dinámico óptimo para valores de gris (configuración Auto exponer es ideales). Fuera de foco o imágenes saturadas conducen a resultados erróneos.
Algunas limitaciones potenciales de los métodos descritos en este artículo incluyen los siguientes. El requisito para especializado software equipo y análisis de imágenes. Mientras que fuera del alcance de este artículo, opciones de software de código abierto alternativa (por ejemplo, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) se pueden utilizar para realizar segmentación similar tareas; sin embargo que requieren de habilidad para descargar y adaptar macros disponibles en línea o escribir macros/comandos de sus tuberías de análisis específico. Inherente a las tuberías todo automatizado de análisis proyección de imagen es un nivel de ruido de fondo. Esto se puede atribuir en gran parte a la ruina, error de calidad o análisis de mala imagen, haciendo hincapié en la necesidad de preparación de muestras cuidadosa y cuidadosa preparación de la plataforma de proyección de imagen y análisis. Se ha encontrado la etiqueta de FABP4 en ratones para detectar progenitores indiferenciados30; mientras que los controles en este estudio (que consisten de células indiferenciadas) están desprovistos de tinción específica de FABP4. Esta partituras bajo la necesidad de comprobar la expresión FABP4 en undifferentiated progenitores en cada contexto biológico donde se emplea el ensayo.
Con el fin de establecer comparaciones válidas entre el etiquetado FABP4 y aceite rojo O manchas, las medidas de salida del análisis de imagen necesarios para ser biológicamente relevantes. En consecuencia, la medida, '% de células positivas' fue utilizada para FABP4, y "zona de coloración por la célula" fue utilizada para aceite rojo O. Cabe destacar que la medida «% de células positivas» no fue utilizada para aceite rojo O con las células en nuestro estudio, porque no era posible atribuir las gotitas gordas etiquetadas con precisión a un núcleo determinado; las gotitas de grasa variaban considerablemente en tamaño, número y distribución en todo el cuerpo de la célula y rara vez coincidía con el núcleo. Aceite rojo O manchas variabilidad existe entre las células derivadas de tejido diferentes fuentes; mientras que el % positivo células medida no era apropiado para el estudio actual, otro grupo lo ha utilizado con éxito para cuantificar adipocitos derivados de glándula humano células de vástago22 donde el aceite rojo O coloración apareció como una gotita de grasa grande que abarcó el citoplasma y comprometidos con los núcleos y datos que permite presentarse como % de células positivas.
En cambio, la morfología de FABP4 immunolabelling es consistente en los adipocitos derivadas de una variedad de tejido diferentes fuentes23,24,25. La capacidad de cuantificar la proporción de células dentro de una cultura capaz de diferenciación tiene un número de aplicaciones. Las células estromales mesenquimales adultas mantenga una promesa significativa para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas. Una cuestión importante que ha surgido con la traducción clínica es la variabilidad inherente en la capacidad de estas células entre pacientes26, entre sitios de aislamiento27,28y entre los métodos para el aislamiento de12 y ampliación de la celda número12 para uso terapéutico. Se ha demostrado previamente que las culturas de las células estromales adherentes son con frecuencia heterogéneas, con algunas células capaces de diferenciación y algunos no 12,17 como nuestro FABP4 ensayo muestra las culturas de la ASC. Estudios como este, combinado con técnicas de enriquecimiento, ayudará a identificar las subpoblaciones dentro de las culturas heterogéneas capaces de diferenciación linaje-específicas. Tener un análisis estandarizado y cuantificable como este ensayo FABP4 proporciona un método simple para la comparación entre todas estas variables y el potencial para evaluar los resultados terapéuticos dentro de y entre los ensayos clínicos.
La cuantificación de FABP4 de manera semiautomática permite objetividad y reproducibilidad en el análisis a través de muchos casos de donantes y muestras. Además la etiqueta es citoplasmática, puede potencialmente ser utilizado para analizar la hipertrofia (agrandamiento del tamaño del adipocito) además de hiperplasia (aumento en el número de adipocitos), una distinción que es de considerable importancia en la investigación de la obesidad, donde la hipertrofia es fuertemente asociada con la disfunción adiposa en personas obesas21. La epidemia de obesidad ha impulsado una gran cantidad de interés en la identificación de fármacos capaces de controlar el almacenamiento de lípidos. Este ensayo de FABP4 también proporciona una lectura sencilla para la detección de miles de compuestos por su capacidad inhibir la acumulación de lípidos.
Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Agradecemos a los donantes de los tejidos adiposo y los profesionales de la investigación que recogen y nos proporcionan este recurso para uso en investigación. Nos gustaría reconocer fondos por Allergan. También agradecemos a la Universidad de Auckland, Facultad de medicina y salud Ciencias Performance basado en investigación del fondo para la financiación de los gastos de videoing y edición para la presentación de este artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
