Summary
שיטות מסורתיות של הערכת בידול adipogenic זול, קל לשימוש, אך אינם ספציפיים על שינויים בביטוי הגנים. פיתחנו וזמינותו של לכמת mesenchymal תאית התמיינות לתוך בוגרת adipocytes באמצעות סמן שושלת היוחסין הספציפי. Assay הזה יש יישומים שונים ומגוונים ברחבי מחקר בסיסי ברפואה קלינית.
Abstract
מספר צבעים זמינים כעת עבור שימוש באיתור התמיינות של תאים mesenchymal לתוך adipocytes. צבע, כגון שמן אדום O, הם זול, קל לשימוש, שימוש נרחב על ידי מעבדות ניתוח הפוטנציאל adipogenic של תאים mesenchymal. עם זאת, הם אינם ספציפיים לשינויים שעתוק גנים. פיתחנו וזמינותו של גנים ספציפיים בידול לנתח כאשר תא mesenchymal החליף את גורלה השושלת adipogenic. Labelling חיסונית נגד חומצת שומן מחייב חלבון-4 (FABP4), סמן שושלת היוחסין הספציפי של בידול adipogenic, איפשרה ויזואליזציה, כימות של תאים. היכולת לכמת adipogenic פוטנציאל התמיינות של תאים mesenchymal בתבנית microplate טוב 96 השלכות מבטיח עבור מספר יישומים. מאות מחקרים קליניים לערב את השימוש למבוגרים תאי סטרומה mesenchymal, כיום קשה לתאם תוצאות טיפוליות בתוך ובין במיוחד כאלה ניסויים קליניים. Assay FABP4 פשוטה זו תפוקה גבוהה מספק assay כמותית להערכת פוטנציאל התמיינות של תאים נגזר החולה, הוא כלי חזקים לצורך השוואת שיטות בידוד והתרחבות. דבר זה חשוב במיוחד בהתחשב ההכרה הגוברת הטרוגניות של התאים המנוהל לחולים במוצרים תא mesenchymal. הבדיקה יש גם פוטנציאל השירות תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה, במיוחד במחקר השמנת יתר, סוכרת טרום.
Introduction
אחת מהדרישות מפתח שהוקם על ידי האגודה הבינלאומית עבור הסלולר טיפול (ISCT) להגדרת תא סטרומה mesenchymal multipotent הוא שיש התאים את היכולת להבחין לתוך adipogenic, osteogenic ו chondrogenic שושלות 1. שיטות קונבנציונליות של מדידה בידול לתוך שושלות שלושה אלה מסתמכים על הגילוי של מוצרים macromolecular באמצעות צבעם1. צבעים כגון O אדום שמן (אשר כתמי טיפות השומן בתאים שעברו adipogenesis), הם זול, קל לשימוש; עם זאת הם להיכשל לזהות את השינויים הספציפיים בביטוי הגנים להתרחש כאשר תאים mesenchymal להתמיין לכל שושלת היוחסין בהתאמה2. . הנה, פיתחנו וזמינותו של בידול אשר מכמתת ביטוי חלבון עבור סמן שושלת היוחסין הספציפי adipogenic, חומצת שומן מחייב חלבון-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 נמצאה בתחילה מאתר 3T3-L1 adipocytes3 , מאוחר יותר התגלה לבוא לידי ביטוי אנושי רקמת השומן התת עורית6. זה חלבון cytosolic, אשר משמש מלווה להנחות את ספיגת חומצות שומן על ידי תאים, ומעורב בתהליך lipolysis4.
התאים קודמן המשמש את מבחני בידול היו אדיפוז נגזר mesenchymal סטרומה תאים (השיקופיים)7,8. השיקופיים חולק תכונות רבות עם הנגזרות מח העצם בתאי גזע mesenchymal (מוניטור-MSCs), אוכלוסיה העיקריים של תא גזע mesenchymal מבוגרים8,9. השיקופיים מציעים כמה יתרונות על פני BM-MSCs ביישום קליני, כפי תשואה גדולה יותר של תאים ניתן לבודד רקמת נגיש בקלות רבה יותר מקורות8,9. אוכלוסיה תא מבודד צריך לעמוד בקריטריונים מסוימים כדי להיות מוגדר השיקופיים. ראשית, הם חייבים להראות הדבקות לכלי פלסטיק תרביות רקמה תנאים תרבות תקן1. הם גם חייבים להראות ביטוי אנטיגן פני שטח1. השיקופיים מחציתה מאופיינים על ידי ביטוי חיובי האנטיגנים CD34, CD73, CD90, ביטוי נמוך של CD105, ביטוי שלילי של CD45, הלע-ד ר10. השיקופיים מטוהרת על-ידי culturing פלסטיק במשך 28 ימים (מחסידי מטוהר השיקופיים) עולה ביטוי חיובי של CD73, CD90, CD105, ביטוי שלילי CD34, CD45, ד ר הלע10. לבסוף, תאים חייב לשמור על היכולת להתמיין שונים שושלות1,7,8.
Adipogenic בידול פרוטוקולים זירוז קולטנים upregulation מרשים של ביטוי FABP4 בין גנים השושלת adipocyte אחרים, כדי שנוכל להשתמש נוגדנים כדי להמחיש FABP4 חלבון תוך תאי, ואז לכמת FABP4 ביטוי ברמת תא בודד שימוש במיקרוסקופ אוטומטי הקרנה גבוהה-תוכן פלורסנט. בשיטה זו יש יתרון על צבעי מסורתי זה מאפשר אישור ספציפי מאוד בידול adipocyte-השושלת. מבחני היוחסין הספציפי כזה הגן בשילוב עם תכולה גבוהה הקרנת שיטות גם לאפשר כימות של חלקם של תאים בתוך הכנה תא הטרוגנית המסוגלים בידול למטה שושלת מסוימת. במחקרים שלנו השתמשנו וזמינותו FABP4 לאשר אובדן הפוטנציאל בידול adipogenic של השיקופיים טרי מבודד לאחר תרבית תאים.
Protocol
1. הכנת השיקופיים מבחני בידול
- הכנת תרביות רקמה ריאגנטים וטפל תאים חיים בשכונה תרביות רקמה סטרילי.
- להכין A0 בינוני: של Dulbecco ששינה נשר בינוני וחזיר F12 בינוני (DMEM/F12), 1 x glutamax, פניצילין x 1/סטרפטומיצין....
- להכין בינוני ASC מלאה: DMEM/F12, 1 x glutamax, פניצילין x 1/סטרפטומיצין, סרום שור עוברית 10%.
- שימוש מחסידי טהור השיקופיים, התרחב, בבקבוקון תרבות T75. לאשר את הטוהר של השיקופיים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS)10.
- ניתוק תאים על-ידי הסרת כל בינוני הבקבוק תרבות T75 והוספת 2 מ ל אנזים דיסוציאציה התא.
- להשאיר את הבקבוקון תרבות בחממה (37 ° C, humidified, 5% CO2) למשך 5-10 דקות. לקחת את הבקבוק תרבות מתוך החממה והקש בחוזקה בצד של הבקבוק. בדוק אם התאים יש מנותקת הבקבוקון תרבות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
- הוסף 13 מיליליטר A0 בינוני בקבוקון תרבות T75.
- להעביר 15 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של מדיום ASC מלאה.
- לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
- לדלל התליה תא כדי ריכוז של 25,000 mL תאים-1 בינוני ASC מלאה.
- להוסיף 200 µL A0 בינוני כל בארות הפריפריה של צלחת טוב 96 (בתחתית שטוח). זה מפחית את קצב אידוי הבארות המכיל תאים במרכז.
- העברת µL 200 של השעיה תא צלחת microwell כדי להשיג צפיפות תא הסופי של 5 x 103 תאים לכל טוב. מארבע בארות נדרשים עבור כל קבוצת הטיפול (חזרה טכנית triplicate, פקד נוגדן ראשוני אין עבור immunocytochemistry (ICC)).
- להשאיר צלחת microwell בחממה (37 מעלות צלזיוס, humidified, 5% CO2) עד תאים להגיע למפגש (3-4 ימים).
2. גרימת הבידול של השיקופיים
- הכן adipogenic בידול בינוני על ידי שכשהם בינוני עולה להשלים עם dexamethasome 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר אינסולין, 200 indomethacin מיקרומטר. המדיום התמיינות להשלים יציב-4 מעלות צלזיוס במשך חודש, ולכן רק וודא כנדרש עבור 1 וזמינותו. חנות ב 4 ° C, כאשר נדרש חום של aliquot ל- C ° 37 באמבט מים.
- לאחר 3-4 ימים, לקחת צלחת microwell מתוך החממה והחלף חצי של המדיום תרבות adipogenic בידול בינוני.
- לבצע שינוי בינוני כל 2-3 ימים.
הערה: בידול אופטימלי adipogenic דורש 14 ימי תרבות במדיום בידול. תאים הם נותחה באמצעות כתמי צבע מסורתי המבוסס וכתמים גנים ספציפיים.
3. צביעת עבור בידול - מבוסס צבען מסורתי כתמים
- להכין 4% פורמלדהיד פתרון על ידי דילול 16% פורמלדהיד עם PBS. לדלל רק את הסכום הדרוש עבור הניסוי ואת החנות בחוזקה חתום בשפופרת צנטרפוגה.
התראה: פורמלדהיד הוא חומר מסרטן אפשרי והוא יכול לגרום לגירוי על האף, הגרון והריאות על שאיפה. ביצוע כל ההליכים הנוגעים פורמלדהיד בשכונה fume. - להכין שמן אדום O מניות פתרון על ידי המסת 300 מ ג, 100 מ של אלכוהול איזופרופיל.
- לוקח את הצלחת microwell מתוך החממה. ניתן לבצע את הפעולות הבאות בסביבה שאינו סטרילי.
- הסר בינוני כל בארות ותקן תאים עם 4% פורמלדהיד למשך 30 דקות.
- בזמן הדגירה, להכין שמן אדום O הפתרון עובד. הפתרון עובד כוללת 6 מניות הנפט אדום O חלקים עם מים מזוקקים לארבעה חלקים (dH2O). מערבבים היטב ולתת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, לפני הסינון באמצעות יחידת מסנן מיקרומטר 0.2. עובד פתרון יציב רק עבור 2 h.
- להסיר כל פורמלדהיד בארות על-ידי pipetting.
- רחץ תאים פעם אחת עם 60% אלכוהול איזופרופיל ולתת שהבארות להתייבש לגמרי לפני שממשיכים.
- להוסיף 50 µL של הפתרון עובד שמן אדום O מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- הסרת שמן אדום O פתרון ולהוסיף מיד dH2O. לשטוף עם dH2O 4 פעמים לפני צפייה במיקרוסקופ אור.
4. צביעת עבור בידול - נוגדנים ספציפיים ג'ין
- להכין פתרון מניות של טריס buffered תמיסת מלח (TBS) על ידי המסת 80 גר' של NaCl, 2g של אשלגן כלורי ו 30 גרם של טריס לבסיס 1 ליטר של dH2O (pH 8). הכן הפתרון עובד על ידי דילול 1:10 באמצעות dH2חנות או בטמפרטורת החדר.
- הכנת immunobuffer (ליברות) (1% עוברית שור סרום (FBS) ב- TBS). תווית ברכבת התחתית צנטריפוגה 15 מ"ל עם תאריך ולאחסן ב 4 º C. ליברות יכול לשמש עבור שבוע 1 מתאריך גרם.
- להתכונן 0.25% קזאין חוסם על ידי המסת 0.5 g של קזאין ו- g 0.195 של אזיד הנתרן ב- 200 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS). נמסים לחלוטין את המרכיבים על ידי ערבוב בין לילה. Aliquot לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, חנות במקפיא-20 ° C. קזאין המופשרים פתרונות ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
- הכן דאפי פתרון על ידי דילול מניות 1:200 דאפי בחנות TBS. ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
- להכין פתרון תימרוסל מניות (10 מ ג מ ל-1) על ידי המסת תימרוסל ב- PBS סטרילי. לאחסן ב 4 ° C ו לדלל כמויות מתאימות ל 0.4 מ ג מ ל-1 לשימוש.
- לתקן, permeabilize תאים עם מתנול כקרח (צלחת טוב 96) עבור 5 דק תאים לשטוף פעם עם µL 200 של TBS.
- בלוק עם 50 µL של 0.25% קזאין בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ולשטוף פעם עם TBS.
- להוסיף 50 µL של נוגדנים העיקרי מעורבבת עם ליברות (ראה טבלה 1 לפרטים נוגדנים) דגירה בשלמותם סגורים 1 h.
- לשטוף פעם עם µL 200 של TBS ולאחר מכן 3 פעמים עם TBS למשך 5 דקות עם נדנדה עדין.
- להוסיף 50 µL של נוגדנים משניים מעורבבת עם ליברות (ראו טבלה 2 לפרטים נוגדנים) עם 1:2000 דאפי בכל אחד, דגירה בשלמותם סגור לרגל ה' 1 כיסוי לצלחת עם נייר כסף כדי למנוע הלבנת-צילום.
- תשטוף פעם אחת עם TBS, ולאחר מכן פעמיים עם TBS למשך 15 דקות עם נדנדה עדין.
- להסיר כל TBS ולהוסיף 200 µL של פתרון תימרוסל.
- חנות צלחת ב 4 ° C, מוגן מפני אור עד הדמיה.
5. הדמיה תאים באמצעות מיקרוסקופ תפוקה גבוהה
- לנתח את התאים צבעונית עם נוגדנים ספציפיים ג'ין, fluorophore מצומדת נוגדנים משניים (immunofluorescence) באמצעות מיקרוסקופ סינון תוכן גבוהה נשלט עם המלווה את התוכנה.
- לטעון את הצלחת microwell לשלב מיקרוסקופ. על הפקד רכישת צלחת, בחר את התמונה בהגדלה טווח בינוני (10 X עדשה המטרה). ודא תמונות נלקחים מן המרכז בכל טוב, עם 50 מיקרומטר המרווח בין כל אתר כדי להבטיח תא אחד זה לא מופיע בשני תחומים סמוכים.
- בחר הבארות לשיקוף.
- בחר את הערוץ המתאים שילובים, זמן החשיפה והפרמטרים היסט ה-z. עיין בטבלה 3 לקבלת מידע מפורט יותר של כל המסננים (משלים בטבלה 2).
- רוכשים את הבדיקה באמצעות אשף רכישה (התמונות מאוחסנות באופן אוטומטי לשרת מסד הנתונים).
- השתמש שילובים ערוץ חלופי לרכוש לוחות צבעונית עם שמן אדום או (משלים טבלה 3).
6. לנתח את התמונה נרכשת
הערה: גישה מרחוק מסד הנתונים של שרת מאפשר קלה ומהירה של תמונות רכשה והערכת השימוש בתוכנה ניתוח התמונה.
- פתוח תא הבקיע מודול על תוכנת ניתוח.
- גרעין התא באמצעות ערוץ דאפי (סמן גרעינית) ואת הגרעינים קטע של עניין עם המשתמש הגדיר פרמטרים עבור גודל ויוכל אות בעוצמה מעל הרקע.
- לאתר את האות FABP4 באמצעות ערוץ FITC. קטע תאים עם המשתמש הגדיר פרמטרים עבור גודל ו אות בעוצמה מעל הרקע לבחירת כל האיזורים חיובי FABP4 כל תמונה.
- מודול Transfluor פתוח על תוכנת ניתוח כדי לנתח צלחות צבעונית עם שמן אדום O...
- ציין את גודל העוצמה של שמן אדום O צבעונית אזורים כמו "בורות".
Representative Results
במחקר זה, נמדדו הפוטנציאל בידול adipogenic של השיקופיים עם 3 שיטות שונות. Labelling immunofluorescent של FABP4, הראה כי סמן זה מקומי אל הציטופלסמה של הבדיל תאים, תוויות חפפו גרעינים מתויג-דאפי (איור 1 א'). ניתוח התמונה האוטומטי גילה עלייה קיפול 24.6% של תאים FABP4 חיובית בקבוצה הבדיל בתאים מעבר מוקדם לעומת 6.9 קיפול עלייה בתאים מעבר מאוחר (איור 1B). שמן אדום O צביעת מקומי טיפות השמן הפזורים על ציטוזול תאים, לעיתים רחוקות תוויות חפפו מתויג דאפי גרעינים; אולם מבדיקה ויזואלית, יש פחות גרעינים תא הקשורים עם טיפות שמן שמן אדום O בתאים מעבר מאוחר בהשוואה לתאים מעבר מוקדם (איור 2 א). ניתוח התמונה האוטומטי גילה עלייה קיפול 11.1 באזור של שמן אדום O צביעת לכל התא בתאים מעבר מוקדם לבין עלייה קיפול 53.9 צביעת אזור בכל תא בתאים מעבר מאוחר (איור 2B). הדמיה של שני כתמי בוצע ולאחר מכן לכמת באמצעות תא הניקוד (FABP4) או Transfluor (שמן אדום O) מודול התוכנה (1 איור משלים, משלים שולחן 2-5). קולטנים upregulation של הביטוי FABP4 אושר ע י ניתוח תספיג (איור 3, משלים איור 5). כל שיטות ניתוח 3 העלתה בתחילת המעבר השיקופיים גבוה יותר בידול adipogenic פוטנציאליים יותר מאוחר מעבר תאים. הבידול adipogenic לא השפיע על המספר הכולל לכל טוב (משלים איור 2, 3). עם זאת, גודל גרעין של תאים FABP4-חיוביות הבדיל היה קטן באופן משמעותי יותר תאים שליטה למעבר מאוחר השיקופיים בלבד (משלים איור 3).
להדגים את זה כמו תאים מורחבת בתרבות, או passaged, האחוז של תאים בתוך התרבות מסוגל בידול adipogenic ירד, בקנה אחד עם נתונים שפורסמו בעבר11. חשוב לשים לב כי גורמים כמו גיל, אינדקס מסת הגוף או היסטוריה רפואית קודמת12 יכול לא להיות מבוקר על במחקר זה, סביר להניח תרמו ההשתנות שנצפה בין דגימות השונות תורם (משלים טבלה 1).
איור 1 : FABP4 immunolabelling מראה שיש תאים מעבר מוקדם יותר בידול פוטנציאליים יותר מאוחר יותר מעבר תאים. א) להחליפן בתמונות של מעבר מוקדם ומאוחר, שליטה, תאים עם דאפי (גרעיני כתם), FABP4 מוצגות לצד מיזוג ותמונות פילוח. פילוח להציג תמונות הבדיל תאים עם כיסוי ירוק ותאים מובחן עם כיסוי אדום. B) לעליה משמעותית FABP4 לבטא תאים נצפתה עם בידול adipogenic בתאים מעבר מוקדם ומאוחר, עם זאת, תאים מעבר מוקדם הפגינו גדול משמעותית עלייה בידול יותר מעבר מאוחר תאים (מאן ויטני מבחן * מציין P < 0.05 ו * * * מציין P < 0.001). הנתונים המוצגים הם הממוצע על פני מעבר מוקדם (p4; n = 8) או מעבר מאוחר (p10; n = 4) התורם דגימות, ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שמן אדום O צביעת מראה שיש תאים מעבר מוקדם יותר בידול פוטנציאליים יותר מאוחר יותר מעבר תאים. א) להחליפן בתמונות של דאפי (גרעיני כתם), שמן אדום O (בכתם האפור, droplet השומנים) מוצגים לצד מיזוג ותמונות פילוח. הדימויים פילוח מתארים את כל הגרעינים עם כיסוי ירוק, שמן אדום O צבעונית השומנים טיפות עם כיסוי אדום. B) עלייה משמעותית באזור מכתימים שמן אדום O נצפתה עם בידול adipogenic. בתחילת המעבר התאים הראה רבתי של כתם שמן אדום O בכל תא לעומת תאי המעבר מאוחר. האזור של שמן אדום O מכתים בכל תא (μm2) משמש כאן כאמצעי של בידול adipogenic פוטנציאליים. הנתונים המוצגים הם הממוצע על פני מעבר מוקדם (p4; n = 8) או מעבר מאוחר (p10; n = 4) התורם דגימות, ± SEM (מבחן מאן ויטני * מציין P = < 0.05 ו * * * מציין P = < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : תספיג ניתוח של רמת ביטוי חלבון FABP4 מעבר הבדיל מוקדם ומאוחר השיקופיים. ניתוח כמותי למחצה של הצפיפות האופטית של להקות FABP4 כיחס של חלבון הכולל טעינת פקד, ביתא אקטין (ACTB), הראה כי FABP4 immunolabelling היה משמעותי מוגברת מעבר מוקדם, מדרגה פחותה מאחרים מעבר הבדיל תאים. הנתונים המוצגים הם הממוצע על פני מעבר מוקדם (p4; n = 8) או מעבר מאוחר (p10; n = 4) התורם דגימות, ± SEM (מבחן מאן ויטני * מציין P = < 0.05 ו * * * מציין P = < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| אנטיגן מטרה | Isotype (שיבוט) | מינים | דילול |
| FABP4 | Polyclonal | ארנב | בטחונות |
טבלה 1: נוגדן ראשוני
| פילוח נוגדן | תווית Fluorophore | מינים | דילול |
| ארנב אג | אלקסה פטור 488 | עז | 1:200 |
טבלה 2: נוגדנים משניים
משלים איור 1: סקירה של הסביבה הוירטואלית של ניתוח תמונה. התאים מוכתם היו עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות, תפוקה גבוהה כדי להימנע מכל מקור של דעה קדומה. תמונות רכשה באמצעות ImageXpress מיקרו XLS, היו הציל ישירות למסד הנתונים של מנהל נתונים MDCStore, זמינים לצפייה דרך חיבורי שולחן עבודה וירטואלי, שבו משתמשים כדי למטב ולבדוק פרמטרים ספציפיים ניתוח שלהם. תמונות נותחו עם מופע ייעודי 'הפעלה אוטומטית', המאפשרת מרובות משתמשים שונים לשלוח 'משימות' לתור ההפעלה האוטומטית. משתמשים באפשרותך לאחזר את הנתונים שלהם באמצעות המופע וירטואלי לאחר השלמת העבודה שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 2: השוואה של סך תא ספירת לכל טוב של שליטה, הבדיל בארות למעבר מוקדם ומאוחר השיקופיים, באמצעות FABP4 צבעונית צלחת- הנתונים המוצגים הם הממוצע על פני מעבר מוקדם (p4; n = 8) או מעבר מאוחר (p10; n = 4) התורם דגימות, ± ב- SEM. היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין שליטה תאים למעבר גם מוקדמת וגם מאוחרת השיקופיים. היו יותר תאים לכל טוב עבור תאים מעבר מוקדם לעומת תאי המעבר מאוחר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 3: השוואה של סך תא ספירת לכל טוב של שליטה, הבדיל בארות למעבר מוקדם ומאוחר השיקופיים, באמצעות שמן אדום O צבעונית צלחת- הנתונים המוצגים הם הממוצע על פני מעבר מוקדם (p4; n = 8) או מעבר מאוחר (p10; n = 4) התורם דגימות, ± ב- SEM. היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין שליטה תאים למעבר גם מוקדמת וגם מאוחרת השיקופיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים באיור 4: תאים שהיו FABP4 חיובי מעברים מאוחר יותר, היה אזור גרעינים קטנים יותר באופן משמעותי מאשר תאים בבארות שליטה. בתחילת המעבר היה הבדל משמעותי סטטיסטית באזור גרעין שליטה בין תאים. הנתונים המוצגים הם הממוצע על פני מעבר מוקדם (p4; n = 8) או מעבר מאוחר (p10; n = 4) התורם דגימות, ± ב- SEM. (t אינטראקצית כשהילדים * * * מציין P = < 0.001). זאת אומרת ± SEM מוצגים.) אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 5: תמונות של ווסטרן כתם ג'לים. הערוץ האדום מתאר בטא-אקטין. הערוץ הירוק מתארת FABP4 immunolabelling. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים טבלה 1: Clinicopathological מידע של תורמים אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
משלים בטבלה 2: הדמיה הגדרות (FABP4) אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
משלים טבלה 3: הדמיה הגדרות (שמן אדום O) אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
משלים בטבלה 4: רשימת פרמטרים ניתוח שנעשה בהם שימוש (FABP4). תא מודול רישום נקודות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
משלים טבלה 5: טבלה של ניתוח פרמטרים שנעשה בהם שימוש (שמן אדום O). מודול טרנס עבור חיל הים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
Discussion
מאמר זה מדגים את השירות ואת היתרונות של FABP4 immunolabelling כדי לזהות ולכמת בוגרת adipocytes נגזר mesenchymal תאי סטרומה במדויק. FABP4 הוא מסוגל לזהות שינויים בביטוי של שושלת היוחסין חלבון ספציפי3,4,5 ב adipocytes בוגר, בניגוד השני נפוץ בשימוש צבעי איזה לייבל macromolecular משנה13,14 כגון שמן אדום O15, הנילוס אדום16 ו סודאן שחור17. FABP4 immunolabelling מאפשר הדמיה וניתוח של שינויים מורפולוגיה הסלולר. זהו יתרון ייחודי על השיטות שתוארו באמצעות שעתוק במהופך כמותיים PCR (RT-qPCR) מנתח שינויים ברמת התעתיק בלי שום ויזואלזציה5,18,19 ,20, או cytometry זרימה הדורשת התאים להיות השעיה20, או ווסטרן סופג את זה דורש תאים כדי להיות lysed כדי לבודד חלבון19,20. FABP4 immunolabelling יציב בתאים קבוע, לא ידלוף בתמיסה, להיות חלבון cytosolic כאשר בפורטוגלית של טפט חסיד של תאים, חפיפה עם גרעין המאפשר ויזואלזציה קל והוסיף הדיוק בניתוח אוטומטית.
הקרנה גבוהה-תוכן זה יתרון כי זה מהיר, מדויק, הדירים אובייקטיבית. הוא מספק פלטפורמה לשימוש חסכוני של ריאגנטים וזמן חוקר, מאז ייבוא תמונות וניתוח דורשות עיבוד ידני מינימלי ולהסתמך על עיבוד אוטומטי של המכשיר. מספר גורמים זוהו קריטי כדי הדיוק, מבחני הפארמצבטית בתום הקרנת גבוהה-תוכן31. כימות של אנטיגן ביטוי מסתמך על איכות התמונה. לניתוח תמונה מוצלחת, תמונות של כל אחד מערוצי לכל טוב חייב להיות בפוקוס ובסתיו בתוך טווח דינמי אופטימלית עבור ערכי אפור (הגדרות אוטומטית לחשוף אידיאליים). מתוך מיקוד או תמונות רוויות להוביל לתוצאות שגויות.
כמה מגבלות אפשריות של השיטות המתוארות במאמר זה כוללים את הבאים. הדרישה ציוד הדמיה ייעודיות ותוכנות אנליזה. בעוד שמחוץ להיקף של מאמר זה, אפשרויות לתוכנות קוד פתוח חלופי (לדוגמה, ImageJ32,33, פיג'י34,32,CellProfiler35) יכול לשמש לביצוע סגמנטציה דומה משימות; אולם הם דורשים את הכישורים כדי להוריד, חייט פקודות מאקרו זמין באינטרנט או לכתוב פקודות מאקרו/פקודות לצינורות ניתוח ספציפי שלהם. הטמון אוטומטית כל צינורות ניתוח ההדמיה היא רמה של רעש רקע. זה במידה רבה ניתן לייחס פסולת, שגיאה איכות או ניתוח תדמית, מדגישים את הצורך הכנת הדוגמא זהיר ולהגדרה זהיר של פלטפורמת הדמיה וניתוח. התווית FABP4 בעכברים נמצאה כדי לזהות אבות מובחן30; אמנם הפקדים במחקר זה (אשר מורכב של תאים מובחן) ללא צביעת FABP4 ספציפיים. זו לציונים הצורך בהכנסת FABP4 ביטוי מובחן אבות כל הקשר ביולוגי שבו מועסק וזמינותו.
כדי לצייר השוואות חוקי בין תוויות FABP4 O אדום שמן מכתים, המדידות פלט מניתוח התמונה צריך להיות רלוונטי מבחינה ביולוגית. כתוצאה מכך, המדידה, '% תאים חיוביים' שימש FABP4, 'אזור מכתים בכל תא' שימש שמן אדום O. ראוי לציין כי המדד '% תאים חיוביים' לא שימשו שמן אדום O מתויג תאים במחקר שלנו כי זה לא ניתן היה לייחס את טיפות השמן שכותרתה במדויק גרעין נתון; טיפות שומן שונות במידה ניכרת גודל, מספר והפצה, מעבר לגוף התא, לעיתים רחוקות חפפו הגרעין. O אדום שמן מכתים ההשתנות הקיים בין תאים ממקורות רקמות שונות; בזמן אחוז תאי מדידה לא היה מתאים לצורך המחקר הנוכחי, קבוצה נוספת השתמש בו בהצלחה לכמת adipocytes שמקורם בתאי גזע אנושיים בלוטת22 איפה ההכתמה שמן אדום O הופיע בתור אחד droplet שמן גדול אשר המורחב הציטופלסמה, חופף עם גרעינים ונתונים המאפשר להציג כתאי חיובי %.
לעומת זאת, המורפולוגיה של FABP4 immunolabelling הוא עקבי adipocytes נגזר מתוך מגוון של רקמות שונות מקורות23,24,25. היכולת לכמת את הפרופורציה של תאים בתוך תרבות מסוגל בידול יש מספר רב של יישומים. למבוגרים תאי סטרומה mesenchymal החזק ההבטחה משמעותי עבור מגוון רחב של שימושים טיפוליים. נושא משמעותי שקיבלנו עם תרגום קליני הוא ההשתנות הטמון בהיכולת של תאים אלה בין חולים26, בין אתרים של בידוד27,28, ובין שיטות בידוד12 והרחבה של התא מספרים12 לשימוש טיפולית. הוכח בעבר כי תרביות של תאים חסיד סטרומה הם לעתים קרובות הטרוגנית, בעל תאים מסוימים של בידול, חלקם 12,17 כמו שלנו FABP4 assay מדגים ASC תרבויות. מבחני כמו זה, בשילוב עם טכניקות העשרה, שיעזרו לזהות את תת אוכלוסיות בתוך מסוגל שושלת היוחסין הספציפי בידול הטרוגנית תרבויות. לאחר assay מתוקננת, הניתנות לכימות, כגון זו FABP4 assay מספק שיטה פשוטה לשם השוואה בין כל המשתנים הללו, ואת הפוטנציאל להעריך תוצאות טיפוליות בתוך ובין ניסויים קליניים.
כימות של FABP4 באופן אוטומטי למחצה מאפשר אובייקטיביות הפארמצבטית בניתוח מעבר התורם מקרים ודוגמאות רבות. יתר על כן כמו התווית cytoplasmic, זאת עלולה להיות בשימוש כדי לנתח היפרטרופיה (הגדלה של גודל adipocyte) בנוסף היפרפלזיה (עלייה במספר adipocyte), הבחנה זו חשיבות רבה במחקר השמנת יתר, איפה היפרטרופיה הוא קשור מאוד עם תפקוד לקוי של אדיפוז אנשים שמנים21. מגיפת ההשמנה הוא התיישר כמות משמעותית של עניין בזיהוי תרופות היכולים לשלוט אחסון שומנים בדם. זה וזמינותו FABP4 מספק גם הבדיקה פשוטה לסינון אלפי תרכובות על יכולתם לעכב הצטברות שומנים בדם.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה תורמים של רקמות adipose ומומחי מחקר מי לאסוף ולספק משאב זה לנו לשימוש מחקר ברצוננו להודות מימון תמיכה על ידי Allergan. אנו אסירי תודה גם אוניברסיטת אוקלנד, הפקולטה הרפואה, בריאות מדעי ביצועים מבוסס מחקר קרן למימון העלות של השני ועריכה להגשת מאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
