Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए आक्रामक aspergillosis के साथ चूहों में फुफ्फुसीय कवक बोझ निर्धारित करने के लिए है Gomori संशोधित methanamine ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में दाग चांदी के ठहराव द्वारा । इस विधि का उपयोग कम पशुओं के साथ तुलनीय परिणाम के परिणामस्वरूप कवक बोझ के आकलन की तुलना में फेफड़ों कवक डीएनए की मात्रात्मक पीसीआर ।
Abstract
फेफड़े कवक बोझ के ठहराव फेफड़े कवक संक्रमण के माउस मॉडलों में प्रतिरक्षा सुरक्षा और कवक डाह के सापेक्ष स्तर के निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि कई तरीकों कवक बोझ का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (कवक डीएनए के qPCR) पिछले संस्कृति पर कई फायदे के साथ एक तकनीक के रूप में उभरा है आधारित तरीकों । वर्तमान में, फेफड़ों की विकृति का एक व्यापक आकलन, ल्युकोसैट भर्ती, कवक बोझ, और आक्रामक aspergillosis के साथ चूहों में जीन अभिव्यक्ति (IA) प्रयोगात्मक और नियंत्रण जानवरों की एक महत्वपूर्ण संख्या का उपयोग आवश्यक. यहां फेफड़ों ऊतकवैज्ञानिक के ठहराव को कवक बोझ पशुओं की एक कम संख्या का उपयोग निर्धारित करने के लिए विस्तार से जांच की थी । फेफड़ों के वर्गों के लिए है Gomori संशोधित methanamine चांदी (ग्राम) धुंधला के साथ कवक संरचनाओं की पहचान दाग रहे थे । छवियों को ग्राम से लिया गया था-एक formalin के 4 असतत क्षेत्रों से दाग वर्गों-फिक्स्ड आयल-फेफड़े एंबेडेड । प्रत्येक छवि के भीतर ग्राम दाग क्षेत्रों quantified एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग कर रहे थे, और इस ठहराव से, दाग क्षेत्र का मतलब प्रतिशत प्रत्येक नमूने के लिए निर्धारित किया गया था । इस रणनीति का प्रयोग, eosinophil की कमी चूहों की कमी कवक बोझ और caspofungin चिकित्सा के साथ रोग का प्रदर्शन, जबकि IA के साथ जंगली प्रकार चूहों caspofungin के साथ सुधार नहीं किया । इसी तरह, γδ टी कोशिकाओं की कमी चूहों में कवक बोझ भी caspofungin द्वारा सुधार किया गया, के रूप में qPCR और ग्राम ठहराव द्वारा मापा. ग्राम ठहराव इसलिए सापेक्ष फेफड़ों कवक बोझ के निर्धारण के लिए एक विधि के रूप में शुरू की है कि अंततः प्रयोगात्मक इनवेसिव aspergillosis के व्यापक अध्ययन के लिए आवश्यक पशुओं की मात्रा कम हो सकती है ।
Introduction
आइए एक अवसरवादी संक्रमण है कि अतिसंवेदनशील व्यक्तियों में जन्मजात के साथ विकसित हो सकता है या प्रतिरक्षा दमन चिकित्सा या जीर्ण संक्रमण के कारण इम्यून की कमी1,2. प्राथमिक संक्रमण अक्सर फेफड़ों में होता है, हालांकि जिगर, गुर्दे, दिल, और मस्तिष्क के लिए Aspergillus fumigatus के कुछ उदाहरणों के प्रसार में हो सकता है, गंभीर रोग और उच्च के साथ hyphae के व्यापक ऊतक आक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर1,2। इसके अलावा, मौजूदा pharmacotherapies की प्रभावकारिता सीमित है, और आगे के वातावरण में रोधी प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव के द्वारा कमजोर हो सकता है3. इसलिए कवक डाह और मेजबान विकृति है कि विकास या आक्रामक कवक रोग के गहरा को बढ़ावा देने के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।
Murine मॉडल यंत्रवत IA अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण रहते हैं, के रूप में वे की स्थापना और vivo4,5 में A. fumigatusकी वृद्धि के लिए कवक डाह जीन और मेजबान प्रतिरक्षा प्रभाव की भूमिकाओं का आकलन करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति । नतीजतन, कई रणनीतियों के लिए प्रभावी ढंग से यों तो या प्रयोगात्मक पशुओं के समूहों में कवक बोझ की तुलना करने के लिए तैयार किया गया है6,7। इन रणनीतियों को शामिल संस्कृति आधारित, जैव रासायनिक, immunoassay, या qPCR तरीकों, अलग फायदे और नुकसान के साथ एक । इसके अलावा, इन तरीकों में से प्रत्येक प्रतिरक्षा प्रभाव समारोह के आकलन के लिए बलिदान उन लोगों के अलावा पशुओं का एक सबसेट के समर्पण शामिल, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, और तुलनात्मक histopathology7। इस प्रकार, व्यापक IA अध्ययन अक्सर एक महत्वपूर्ण कीमत पर अनुसंधान पशुओं की महत्वपूर्ण संख्या की आवश्यकता है । प्रभावी रणनीति है कि प्रयोगात्मक समय, पशु लागत को कम करने, और कई विश्लेषण के लिए पशु ऊतकों का उपयोग करके नैतिक विचार इसलिए बहुत मूल्यवान है7।
इस रिपोर्ट में, एक विधि का वर्णन ठहराव के साथ चूहों के प्रयोगात्मक समूहों के बीच रिश्तेदार कवक बोझ की तुलना के लिए ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में दाग की शुरुआत की है । कवक संस्कृति से संक्रमण के लिए हर कदम, ऊतक फसल और प्रसंस्करण, और छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण, विस्तार से वर्णन किया गया है । ग्राम ठहराव द्वारा प्राप्त कवक बोझ ia के neutropenic मॉडल में qPCR के साथ तुलना की गई थी, और ia8के साथ caspofungin-इलाज जंगली-प्रकार या eosinophil की कमी चूहों में । परिणाम ग्राम ठहराव और कवक डीएनए के qPCR के साथ समानता दिखा । यह पता चलता है कि ग्राम ठहराव ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण में लगे शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है एक पूरक या वैकल्पिक विधि के रूप में चूहों में रिश्तेदार कवक बोझ की तुलना के IA के साथ, और अंततः लागत और अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को कम कर सकते हैं कॉम्प्लेक्स, यंत्रवत स्टडीज.
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं इंडियाना राज्य विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति, इंडियाना विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन के मेजबान परिसर-टेरे फैशन द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. संक्रमण के लिए ए. fumigatus Conidia की तैयारी
- एक अच्छी तरह से हवादार धुएं डाकू में काम करते हुए, ए. fumigatus के 125 µ एल जोड़ने के लिए 900 µ एल सेल संस्कृति ग्रेड पानी (CCGW) के लिए 293 स्टॉक समाधान । फिर समाधान माल्ट निकालने आगर (मेे) प्लेट पिपेट के माध्यम से स्थानांतरण और एक inoculating लूप के साथ समान रूप से फैल गया ।
- 24 डिग्री सेल्सियस से कम 14 दिनों के लिए और 28 दिन से अधिक समय तक अंधेरे में फफूंद की प्लेट को स्टोर करें ।
- हार्वेस्ट conidia कांच मोतियों का उपयोग कर के रूप में पहले9वर्णित है ।
- प्लेट पर 0.5 मिमी गिलास मोतियों की 1.5 जी डालो और धीरे से इसे आगे पीछे झुकाव जब तक मोतियों के लिए conidia निकालने के लिए लेपित हैं । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मनका/conidia मिश्रण ले लीजिए । 5 मिलीलीटर Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (DPBS) और भंवर में सस्पेंड ।
- एक hemocytometer का उपयोग DPBS में supernatant के एक 50x कमजोर पड़ने में conidia गिनती । आरेख 1 में दिखाए गए क्षेत्र में conidia की संख्या गिनना और एकाग्रता की गणना करने के लिए समीकरण 1 का उपयोग करें ।
#Conidia × कमजोर पड़ने कारक × 104= Conidia/एमएल (समीकरण 1)
नोट: समीकरण 1में #Conidia के रूप में उपयोग किए गए इन क्षेत्रों के माध्य के साथ अतिरिक्त 4 x 4 वर्ग कोने क्षेत्रों को गिना जा सकता है ।
चित्रा 1: conidia गिनती (बॉक्स, तीर) के लिए इस्तेमाल किया Hemocytometer प्रतिनिधि क्षेत्र.
- वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ खारा (DPBS) के साथ conidia निलंबन पतला, 1.0 x 108 conidia/5 x 106 conidia/µ एल के साथ संक्रमण के लिए 50 µ एल तैयार करें प्रति ' n + 2 ' चूहों को conidia के लिए खाते में संक्रमित होने के लिए pipetting समाधान त्रुटि.
नोट: मानक कवक फसल और तैयारी/छानने का काम वैकल्पिक रूप से10किया जा सकता है । कांच मनका विधि सबसे अच्छा है कि ंयूनतम छोटे/घुलनशील hyphal एंटीजन के साथ conidia नमूनों आकांक्षा के लिए प्राप्त कर रहे है सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
2. प्रतिरक्षादमन और Murine मॉडल का संक्रमण
- 7-10-हफ्ते पुराने चूहों का प्रयोग करें ।
नोट: बालब/c, C57BL/6 (B6), eosinophil-आपुर्ति (ΔdblGATA, बालब/c पृष्ठभूमि), और γδ T कोशिका की कमी (TCRδ-/-, बी-6 पृष्ठभूमि) चूहों का उपयोग इस अध्ययन के लिए किया गया. प्रत्येक प्रयोग के लिए, आयु और लिंग-मिलान (दोनों पुरुषों और महिलाओं) चूहों प्रत्येक समूह के लिए इस्तेमाल किया गया । - चूस न्यूट्रोफिल वाया intraperitoneal (आईपी) 0.1 मिलीलीटर का इंजेक्शन (0.5 मिलीग्राम) विरोधी माउस--6G एंटीबॉडी बाँझ खारा में 45 डिग्री में पार्श्व निचले सही वृत्त का चक्र में (एक प्रयोगात्मक अनुसूची के लिए, देखें चित्रा 2) ।
- 24 एच बाद में, के साथ आकांक्षा द्वारा संक्रमित चूहों 5.0 x 106ए. fumigatus conidia 50 µ l बाँझ खारा में निलंबित (चरण 2.4-2.10 देखें) पहले वर्णित के रूप में11. संक्रमण के बाद, इस अध्ययन में प्रयुक्त DPBS में 5 मिलीग्राम/kg caspofungin diacetate जैसे रोधी एजेंट के साथ जानवरों का एक सबसेट इंजेक्ट करें (दैनिक, चित्र 2देखें) ।
- 99.9% isoflurane के साथ Anesthetize चूहों एक पशु चिकित्सा संज्ञाहरण मशीन का उपयोग कर ।
- मल और मूत्र को पकड़ने के लिए प्रेरण चैंबर के फर्श पर एक कागज तौलिया प्लेस ।
- प्रेरण कक्ष में माउस प्लेस, ढक्कन सुरक्षित, और 2 मिनट और 30 एस के लिए 5% isoflurane के लिए vaporizer सेट ।
नोट: पशु चिकित्सक मरहम उपयोग नहीं किया है क्योंकि संज्ञाहरण के तहत कुल समय से कम 5 मिनट है । - 30 s के लिए अधिकतम सेटिंग के आधे से vaporizer को कम करें ।
- पुष्टि करें कि माउस को ठीक से देख रहा है धीमा श्वास, आंदोलन की कमी, और पैर की अंगुली-चुटकी उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया की कमी से anesthetized ।
- एक तिरछा बोर्ड पर प्रेरण चैंबर और जगह से माउस निकालें. बोर्ड के खिलाफ अपनी पीठ के साथ माउस प्लेस । सुनिश्चित करें कि इसके ऊपरी कृन्तक धीरे एक रबर बैंड के साथ नियंत्रित कर रहे है और कम कृन्तक धीरे एक धातु तार के साथ रोका ।
- ध्यान से जीभ के आधार पर छोटे संदंश और पिपेट के 50 µ एल के साथ पूर्ण विस्तार पर पकड़ conidia/
- पूर्ण विस्तार पर जीभ पकड़ो; तेजी से सांस लेने और आकांक्षा के विशिष्ट क्लिक शोर के लिए सुनो । 20 एस के लिए पकड़ो या जब तक निलंबन पूरी तरह से aspirated है ।
- तिरछा बोर्ड से माउस निकालें और अवलोकन के लिए एक पिंजरे में धीरे से जगह ।
- आकांक्षा के बाद, माउस 1 मिनट के भीतर चेतना हासिल करना चाहिए । पूरी तरह से होश में और पिंजरे के आसपास चलने में सक्षम जब तक माउस की निगरानी । जानवरों को 21 डिग्री सेल्सियस पर घर में रखा जाना चाहिए और दो बार प्रतिदिन की निगरानी जब तक फेफड़ों काटा जाता है ।
- दोहराएं न्यूट्रोफिल की कमी (कदम 2.2) 24 एच के बाद संक्रमण (चित्रा 2) ।
चित्रा 2: प्रयोगात्मक अनुसूची. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8से संशोधित किया गया था ।
3. फसल और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए माउस फेफड़ों का संरक्षण
- गहरा anesthetize के 0.1 मिलीलीटर की एक घातक खुराक के साथ पशु 390 मिलीग्राम/एमएल pentobarbital सोडियम समाधान आईपी ।
- सहज श्वास और चिमटी के साथ अंग उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया के अभाव की कमी को देख कर इच्छामृत्यु की पुष्टि करें । एक बार euthanized, बंध्याकरण करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ लोथ स्प्रे ।
- एक फोम बोर्ड एक शोषक पैड के साथ कवर पर लोथ प्लेस ।
नोट: लोथ फोम बोर्ड के लिए सभी चार अंगों को सुरक्षित पिन के साथ अपनी पीठ पर रखा जाना चाहिए. - ऊपरी छाती गुहा खुले सावधानी के साथ कैंची का उपयोग । रिब पिंजरे दूर काटने के क्रम में फेफड़ों और दिल को बेनकाब करने के लिए । छिड़काव के लिए अनुमति देने के लिए अवर वेना कावा को काटें । रक्त वाहिकाओं और puncturing अंगों को काटने से बचें ।
- धीरे दिल के दाहिने निलय में एक 25-जी सुई के साथ एक 45 ° कोण पर ठंड DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ perfuse । छिड़काव को 10% formalin के 5 मिलीलीटर के साथ दोहराएं ।
- ध्यान से श्वासनली बेनकाब और आसपास के वसा पैड अलग । सावधानी का प्रयोग करें और श्वासनली puncturing से बचें । अधिक संयोजी ऊतक सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से आगे बढ़ने से पहले श्वासनली कल्पना करने के लिए हटा दिया जाता है । एक बार श्वासनली के सामने आ जाए तो श्वासनली के नीचे जगह संदंश उसे तरक्की के लिए.
- प्रहार एक 25-जी सुई का उपयोग कर ऊपरी श्वासनली में एक छोटे से छेद ।
नोट: होल इतना है कि पूरे प्रवेशनी श्वासनली में फिट बैठता है तैनात किया जाना चाहिए । श्वासनली को rupturing से बचने के लिए सावधानी बरतें । - छेद के माध्यम से और फेफड़ों की ओर एक प्रवेशनी डालें । एक शल्य श्वासनली के आसपास ढीला बंधे धागे के साथ प्रवेशनी सुरक्षित ।
नोट: यदि श्वासनली टूटना है, प्रवेशनी श्वासनली पिछले airway में जहाँ तक संभव हो सम्मिलित किया जा सकता है । - एक सिरिंज का प्रयोग, प्रवेशनी के माध्यम से 10% formalin बफर के 1 मिलीलीटर के साथ फेफड़ों फुलाना । सुनिश्चित करें कि फेफड़ों की मुद्रास्फीति दिखाई दे रही है । यदि नहीं, कैथेटर और दोहराने को समायोजित करें । एक बार फेफड़ों फुलाया, जल्दी से सावधानी के साथ प्रवेशनी निकालें और श्वासनली बंद सील करने के लिए सुरक्षित रूप से धागा कस ।
नोट: यदि श्वासनली टूटना और फेफड़ों फुलाया नहीं जा सकता है, फेफड़ों अभी भी काटा जा सकता है लेकिन यह उचित निर्धारण को रोकने सकता है । - धीरे से श्वासनली और फेफड़ों को ध्यान से छाती से दूर संदंश के साथ श्वासनली के संयोजी ऊतक तोड जबकि धीरे धागे पर खींच । फेफड़ों और श्वासनली को 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10% formalin बफर की 15 मिलीलीटर के साथ रखें । ट्यूब के बाहर धागा के एक छोर प्लेस और टोपी सील । ट्यूब पलटना पूरी तरह से नमूने को निर्धारण में जलमग्न ।
- कमरे के तापमान पर नमूनों को कम से 24 घंटे के लिए या आगे की प्रोसेसिंग तक स्टोर करे ।
सावधानी: Formalin खतरनाक है । चश्मे और एक चेहरा मुखौटा सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें । नमूने प्रसंस्करण जब एक रासायनिक डाकू के तहत काम करते हैं ।
4. फसल और डीएनए कवक बोझ के लिए माउस फेफड़ों के संरक्षण
- एक अलग माउस पर वर्णित के रूप में 3.1-3.5 चरणों का पालन करें ।
- एक 25-जी सुई के साथ एक 45 डिग्री के कोण पर दिल की सही निलय में ठंडी DPBS के 10 मिलीलीटर के साथ धीरे perfuse ।
- आबकारी के साथ फेफड़ों में कैंची और जगह में 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों लेबल ।
- आगे प्रसंस्करण तक-80 डिग्री सेल्सियस पर फेफड़ों की दुकान ।
- मानक तकनीकों का उपयोग के रूप में वर्णित (embedding और अनुभाग) और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
5. माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग
- इमेजिंग ठहराव प्रोग्राम खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, ग्राम सना हुआ स्लाइड (10x उद्देश्य) के कम से 4 अलग क्षेत्रों प्राप्त करते हैं । सुनिश्चित करें कि छवियों के समान ऊतक घनत्व के साथ फेफड़ों के भीतर संक्रमित एयरवेज के प्रतिनिधि हैं ।
नोट: अगर घनत्व और वितरण hyphal घावों के नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच स्पष्ट रूप से अलग दिखाई देते हैं, अतिरिक्त क्षेत्रों लिया जा सकता है, या पूरे फेफड़ों अनुभाग के ग्राम क्षेत्र imaged किया जा सकता है (4x उद्देश्य) । फेफड़े के एक ही क्षेत्रों की छवियों को प्राप्त (समकक्ष ऊतक आकृति विज्ञान द्वारा की पहचान) एक धारावाहिक फेफड़ों की धारा पर दाग hematoxylin और eosin के साथ, यदि वांछित । - जहां आवश्यक छवियों को स्केल बार्स जोड़ें और छवियों को बचाने के लिए quantified हो । चुनें, संपादित करें > जोड़ें/संपादित करें अंशांकन चिह्न > मेनू: लाइन मोटाई, रंग और पैमाने बार आकार चुनें > जहां पैमाने बार रखा जाना है के लिए छवि पर क्लिक करें । मेनू बंद और चुनें, संपादित करें > विलय > अंशांकन चिह्न विलय > फ़ाइल के रूप में सहेजें चुनें > फ़ाइल नाम और सहेजें पर क्लिक करें ।
6. एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करने के लिए कवक बोझ की गणना (चित्रा 3)
- छवि संसाधन प्रोग्राम खोलें । फ़ाइल का चयन करें > मात्रा के नमूनों के साथ फ़ोल्डर > छवि (चित्र 3ए) । छवि का चयन करें > प्रकार > "आरजीबी स्टैक" (चित्र बी) में कन्वर्ट.
- तीन दिए गए चित्र (चित्र बी) के दूसरे का चयन करने के लिए दायां तीर कुंजी का उपयोग करें । "थ्रेसहोल्ड" मेनू सेटिंग्स समायोजक (चित्र 3सी) को लाने के लिए "नियंत्रण + shift + T" मारो. मूल. tiff या. jpg छवि को संदर्भ के रूप में ढूंढें और एक छवि दृश्य प्रोग्राम (चित्र 3 c) के साथ खोलें ।
- शीर्ष स्लाइडर को छोड़ दिया करने के लिए सभी तरह खींचो और नीचे स्लाइडर समायोजित जब तक क्षेत्र (लाल में) चयनित माइक्रोस्कोपी छवि का प्रतिनिधि है (आमतौर पर 130-160 से लेकर के रूप में स्लाइडर के दाईं ओर संकेत (चित्र 3सी).
- एक बार चयनित, प्रेस "सेट" > "ठीक है" (चित्रा 3 डी) । का चयन करें "विश्लेषण" > "सेट माप" > चेक "क्षेत्र, क्षेत्र अंश, सीमा, प्रदर्शन लेबल" और नीचे सेटिंग्स छोड़ (ड्रॉप डाउन मेनू और दशमलव स्थानों) के रूप में डिफ़ॉल्ट > "ठीक है" (चित्रा 3 डी).
- सफेद अंतरिक्ष या पृष्ठभूमि धुंधला के महत्वपूर्ण क्षेत्रों में एक क्षेत्र या बहुभुज उपकरण के साथ उपयुक्त ऊतक के चयन से बाहर रखा जा सकता है ।
- अंत में, का चयन करें "विश्लेषण" > "माप" (डेटा के साथ एक विंडो प्रकट करना चाहिए, या windows कार्यपट्टी पर एक टैब लेबल दिखाई देगा, "परिणाम") (चित्रा 3E) । ग्राफ़िंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा को डेटा विश्लेषण प्रोग्राम में स्थानांतरित करें ।
- प्रत्येक फेफड़ों के नमूने के लिए चार क्षेत्र प्रतिशत का मतलब दर्ज करें । ५-८ नमूने समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए सामान्यतः पर्याप्त होते हैं. यदि दो प्रयोगात्मक समूहों की तुलना, एक ख़राब छात्र का t-परीक्षण करने के लिए महत्व निर्धारित करते हैं ।
चित्रा 3: ग्राम ऊतकवैज्ञानिक क्षेत्र ठहराव के प्रत्येक चरण के लिए प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट । (A) फ़ाइल का चयन करें > नमूने के साथ फ़ोल्डर यों तो > छवि का चयन करें । (B) छवि चुनें > प्रकार > "RGB स्टैक" में कनवर्ट करें । तीन दिए गए चित्रों का दूसरा चयन करने के लिए दायां तीर कुंजी का उपयोग करें । (ग) "थ्रेशोल्ड" मेनू सेटिंग समायोजक को लाने के लिए "नियंत्रण + shift + T" को दबाएं । मूल. tiff या. jpg छवि को एक संदर्भ के रूप में ढूंढें और फ़ोटो व्यूअर प्रोग्राम के साथ खोलें । खींचें शीर्ष स्लाइडर सभी तरह से छोड़ दिया और नीचे स्लाइडर समायोजित जब तक क्षेत्र (लाल में) चयनित माइक्रोस्कोपी छवि का प्रतिनिधि है (आमतौर पर 130-160 से लेकर के रूप में स्लाइडर के अधिकार के लिए संकेत । (D) एक बार चयनित प्रेस "सेट" > "ठीक है" । का चयन करें "विश्लेषण" > "सेट माप" > चेक "क्षेत्र, क्षेत्र अंश, सीमा, प्रदर्शन लेबल" और नीचे सेटिंग्स (ड्रॉप डाउन मेनू और दशमलव स्थानों) के रूप में डिफ़ॉल्ट > "ठीक है" छोड़ दें । (E) अंत में "विश्लेषण" > "माप" (डेटा के साथ एक विंडो प्रकट करना चाहिए, या windows कार्यपट्टी पर एक टैब "परिणाम" लेबल दिखाई देगा) का चयन करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
7. डीएनए फंगल बोझ
- से फेफड़ों को दूर-80 ° c और lyophilize से कम 4 घंटे के लिए (रातोंरात इष्टतम है) या जब तक पूरी तरह से एक फ्रीज शुष्क प्रणाली द्वारा सूख ।
- फेफड़ों सूख रहे हैं, तो डीएनए निष्कर्षण बफर तैयार (0.1 M NaCl, 10 मिमी EDTA पीएच 8.0, 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.0, और 0.5% एसडीएस).
- तैयार डीएनए निष्कर्षण बफर में एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए पूर्व गर्म प्लेस । इसके अलावा, प्लेस phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (25:24:1) एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में और जुदाई के लिए अनुमति देते हैं ।
- ग्लास मोतियों की 0.2 मिलीलीटर के साथ एक 2-एमएल पेंच कैप ट्यूब में lyophilized फेफड़ों रखें । एक मनका डिब्बा का प्रयोग, 15-30 एस के लिए सूखी फेफड़ों के ऊतकों पीस जब तक यह एक ठीक पाउडर रूपों ।
- जोड़ें 0.8 मिलीलीटर गर्म डीएनए निष्कर्षण बफर प्रत्येक ट्यूब और भंवर के लिए अच्छी तरह से । एक 65 डिग्री सेल्सियस मनका स्नान में 15 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब और फिर एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए मशीनिंग से पहले भंवर । बाद में, भंवर और फिर 10 मिनट के लिए 25,000 x जी में ट्यूब केंद्रापसारक ।
- लेबल नमूनों में से प्रत्येक के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के 3 सेट और ट्यूबों के एक सेट में supernatant के शीर्ष परत हस्तांतरण । सावधानी का प्रयोग करें, जबकि जलीय शीर्ष परत बाहर pipetting बीच परत परेशान से बचने के लिए ।
- phenol के बराबर मात्रा जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: isoamyl अल्कोहल और मिश्रण अच्छी तरह से । तो 15 मिनट के लिए 25,000 x जी में केंद्रापसारक बाहर ट्यूबों के दूसरे सेट में ऊपरी परत pipetting से पहले ।
- क्लोरोफॉर्म के बराबर मात्रा जोड़ें: isoamyl क्लोरोफॉर्म, अच्छी तरह से मिश्रण है, और 10 मिनट के लिए 25,000 एक्स जी में केंद्रापसारक । ध्यान से ट्यूबों के तीसरे सेट में ऊपरी परत बाहर पिपेट ।
- isopropanol और 50 µ एल NaoAc (पीएच 5.2) के 500 µ एल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और नमूने 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन के लिए अनुमति देते हैं । तो 30 मिनट और खिचड़ी भाषा के लिए 25,000 x जी में supernatant ।
- बर्फ ठंडा 70% इथेनॉल के 750 µ एल के साथ डीएनए गोली धोने और 5 मिनट के लिए $25,000 में एक्स जी खिचड़ी भाषा इथेनॉल और अनुमति देने के लिए छर्रों 40 मिनट के लिए एक धुएं डाकू में ट्यूबों में शुष्क हवा ।
- ते बफर के 300 µ l में सूखी छर्रों reसस्पेंड.
नोट: डीएनए quantified तक-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - एक spectrophotometer का उपयोग करते हुए डीएनए को बढ़ाता है और qPCR विश्लेषण के लिए प्रत्येक डीएनए नमूने के 0.2 µ g/µ l के 100 µ l तैयार करें ।
- पहले वर्णित के रूप में तपसिल में एक मानक qPCR प्रदर्शन डीएनए नमूने के 1 µ जी के साथ, फफूंद 18S rDNA प्राइमर, और जांच सेट के साथ एक संशोधित जांच शमनकर्ता (5 '-/56-FAM/AGC सीएजी CGG/ज़ेन/सीसीसी जीसीए AAT G/3IABkFQ/-3 ')12,13.
- ए. fumigatus जीनोमिक डीएनए से एक मानक वक्र तैयार करें और औसत रिपोर्टर डाई सीटी मूल्यों का उपयोग कर प्रत्येक नमूने में स्नातकोत्तर में कवक डीएनए की एकाग्रता की गणना ।
- माध्य की मानक त्रुटि के साथ फंगल डीएनए के pg/µ g प्लाट । महत्व निर्धारित करने के लिए विद्यार्थी का t-परीक्षण विश्लेषण करें ।
नोट: phenol-क्लोरोफॉर्म डीएनए निष्कर्षण के लिए एक कम विषाक्त विकल्प के रूप में यहां इस्तेमाल किया, कॉलम आधारित डीएनए निष्कर्षण किट इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Representative Results
चित्रा 4 caspofungin के साथ इलाज IA के साथ जंगली प्रकार या eosinophil की कमी चूहों के अस्तित्व का एक ग्राफ भी शामिल है । परिणाम बताते हैं कि eosinophil की कमी चूहों जब जंगली प्रकार चूहों की तुलना में वृद्धि हुई जीवित रहने की प्रदर्शनी (50% मृत्यु दर बनाम 100% मृत्यु दर, क्रमशः). चित्रा 5 प्रतिनिधि ग्राम neutropenic से दाग से पता चलता है जंगली प्रकार और eosinophil के साथ चूहों की कमी-IA इलाज या caspofungin के साथ इलाज किया । Caspofungin उपचार eosinophil में रिश्तेदार कवक निकासी में हुई कमी है, लेकिन नहीं जंगली प्रकार चूहों (सही पैनलों), जबकि दोनों समूहों है कि Caspofungin प्राप्त नहीं किया समान थे (बाएं पैनलों) । चित्रा 6 caspofungin-इलाज में कवक बोझ की तुलना से पता चलता है और इलाज जंगली प्रकार या eosinophil की कमी चूहों, कवक डीएनए के दोनों qPCR (चित्रा 6A) और 4 के प्रतिनिधि ग्राम ठहराव का उपयोग (10x उद्देश्य) क्षेत्रों ( चित्रा घमण्ड). दोनों तकनीकों से उत्पंन परिणामों से पता चलता है कि सबसे महत्वपूर्ण कवक बोझ में caspofungin उपचार के परिणाम जंगली प्रकार और eosinophil की कमी चूहों के बीच कमी (चित्रा 6A) । हालांकि, अनुपचारित चूहों में, केवल ग्राम ठहराव चूहों की कमी इयोस्नोफिल्स (चित्रा घमण्ड) में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप. जब पूरे फेफड़ों ग्राम के माध्य क्षेत्र-दाग वर्गों (4x उद्देश्य) की गणना की गई, मतभेद 4 प्रतिनिधि 10x क्षेत्रों के साथ प्राप्त परिणामों के समान थे, हालांकि कम सांख्यिकीय महत्व के साथ (चित्रा 6C) । चित्रा 7 अस्तित्व, प्रतिनिधि ग्राम धुंधला (4 10x क्षेत्रों), और γδ टी कोशिका की कमी (TCRδKO) चूहों कि नियंत्रण, अनुपचारित चूहों की तुलना में caspofungin के साथ इलाज किया गया में दोनों तरीकों से कवक बोझ के ठहराव की छवियों से पता चलता है । Caspofungin उपचार TCRδKO चूहों में अस्तित्व (चित्रा 7A) और कवक बोझ (चित्रा 7B-डी) में सुधार. चित्रा 6के परिणामों के समान, कवक बोझ के परिणाम के रूप में qPCR द्वारा मापा (चित्रा 7B) और प्रतिनिधि ग्राम ठहराव (चित्रा 7C) तुलनीय थे ।
चित्रा 4: caspofungin के साथ उपचार के बाद IA के साथ eosinophil-कमी (ΔdblGATA) चूहों में अस्तित्व में वृद्धि हुई. 15-30 चूहे समूह/ 3-6 प्रयोगों का सारांश. p < ०.०००१ । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: जंगली प्रकार, eosinophil की कमी से ग्राम-दाग फेफड़ों के वर्गों के प्रतिनिधि छवियों, और caspofungin-इलाज या IA के साथ अनुपचारित चूहों पर नियंत्रण । 3-4 चूहों के प्रतिनिधि समूह/ स्केल बार 100 µm के बराबर है । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: जंगली प्रकार में कवक बोझ, eosinophil के साथ चूहों की कमी का इलाज किया या caspofungin के साथ इलाज नियंत्रण. (क) फंगल डीएनए की qPCR. 15-30 चूहों समूह, 3-6 प्रयोगों का सारांश. (ख) ग्राम ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के ठहराव, मतलब 4 क्षेत्रों (10x उद्देश्य) से धुंधला ग्राम का% । (ग) ग्राम ठहराव, पूरे फेफड़ों के खंड (4x उद्देश्य) का मतलब% । बी और सी 5 चूहों का एक सारांश समूह/ * p < 0.05 । p < ०.००१ । p < ०.०००१ । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8में रिपोर्ट किए गए डेटा का उपयोग कर जनरेट किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 7: caspofungin उपचार के बाद γδ टी कोशिका की कमी चूहों में IA की गंभीरता में कमी आई. (क) उत्तरजीविता. (ख) फंगल डीएनए की qPCR. (ग) ग्राम ठहराव की प्रोटोकॉल. (D) IA के साथ γδ टी कोशिकाओं से ग्राम दाग वर्गों के प्रतिनिधि छवियों, इलाज या caspofungin के साथ इलाज किया । a और B 7-10 चूहों/समूह के साथ दो प्रयोगों का सार है । C और D 4 चूहों/समूह का सार है । * p < 0.05 । * * p < 0.01 । p < ०.००१ । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए IA के साथ चूहों में फेफड़े कवक बोझ के निर्धारण के लिए एक विधि परिचय ग्राम-दाग फेफड़ों ऊतकवैज्ञानिक छवि विश्लेषण और ठहराव के लिए वर्गों था । इस अध्ययन में, β-glucan-संश्लेषण-लक्ष्यीकरण रोधी दवा caspofungin के साथ उपचार14 IA8के साथ neutropenic जंगली प्रकार चूहों में अस्तित्व या फंगल बोझ में सुधार नहीं किया. हालांकि, इयोस्नोफिल्स या γδ टी कोशिकाओं के अभाव में, अस्तित्व और कवक बोझ में सुधार । हमारे अध्ययन के परिणाम भी दिखा दिया है कि तुलनीय परिणाम व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कवक डीएनए qPCR विधि6की तुलना में ग्राम कवक बोझ से प्राप्त किया जा सकता है ।
वहां ग्राम कवक बोझ ठहराव का उपयोग करने के लिए कई लाभ हैं । सबसे पहले, इस प्रक्रिया के मौजूदा ऊतकवैज्ञानिक नमूनों का उपयोग कर सकते हैं, इस प्रकार संभावित प्रयोगों की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण मतभेदों को निर्धारित करने की आवश्यकता है । दूसरा, इस अध्ययन में, कम जानवरों के लिए आवश्यक थे ग्राम कवक बोझ ठहराव कवक डीएनए की qPCR की तुलना में महत्वपूर्ण मतभेदों को प्राप्त करने के लिए (चित्रा 6, चित्रा 7). तीसरा, फंगल बोझ की तुलना में अलग qPCR द्वारा पृथक-निर्भर अंतर से प्रभावित हो सकता है राइबोसोमल डीएनए प्रतिलिपि संख्या15में । इसके विपरीत, ग्राम ठहराव कॉपी संख्या से प्रभावित नहीं है, के रूप में कवक बोझ फेफड़ों कवक विकास के सापेक्ष स्तर से निर्धारित होता है । इस प्रकार, कवक बोझ के लिए ग्राम ठहराव का उपयोग हड्डीवाला पशुओं के उपयोग को कम करता है और rDNA कॉपी संख्या के पूर्व निर्धारण की आवश्यकता नहीं है । अंत में, फंगल आकृति विज्ञान को संशोधित करने के अलावा, caspofungin थेरेपी कवक विखंडन बढ़ जाती है, और इस प्रकार कृत्रिम रूप से कवक बोझ बढ़ सकता है, जब फेफड़ों से कॉलोनी बनाने इकाइयों के अलगाव से मापा homogenates12,16 ,17. इस प्रकार, कवक बोझ के ग्राम ठहराव कई अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों के साथ निहित सीमाओं से बचा जाता है ।
हालांकि, ग्राम ठहराव और/या इस अध्ययन की सीमाएं नोट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, लेखकों प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के फेफड़ों भर में hyphal विकास के एक तुलनीय वितरण ग्रहण, और इस प्रकार पूरे फेफड़ों में कवक बोझ के लिए एक प्रतिनिधि माप के रूप में 4 प्रतिनिधि 10x उद्देश्य क्षेत्रों से ठहराव का इस्तेमाल किया (चित्रा घमण्ड). यह संभव है कि कुछ उदाहरणों में सापेक्ष वितरण, आकार, और hyphal घावों के घनत्व पर्याप्त रूप से अलग है ताकि कवक बोझ इस विधि और qPCR विधि द्वारा समकक्ष के साथ अलग दिखाई देगा । हालांकि, पूरे फेफड़े अनुभाग के साथ हमारे अतिरिक्त परिणाम ठहराव 4x उद्देश्य क्षेत्रों का उपयोग कर इसी तरह, कम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण यद्यपि, समूहों के बीच मतभेद (चित्रा 6C) दिखाया । इस ठहराव की मानक त्रुटि इस रणनीति के साथ वृद्धि हुई, की संभावना 4x उद्देश्य के साथ कम hyphal संकल्प के कारण और उपइष्टतम क्षेत्रों में पृष्ठभूमि में वृद्धि हुई थी । इसलिए, अधिक आवर्धन पर कम फ़ील्ड्स का प्रतिनिधि ठहराव पसंद की जाती है । दूसरा, केवल एक एकल, केंद्रीय अनुभाग प्रत्येक नमूने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह संभव है, कवक अलग या चूहों इस्तेमाल किया उपभेदों के आधार पर, कि कुछ अध्ययनों से hyphal वृद्धि का एक असमान वितरण में परिणाम हो सकता है । उन उदाहरणों में, प्रत्येक तेल ब्लॉक भर में अतिरिक्त वर्गों के लिए एक अधिक प्रतिनिधि बोझ प्राप्त quantified होना चाहिए । तीसरा, प्रयोगों में है कि mucins (यानी, एलर्जी bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)18 या सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)18), ग्राम जेट में airway कवक विकास को बढ़ाता है के पर्याप्त उत्पादन के साथ polysaccharide-रिच mucins19 गैर विशिष्ट ग्राम + परिणाम उपज सकता है और इस प्रकार उच्च कवक बोझ के पक्ष में कुछ नमूनों विषम । IA के केवल neutropenic मॉडल के बाद से इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था, यह संभव है कि अंय प्रतिरक्षा सक्षम या दबा मॉडल का उपयोग कम तुलनीय परिणामों में परिणाम सकता है । इन निरंतर के बावजूद, ग्राम ठहराव कवक बोझ का निर्धारण करने के लिए एक तुलनीय तकनीक प्रदान करता है, और इसके अतिरिक्त अध्ययन में जारी उपयोग आगे संगत, विश्वसनीय, और लागत प्रभावी के रूप में इस विधि की उपयोगिता को मांय कर सकता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन के भाग में एक इंडियाना विश्वविद्यालय चिकित्सा अनुसंधान संवर्धन अनुदान के स्कूल द्वारा और NIH-NIAID 1R03AI122127-01 द्वारा समर्थित किया गया था । एनए आंशिक रूप से Immunologists के अमेरिकन एसोसिएशन से इम्यूनोलॉजी फैलोशिप में एक कॅरिअर द्वारा इस अवधि के दौरान समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
