Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att bestämma pulmonell svamp börda i möss med invasiv aspergillos genom kvantifiering av Gomoris modifierade methanamine silver färgning i histologiska sektioner. Användning av denna metod resulterat i jämförbara resultat med mindre djur jämfört med bedömningen av svamp börda med kvantitativ PCR av lung svamp DNA.
Abstract
Kvantifiering av lung svamp börda är avgörande för fastställandet av de relativa nivåerna av immun skydd och svamp virulens i musmodeller av pulmonell svampinfektion. Även om flera metoder används för att bedöma svamp bördan, har kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) svamp DNA framträtt som en teknik med flera fördelar jämfört med tidigare kultur-baserade metoder. För närvarande nödvändiggör en omfattande bedömning av lung patologi, leukocyt rekrytering, svamp börda och genuttryck i möss med invasiv aspergillos (IA) användning av ett betydande antal experimentella och kontrolldjur. Här undersöktes kvantifiering av lung histologiska färgning för att avgöra svamp börda med ett minskat antal djur i detalj. Lungan sektioner var målat för att identifiera svamp strukturer med Gomoris modifierade methanamine silver (GMS) färgning. Bilder är tagna från avsnitten GMS-färgade från 4 diskret fält av varje formalin-fast paraffin-inbäddat lunga. GMS missfärgade områden inom varje bild kvantifierades använder ett program för analys av bilden, och från denna kvantifiering, bestämdes genomsnittliga andelen färgade området för varje prov. Använda denna strategi, minskade eosinofila-brist möss uppvisade svamp börda och sjukdom med kaspofungin terapi, medan vildtyp möss med IA inte förbättrades med kaspofungin. På samma sätt förbättrades också svamp börda i möss som saknar γδ T-celler av kaspofungin, mätt med qPCR och GMS kvantifiering. GMS kvantifiering introduceras därför som en metod för bestämning av relativa lung svamp börda som i slutändan kan minska mängden av försöksdjur krävs för omfattande studier av invasiv aspergillos.
Introduction
IA är en opportunistisk infektion som kan utvecklas hos mottagliga individer med medfödd eller förvärvad immunbrister på grund av suppressiv immunterapi eller kronisk infektion1,2. Primär infektion ofta sker i lungorna, men i vissa fall spridning av Aspergillusfumigatus till levern, njurarna, hjärtat och hjärnan kan uppstå, vilket resulterar i omfattande vävnad invasion av hyfer åtföljs av svår sjukdom och hög priser för dödlighet1,2. Dessutom effekten av befintliga läkemedelsbehandlingar är begränsad, och kan försvagas ytterligare av framväxten av svampdödande-resistenta stammar i miljö3. Det är därför viktigt att förstå de mekanismer av svamp virulens och värd patologi som främjar utveckling eller försämring av invasiv svampsjukdom.
Murina modeller förblir viktigt för mekanistiska IA studier, eftersom de tillåter forskare att bedöma svamp virulensgener roller och värd immun effektorer för etablering och tillväxt av A. fumigatus invivo4,5. Följaktligen, flera strategier utformats för att faktiskt kvantifiera eller jämföra svamp börda i grupper av försöksdjur6,7. Dessa strategier omfattar kultur-baserade, biokemiska, immunoassay eller qPCR metoder, med distinkta fördelar och nackdelar. Dessutom innebär dessa metoder av en delmängd av djur utöver de offrade för bedömningar av immun effektor funktion, gen uttryck analys och jämförande histopatologi7engagemang. Således kräver omfattande IA studier ofta betydande antal försöksdjur till en betydande kostnad. Effektiva strategier som minskar experimentell tid, djur kostnader och etiska överväganden genom att utnyttja djurvävnader för flera analyser är därför oerhört värdefulla7.
I betänkandet införs en metod som beskriver kvantifiering av GMS färgning i histologiska sektioner för jämförelse av relativ svamp bördan mellan experimentella grupper av möss med IA. Varje steg från svamp kultur till infektion, vävnad skörd och bearbetning, och bild förvärv och dataanalys, beskrivs i detalj. Svamp bördor erhålls genom GMS kvantifiering jämfördes med qPCR neutropen modeller av IA och behandlats med kaspofungin vildtyp eller eosinofila-brist möss med IA8. Resultaten visar likheten med GMS kvantifiering och qPCR av svamp DNA. Detta tyder på att GMS kvantifiering kan vara användbar för forskare bedriver histologiska analyser som en kompletterande eller alternativa metod för jämförelse av relativ svamp börda i möss med IA, och i slutändan kan minska kostnaderna och användning av försöksdjur i komplexa, mekanistiska studier.
Protocol
Alla djur förfaranden godkändes av djur vård och användning kommittén av Indiana State University, värd campus Indiana University School of Medicine — Terre Haute.
1. beredning av A. fumigatus Conidia för infektion
- Medan du arbetar i ett väl ventilerat dragskåp, tillsätt 125 µL av A. fumigatus 293 stamlösning till 900 µL cell kultur grade vatten (CCGW). Sedan överföra lösningen för att malt extrakt agarplatta (MEA) via pipett och jämnt med en inoculating loop.
- Lagra svamp plattan i mörker vid 24 ° C i minst 14 dagar och inte mer än 28 dagar.
- Skörda conidia med glaspärlor som tidigare beskrivits9.
- Häll 1,5 g 0,5 mm glaspärlor på plattan och försiktigt luta den fram och tillbaka tills pärlorna är gummiklädda för att extrahera conidia. Samla pärlor/conidia blandningen i en 15 mL koniska rör. Avbryta i 5 mL Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) och vortex.
- Räkna conidia i en 50 x utspädning av supernatanten i DPBS med en hemocytometer. Räkna antalet conidia i området visas i figur 1 och använda ekvation 1 för att beräkna koncentrationen.
#Conidia × utspädning faktor × 104= Conidia/mL (ekvation 1)
Obs: Ytterligare 4 x 4 fyrkantiga hörn områden får räknas, med medelvärdet av dessa områden som används som #Conidia i ekvation 1.
Figur 1: Hemocytometer representativa areal som används för conidia räknar (box, pil).
- Späd med conidia fjädringen med steril koksaltlösning (DPBS) för att erhålla önskad koncentration, 1,0 x 108 conidia/mL för infektion med 5 x 106 conidia/50 µL. förbereda 50 µL conidia lösning 'n + 2' möss infekterade till konto för pipettering fel.
Obs: Standard svampen skörd och beredning/filtrering kan vara alternativt används10. Metoden glas pärla är bäst används för att säkerställa att conidia prover med minimala små/lösliga hyphal antigener erhålls för aspiration.
2. immunsuppression och infektion av murina modell
- Använda 7-10-vecka-gammal möss.
Obs: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinofila-brist (ΔdblGATA, BALB/c bakgrund) och γδ T-cell-brist (TCRδ-/-, B6 bakgrund) möss användes för denna studie. I varje experiment, ålder och kön-matchade användes (både män och kvinnor) möss för varje grupp. - Bryter ned neutrofiler via intraperitoneal (IP) injektion av 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly - 6G antikroppar i steril koksaltlösning vid 45° i den laterala nedre högra kvadranten (för en experimentell schema, se figur 2).
- 24 h senare, infektera möss genom aspiration med 5,0 x 106A. fumigatus conidia upphängd i 50 µL steril koksaltlösning (se steg 2,4-2.10) som tidigare beskrivs11. Efter infektion, injicera en delmängd av djur med svampdödande agent som 5 mg/kg kaspofungin diacetat i DPBS som används i denna studie (dagligen, se figur 2).
- Söva möss med 99,9% isofluran med hjälp av en veterinär anestesi maskin.
- Lägg en pappershandduk på golvet av induktion kammaren att fånga avföring och urin.
- Placera musen i induktion kammaren, secure locket och ange spridare till 5% isofluran för 2 min och 30 s.
Obs: Vet salva används inte eftersom den totala tiden under narkos är mindre än 5 min. - Minska spridare till hälften av den maximala inställningen för 30 s.
- Bekräfta att musen är ordentligt bedövas genom att observera långsammare andning, brist på rörelse och brist på svar på tå-nypa stimulus.
- Ta bort musen från induktion plenisalen och plats ombord en slant. Placera musen med ryggen mot styrelsen. Säkerställa att dess övre framtänderna är försiktigt fastspända med ett gummiband och på nedre framtänderna är försiktigt fastspända med en metalltråd.
- Noggrant hålla tungan vid full utbyggnad med liten pincett och pipett 50 μl conidia/PBS suspension vid basen av tungan.
- Håll tungan vid full utbyggnad; Lyssna för snabb andning och det distinkta klickande ljudet av aspiration. Håll för 20 s eller tills suspensionen är fullt aspirerade.
- Ta bort musen från styrelsens vinkling och försiktigt placera i en bur för observation.
- Efter aspiration, bör musen återfå medvetandet inom 1 min. Monitor musen tills fullt medveten och kunna gå runt buren. Djuren ska inrymt vid 21 ° C och övervakas två gånger dagligen tills lungorna skördas.
- Upprepa utarmning av neutrofiler (steg 2.2) 24 h efter infektion (figur 2).
Figur 2: Experimental schema. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation8.
3. skörd och konservering av mus lungorna för histologisk analys
- Djupt söva djuret med en dödlig dos av 0,1 ml 390 mg/ml natrium pentobarbital lösning IP.
- Bekräfta dödshjälp genom att observera brist på spontan andning och avsaknad av svar på lem stimulering med pincett. När euthanized, spraya stommen med 70% etanol att sterilisera.
- Placera kadavret ombord en skum täckt med en absorberande pad.
Obs: Stommen bör placeras på ryggen med stift att säkra alla fyra lemmar till skum styrelsen. - Öppna övre brösthålan med sax med försiktighet. Skär revbenen bort för att avslöja lungor och hjärta. Skär den sämre vena cava för perfusion. Undvika skärning blodkärlen och punktera organ.
- Långsamt BEGJUTA med 5 mL kall DPBS i höger kammare i hjärtat vid 45° vinkel med en 25-G nål. Upprepa perfusionen med 5 mL i 10% formalin.
- Noggrant exponera luftstrupen och lossa de omgivande fett kuddar. Försiktig och undvika punktering luftstrupen. Se till överflödig bindväv är borttagna för att fullt visualisera luftstrupen innan du fortsätter. När luftstrupen är utsatt, placera pincetten under luftstrupen att upphöja det.
- Peta ett litet hål i övre luftstrupen med en 25-G nål.
Notera: Hålet skall placeras så att hela kanylen passar i luftstrupen. Var försiktig för att undvika spricker luftstrupen. - Infoga en kanyl genom hålet och mot lungorna. Fäst kanylen med en kirurgisk tråd knuten löst runt luftstrupen.
Obs: Om luftstrupen är spruckna, kanylen sitter kanske förbi luftstrupen så långt som möjligt i luftvägarna. - Med en spruta, blåsa lungorna med 1 mL 10% formalin buffert genom kanylen. Säkerställa att inflationen av lungorna är synlig. Om inte, justera katetern och upprepa. När lungorna är uppblåsta, snabbt bort kanylen med försiktighet och dra åt tråden ordentligt för att spärra av luftstrupen.
Obs: Om luftstrupen är spruckna och lungorna kan inte vara uppblåsta, lungorna kan fortfarande skördas men detta kan förhindra korrekt fixering. - Ta försiktigt bort luftstrupe och lungor från bröstet genom att noggrant koppla bort bindväven i luftstrupen med pincett samtidigt som du försiktigt drar på tråd. Placera lungor och luftstrupe i en 50 mL konisk slang med 15 mL 10% formalin buffert. Placera ena änden av tråden utanför röret och Förslut locket. Vänd röret för att helt dränka provet i fixativ.
- Lagra proverna vid rumstemperatur i minst 24 tim eller tills vidare bearbetning.
Varning: Formalin är farliga. Använd lämplig personlig skyddsutrustning inklusive skyddsglasögon och ansiktsmask. Arbeta under en kemisk huva vid bearbetning av prover.
4. skörd och konservering av mus lungorna för DNA svamp börda
- Följ steg 3.1-3.5 som beskrivs ovan på en separat mus.
- Långsamt BEGJUTA med 10 mL kall DPBS i höger kammare i hjärtat vid 45° vinkel med en 25-G nål.
- Punktskatt lungorna med sax och placera i märkta 1,5 mL rör.
- Lagra i lungorna vid-80 ° C tills vidare bearbetning.
- Använda standardmetoder som beskrivs (inbäddning och snittning) och enligt tillverkarens protokollen (se Tabell för material).
5. mikroskopi och Imaging
- Öppna bildprogrammet kvantifiering (se Tabell för material).
- Använder ett ljusmikroskop, skaffa minst 4 olika fält av GMS målat bilder (10 X-objektiv). Se till att bilderna är representativa för infekterade luftvägarna i lungan med liknande vävnad densitet.
Obs: Om täthet och distribution av hyphal foci visas markant skiljer mellan kontroll och experimentella grupper, ytterligare fält kan tas eller området GMS i avsnittet hela lungan kan avbildas (4 X-objektiv). Få bilder av samma områden i lungan (identifieras av motsvarande vävnad morfologi) på en seriell lung avsnittet färgas med hematoxylin och eosin, om så önskas. - Lägg till skala barer till bilderna vid behov och spara bilderna till kvantifieras. Välj, redigera > Lägg till/redigera kalibrering märken > menyn: välja linjens tjocklek, färg och skala bar storlek > Klicka på bilden för där skalstapeln är att placeras. Stänga menyn och välj, redigera > sammanfoga > sammanfoga kalibrering märken > välja Spara som > namnge filen och klicka på Spara.
6. använda en bild bearbetningsprogram att beräkna svamp bördan (figur 3)
- Öppna en bild bearbetningsprogram. Välj fil > mapp med prover att kvantifiera > bild (figur 3A). Välj bild > typ > Konvertera till ”RGB-Stack” (figur 3B).
- Använd högerpilen för att välja andra av de tre givna bilderna (figur 3B). Tryck ”Ctrl + Skift + T” att få upp den ”tröskelvärde” menyn Inställningar reglerskivan (figur 3 c). Leta upp den ursprungliga .tiff eller .jpg bilden som referens och öppna med en bild som visar program (figur 3 c).
- Dra skjutreglaget längst upp hela vägen till vänster och justera skjutreglaget längst ned tills det markerade (i rött) området är representativt för mikroskopi bilden (normalt mellan 130-160 som anges till höger om skjutreglaget (figur 3 c).
- När du har valt tryck på ”Set” > ”OK” (figur 3D). Välj ”analysera” > ”ange mätningar” > Kontrollera ”området, området bråk, begränsa till tröskeln, Visa etiketten” och lämna botten inställningar (rullgardinsmenyn och decimaler) som standard > ”OK” (figur 3D).
- Betydande områden av blanktecken eller bakgrundsfärgning kan uteslutas genom val av lämpliga vävnaden med ett område eller polygon verktyg.
- Slutligen väljer, ”analysera” > ”åtgärd” (ett fönster med data ska visas, eller visas en flik i Aktivitetsfältet märkt, ”resultat”) (figur 3E). Överföra data till en data analysprogram för grafritande och statistisk analys.
- Ange medelvärdet av de fyra område procentsatserna för varje lunga. 5-8 prover är normalt tillräckligt att upptäcka signifikanta skillnader mellan grupperna. Om man jämför två experimentella grupper, utföra en oparade student's t-test för att avgöra betydelsen.
Figur 3: representant skärmdumpar för varje steg i GMS histologiska fältet kvantifiering. (A) Välj fil > mapp med prover att kvantifiera > Välj bild. (B) Välj bild > typ > Konvertera till ”RGB-Stack”. Använd högerpilen för att välja andra av de tre givna bilderna. (C) Hit ”Ctrl + Skift + T” att få upp den ”tröskelvärde” menyn Inställningar reglerskivan. Leta upp den ursprungliga .tiff eller .jpg bilden som referens och öppna med photo viewer-programmet. Dra skjutreglaget topp ända kvar och justera skjutreglaget längst ned tills det markerade (i rött) området är representativt för mikroskopi bilden (normalt mellan 130-160 som anges till höger om reglaget. (D) när valda tryck ”Set” > ”OK”. Välj ”analysera” > ”ange mätningar” > Kontrollera ”området, området bråk, begränsa till tröskeln, Visa etiketten” och lämna botten inställningar (rullgardinsmenyn och decimaler) som standard > ”OK”. (E), slutligen välja ”analysera” > ”åtgärd” (ett fönster med data ska visas, eller visas en flik i Aktivitetsfältet märkt ”resultat”). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. DNA-svamp börda
- Ta bort lungorna från-80 ° C och lyophilize för minst 4 h (över natten är optimalt) eller tills torkat helt av en frysa torrt system.
- Medan lungorna torkning, förbereda DNA extraktion buffert (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris HCl pH 8,0, och 0,5% SDS).
- För beredda DNA extraktion bufferten i 60 ° C vattenbad att pre värma. Också, placera fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1) i en 50 mL konisk slang och möjliggör separation.
- Placera de frystorkade lungorna i en 2 mL skruvlock tub med 0,2 mL av glaspärlor. Använder en pärla visp, slipa torrt lungvävnad för 15-30 s tills den bildar ett fint pulver.
- Tillsätt 0,8 mL varm DNA-extraktion buffert i varje rör och vortex väl. Inkubera varje rör i 15 min i 65 ° C pärla badkar och sedan vortex innan ruvning för en ytterligare 15 min. Efter inkubation, vortex och sedan Centrifugera rör vid 25 000 x g i 10 min.
- Märk 3 uppsättningar av 1,5 mL tuber för varje prov och överför det översta lagret av supernatanten till en uppsättning rör. Försiktig samtidigt pipettering ut övre vattenskiktet för att undvika att störa det mellersta lagret.
- Lägg till lika stor volym av fenol: kloroform: isopentanol och blanda väl. Sedan Centrifugera vid 25 000 x g i 15 min före pipettering ut det övre lagret i den andra uppsättningen av rör.
- Tillsätt motsvarande volym av kloroform: isoamylacetat kloroform, blanda väl och centrifugera vid 25 000 x g i 10 min. pipetten försiktigt ut det övre lagret i den tredje uppsättningen rör.
- Tillsätt 500 µL av isopropanol 50 µL NaoAc (pH 5.2), blanda väl och låt prover att odla i rumstemperatur i 10 min. Sedan Centrifugera vid 25 000 x g i 30 min och Dekantera supernatanten.
- Tvätta DNA pelleten med 750 µL av is kallt 70% etanol och Centrifugera under 5 minuter vid 25 000 x g. Dekantera etanolen och låt pellets till luft torka i rören i ett dragskåp för 40 min.
- Återsuspendera torra pellets i 300 µL av TE buffert.
Obs: DNA kan lagras vid-20 ° C tills kvantifieras. - Kvantifiera DNA med en spektrofotometer och förbereda 100 µL av 0.2 µg/µL av varje DNA-prov för qPCR-analys.
- Utföra en standard qPCR i tre exemplar som tidigare beskrivs med 1 µg av DNA-prov, svamp 18S rDNA primer, och probe set med en modifierad sonden törstsläckare (5'- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3')12,13.
- Förbereda en standardkurva från A. fumigatus genomiskt DNA och beräkna koncentrationen av svamp DNA i pg i varje prov med den genomsnittliga reportern färga Ct-värden.
- Rita den pg/µg av svamp DNA med standardavvikelsen för medelvärdet. Utföra en students t-test analys för att fastställa betydelsen.
Obs: som en mindre giftiga alternativ till fenol-kloroform DNA extraktion används häri, kolumn baseras DNA-extraktion Kit kan användas.
Representative Results
Figur 4 innehåller ett diagram av överlevnad av vildtyp eller eosinofila-brist möss med IA som behandlats med kaspofungin. Resultaten visar att eosinofila-brist möss uppvisade ökad överlevnad jämfört med vildtyp möss (50% dödlighet jämfört med 100% dödlighet, respektive). Figur 5 visar representant GMS färgning från neutropen vildtyp och eosinofila-brist möss med IA behandlad eller obehandlad med kaspofungin. Kaspofunginhar behandling resulterade i relativa svamp clearance i eosinofila-brist, men inte vildtyp möss (rätt panelerna), medan båda grupper som inte fick kaspofungin var liknande (vänster paneler). Figur 6 visar jämförelsen mellan svamp börda i kaspofungin-behandlade och styra obehandlad vildtyp eller eosinofila-brist möss, kvantifiering av 4 (10 X mål) med båda qPCR av svamp DNA (figur 6A) och representant GMS och fält) Figur 6B). Resultaten genereras från båda teknikerna visar att kaspofungin behandlingsresultat i den mest betydande svamp bördan minskar mellan vildtyp och eosinofila-brist möss (figur 6A). Dock resulterade obehandlade möss, endast GMS kvantifiering i en betydande minskning av möss som saknar eosinofiler (figur 6B). När genomsnittlig area för hela-lung GMS-färgade sektioner beräknades (4 X-objektiv), skillnaderna var liknande till de resultat som erhålls med 4 representant 10 X fält, men med mindre statistisk signifikans (figur 6 c). Figur 7 visar överlevnad, bilder av representant GMS färgning (4 10 X fält) och kvantifiering av svamp bördan av båda metoderna i γδ T-cell-brist (TCRδKO) möss som behandlades med kaspofungin jämfört med kontroll, obehandlade möss. Kaspofunginhar behandling förbättrade överlevnad (figur 7A) och svamp börda (figur 7B-D) i TCRδKO möss. Liknande resultat i figur 6, resultaten av svamp börda mätt av qPCR (figur 7B) och representant GMS kvantifiering (figur 7 c) var jämförbara.
Figur 4: ökad överlevnad hos eosinofiler-brist (ΔdblGATA) med IA efter behandling med kaspofungin. 15-30 möss/grupp. Sammanfattning av 3-6 experiment. p < 0,0001. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa bilder av GMS-färgade lung sektioner från vildtyp, eosinofila bristfällig och behandlats med kaspofungin eller kontroll obehandlade möss med IA. Representant för 3-4 möss/grupp. Skalstapeln motsvarar 100 µm. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: svamp börda i vildtyp, eosinofila-brist möss med IA behandlas eller kontroll behandlats med kaspofungin. (A) qPCR av svamp DNA. 15-30 möss/grupp, sammanfattning av 3-6 experiment. (B), GMS kvantifiering av histologiska sektioner, genomsnittlig % av GMS färgning från 4 fält (10 x-objektiv). (C), GMS kvantifiering, genomsnittlig % av hela lungan avsnitt (4 X-objektiv). B och C är en sammanfattning av 5 möss/grupp. p < 0,05. p < 0,001. p < 0,0001. Denna siffra genererades med hjälp av data som rapporterats i en tidigare publikation8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: minskade svårighetsgraden av IA i γδ T-cell-brist möss efter kaspofungin behandling. (A) överlevnad. (B) qPCR av svamp DNA. (C), GMS kvantifiering av histologi. (D) representativa bilder av GMS-färgade sektioner från γδ T-celler med IA, behandlade eller obehandlade med kaspofungin. A och B är en sammanfattning av två experiment med 7-10 möss/grupp. C och D är en sammanfattning av 4 möss/grupp. p < 0,05. p < 0,01. p < 0,001. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Syftet med denna artikel var att införa en metod för bestämning av lung svamp börda i möss med IA genom att utnyttja GMS-färgade lung histologiska sektioner för bildanalys och kvantifiering. I denna studie jämfördes behandling med β-glukan-syntes-targeting svampdödande läkemedel kaspofungin14 inte bättre överlevnad eller svamp börda hos neutropena vildtyp möss med IA8. Men i avsaknad av eosinofiler eller γδ T-celler, överlevnad och svamp börda förbättrat. Resultaten av vår studie visade också att jämförbara resultat kan erhållas av GMS svamp börda i jämförelse med den utbredda svamp DNA qPCR metod6.
I området i närheten finns det flera fördelar med att utnyttja GMS svamp börda kvantifiering. Första kan processen utnyttja befintliga histologiska prover, vilket potentiellt minskar antalet experiment som krävs för att fastställa betydande skillnader. För det andra, i denna studie, mindre djur krävdes för GMS svamp börda kvantifiering att uppnå betydande skillnader jämfört med qPCR av svamp DNA (figur 6, figur 7). För det tredje, jämförelse av svamp börda i olika isolat av qPCR kan påverkas av isolat-beroende skillnader i ribosomal DNA kopia nummer15. GMS kvantifiering påverkas däremot inte av kopienumret, som svamp börda bestäms av relativa nivåer av lung svamptillväxt. Således, användning av GMS kvantifiering för svamp bördan minskar användningen av vertebrate djur och kräver inte före fastställandet av rDNA kopienumret. Slutligen, förutom att ändra svamp morfologi, kaspofungin terapi ökar svamp fragmentering, och thus ökas artificiellt svamp börda mätt med isolering av kolonin bildar enheter från lungan homogenates12,16 ,17. Således, GMS kvantifiering av svamp börda undviker flera begränsningar med andra vanliga metoder.
Begränsningarna av GMS kvantifiering och/eller denna studie är dock viktigt att notera. Först, författarna antog en jämförbar fördelning av hyphal tillväxt i hela lungorna av varje experimentella gruppen, och därför används kvantifiering från 4 representant 10 x objektiva fält som en representativ mätning för svamp bördan i hela lungan (Figur 6B). Det är möjligt att i vissa fall den relativa fördelningen, storlek och täthet av hyphal foci skulle tillräckligt skiljer sig så att svamp bördan skulle se annorlunda ut med denna metod och motsvarande av metoden qPCR. Våra ytterligare resultat med hela lungan avsnitt kvantifiering med fälten som 4 X objektiv visade dock liknande, om än mindre statistiskt signifikanta, skillnader mellan grupperna (figur 6 c). Standardfel för denna kvantifiering ökades med denna strategi, sannolikt på grund av minskad hyphal upplösning med 4 X mål och ökad bakgrund i suboptimala fält. Därför föredras en representativ kvantifiering av färre fält i högre förstoring. För det andra, användes bara en enda, central avsnitt för varje prov. Det är möjligt, baserat på svamp isolaten eller möss stammar används, att vissa studier kan leda till en ojämn fördelning av hyphal tillväxt. I dessa fall bör ytterligare avsnitt hela varje paraffin-block kvantifieras för att få en mer representativ börda. För det tredje, i experiment som inducerar omfattande produktion av muciner (dvs.kvantifiera luftvägarna svamptillväxt i allergisk bronkopulmonell aspergillos (ABPA)18 eller cystisk fibros (CF)18), GMS reaktivitet med polysackarid-rika muciner19 kunde ge ospecifika GMS + resultat och således skeva några prover till förmån för högre fungal börda. Eftersom endast neutropen modellen av IA användes i denna studie, är det möjligt att användningen av andra immun behöriga eller suppressiv modeller kunde resulterar i mindre jämförbara resultat. Trots dessa varningar, GMS kvantifiering ger en jämförbar teknik för att bestämma svamp börda, och dess fortsatta användning i ytterligare studier kan ytterligare validera nyttan av denna metod som konsekvent, tillförlitliga och kostnadseffektiva.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av en Indiana University skola av medicin Enhancement forskningsbidrag och av NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. stöddes delvis under denna period av en karriär inom immunologi Fellowship från den amerikanska Association av Immunologer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
