Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتحديد عبء الفطريات الرئوية في الفئران مع أسبيرجيلوسيس الغازية بالتحديد الكمي للفضة ميثاناميني المعدلة جوموري لتلطيخ في أقسام النسيجي. استخدام هذا الأسلوب أدى إلى نتائج قابلة للمقارنة مع الحيوانات أقل مقارنة بتقييم عبء الفطرية PCR الكمي للرئة الفطرية الحمض النووي.
Abstract
التحديد الكمي لعبء الرئة الفطرية أمر حاسم لتحديد المستويات النسبية للحماية المناعية وضراوة الفطرية في نماذج الماوس للرئة الفطرية. على الرغم من أن تستخدم أساليب متعددة لتقييم عبء الفطرية، برز الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر) للحمض النووي الفطرية كأسلوب مع العديد من المزايا السابقة الأساليب القائمة على الثقافة. حاليا، تقييما شاملا لأمراض الرئة وتجنيد الكريات البيض وعبء الفطرية والتعبير الجيني في الفئران مع أسبيرجيلوسيس الغازية (IA) يتطلب استخدام عدد كبير من التجارب ومراقبة الحيوانات. هنا كان درس التحديد الكمي للرئة النسيجي تلطيخ لتحديد عبء الفطرية باستخدام عدد أقل من الحيوانات بالتفصيل. أقسام الرئة كانت الملون لتحديد هياكل الفطرية مع جوموري لتعديل ميثاناميني الفضة (GMS) تلطيخ. صور مأخوذة من أقسام الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى من 4 حقول منفصلة كل الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين الفورمالين--الثابتة. منطقة الميكونج الكبرى الملون المناطق داخل كل صورة كانت كمياً باستخدام برنامج تحليل صورة، ومتوسط النسبة المئوية للمنطقة الملون من هذا التحديد الكمي، مصممة لكل عينة. باستخدام هذه الاستراتيجية، تفتقر إلى eosinophil الفئران أظهرت انخفض عبء الفطرية والمرض مع العلاج كاسبوفونجين، بينما لم تتحسن الفئران البرية من نوع مع IA مع كاسبوفونجين. وبالمثل، عبء الفطرية في الفئران التي تفتقر إلى خلايا γδ تي كما تحسنت ب caspofungin، مقاسا قبكر والتقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى. ولذلك هو عرض التحديد الكمي في منطقة الميكونج الكبرى كوسيلة لتحديد عبء النسبي الرئة الفطرية التي يمكن في نهاية المطاف خفض كمية الحيوانات التجريبية اللازمة لإجراء دراسات شاملة ل aspergillosis الغازية.
Introduction
IA هو عدوى الانتهازية التي قد تتطور في الأفراد عرضه مع القصور المناعي الخلقية أو المكتسبة بسبب العلاج المناعي القمعية أو العدوى المزمنة1،2. الإصابة الأولية غالباً ما يحدث في الرئتين، على الرغم من أن في بعض الحالات نشر رشاشيه دخناء إلى الكبد والكلى والقلب، وقد تحدث الدماغ، أدى غزو الأنسجة واسعة من خيوط فطرية مصحوبة بأمراض شديدة وعالية معدلات الوفيات1،2. وعلاوة على ذلك، فعالية القائمة فارماكوثيرابيس محدودة، وقد يكون زاد من ضعف بسبب ظهور سلالات مقاومة لمضاد في البيئة3. ولذلك من المهم لفهم آليات الأمراض الفطرية الفوعة والمضيفة التي تعزز التنمية أو تفاقم الأمراض الفطرية الغازية.
نماذج مورين تظل هامة الميكانيكية IA الدراسات، كما أنها تسمح للباحثين لتقييم أدوار الجينات الفوعة الفطرية واستضافة المناعي المستجيبة لإنشاء ونمو دخناء (أ) المجراة في4،5. ونتيجة لذلك، تم وضع استراتيجيات متعددة بغية قياس أو مقارنة عبء الفطرية في مجموعات من الحيوانات التجريبية6،7بشكل فعال. تشمل هذه الاستراتيجيات المناعة على أساس الثقافة، والكيمياء الحيوية، أو الأساليب قبكر، مع مميزة من مزايا وعيوب كل. وعلاوة على ذلك، كل من هذه الأساليب تنطوي على تفاني مجموعة فرعية حيوانات بالإضافة إلى تلك التي ضحى من أجل تقييم الدالة المستجيب محصنة وتحليل التعبير الجيني، والأنسجة مقارنة7. وبالتالي، غالباً ما تتطلب دراسات IA شاملة إعداد كبيرة من الحيوانات للبحث بتكلفة كبيرة. استراتيجيات فعالة لتقليل وقت التجريبية والتكاليف الحيوانية والاعتبارات الأخلاقية باستخدام الأنسجة الحيوانية لتحليلات متعددة هي بالتالي قيمة للغاية7.
في هذا التقرير، هو عرض أسلوب تصف التحديد الكمي لمنطقة الميكونج الكبرى تلطيخ في مقاطع نسيجية للمقارنة عبء الفطرية النسبي بين المجموعات التجريبية من الفئران مع IA. يتم وصف كل خطوة من الثقافة الفطرية للعدوى والأنسجة الحصاد والتجهيز، والحصول على الصور وتحليل البيانات، بالتفصيل. الأعباء الفطرية التي حصل عليها تقدير حجم منطقة الميكونج الكبرى قورنت مع قبكر في نماذج نيوتروبينيك من ألف وفي الفئران البرية من نوع أو تفتقر إلى eosinophil caspofungin تعامل مع IA8. وأظهرت النتائج تشابه مع التقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى و qPCR للحمض النووي الفطرية. وهذا يوحي بأن القياس الكمي منطقة الميكونج الكبرى قد تكون مفيدة للباحثين المشاركين في التحليل النسيجي كوسيلة تكميلية أو بديلة من المقارنة بين العبء النسبي الفطرية في الفئران مع IA، وربما في نهاية المطاف تقليل التكلفة واستخدام الحيوانات للبحث في دراسات معقدة، والميكانيكية.
Protocol
وافق جميع الإجراءات الحيوان بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة للدولة جامعة إنديانا، حرم المضيف من "كلية الطب بجامعة إنديانا" – تير هوت.
1. إعداد كونيديا دخناء (أ) للإصابة
- بينما كان يعمل في غطاء دخان جيد التهوية، إضافة ميليلتر 125 حل الأسهم دخناء أ 293 إلى 900 ميليلتر خلية ثقافة الصف المياه (ككجو). ثم نقل الحل للشعير استخراج أجار (طيران الشرق الأوسط) لوحة عن طريق ماصة، وتنتشر بشكل متساو مع حلقة إينوكولاتينج.
- تخزين اللوحة الفطرية في الظلام عند 24 درجة مئوية لمدة 14 يوما على الأقل ولا يزيد عن 28 يوما.
- حصاد كونيديا استخدام الزجاج الخرز كما هو موضح سابقا9.
- صب غ 1.5 من 0.5 مم الخرز الزجاج على اللوحة ولطف الميل ذهابا وإيابا حتى المغلفة الخرز من أجل استخراج كونيديا. جمع الخليط حبة/كونيديا في أنبوب مخروطي 15 مل. تعليق في 5 مل دولبيكو مخزنة الفوسفات المالحة (دببس) ودوامه.
- عد كونيديا في تمييع 50 x من المادة طافية في دببس باستخدام هيموسيتوميتير. حساب عدد كونيديا في المنطقة هو مبين في الشكل 1 ، واستخدام 1 معادلة لحساب التركيز.
عامل إضعاف × #Conidia × 104= كونيديا مليلتر (المعادلة 1)
ملاحظة: مناطق زاوية مربعة 4 × 4 إضافية قد تحسب، مع متوسط هذه المناطق المستخدمة ك #Conidia في المعادلة 1.
الشكل 1: هيموسيتوميتير الممثل المساحة المستخدمة في كونيديا العد (مربع والسهم).
- تمييع تعليق كونيديا مع عقيمة المالحة (دببس) للحصول على التركيز المطلوب، 1.0 × 108 كونيديا/مل للعدوى مع 5 × 106 كونيديا/50 ميليلتر. إعداد 50 ميليلتر من حل كونيديا الواحدة 'ن + 2' الفئران تصاب بحساب بيبيتينج خطأ.
ملاحظة: قد يكون الحصاد الفطريات القياسية وتصفية إعداد واستخدامها بدلاً من10. يستخدم الأسلوب حبة الزجاج أفضل لضمان أن يتم الحصول على عينات كونيديا مع الحد الأدنى من المستضدات أصله الصغيرة/القابلة للذوبان للطموح.
2-الكبت المناعي والعدوى من طراز مورين
- استخدام الفئران العمر 7-10 أسبوع.
ملاحظة: بالب/ج، C57BL/6 (B6)، تعاني من نقص اوسينوفيل (ΔdblGATA، خلفية بالب/ج)، وتفتقر إلى خلية T γδ (TCRδ--/--، خلفية B6) الفئران واستخدمت لهذه الدراسة. لكل تجربة، والسن والمطابقة بين الجنسين كانت تستخدم الفئران (الذكور والإناث) لكل مجموعة. - تستنفد العَدلات عن طريق الحقن (الملكية الفكرية) داخل من 0.1 مليلتر (0.5 ملغ) مكافحة-موس-لي-6 ز جسم في المحلول الملحي العقيمة في 45° في الربع الأيمن السفلي الأفقي (لوضع جدول زمني تجريبية، انظر الشكل 2).
- 24 ساعة في وقت لاحق، تصيب الفئران بتطلع مع 5.0 × 10 كونيديادخناء ألف- 6تعليق في 50 ميليلتر عقيمة المالحة (انظر الخطوات 2.4-2.10) كما تم وصفه سابقا11. بعد الإصابة، حقن مجموعة فرعية حيوانات مع عامل مضاد فطري مثل اسيتات كاسبوفونجين 5 مغ/كغ في دببس المستخدمة في هذه الدراسة (يوميا، انظر الشكل 2).
- تخدير الفئران مع isoflurane 99.9% استخدام آلة تخدير البيطري.
- ضع منشفة ورقية على أرضية قاعة التعريفي للقبض على البراز والبول.
- ضع الماوس في قاعة توجيهي وتأمين الغطاء وتعيين في المبخر إلى إيسوفلوراني 5% ل 2 دقيقة و 30 ثانية.
ملاحظة: لا يتم استخدام مرهم البيطرية لإجمالي الوقت تحت التخدير أقل من 5 دقائق. - تخفيض في المبخر إلى النصف من إعداد الحد الأقصى لمدة 30 ثانية.
- تأكد أن الماوس يتم تخديره بشكل صحيح عن طريق مراقبة إبطاء التنفس، وقلة الحركة، وعدم الاستجابة للتحفيز تو-قرصه.
- إزالة الماوس من الدائرة التعريفي ومكان على لوح مائل. ضع الماوس مع ظهرها ضد المجلس. تكفل لها القواطع العلوية هي مقيدة بلطف مع شريط المطاطي والقواطع السفلي هي مقيدة بلطف مع سلك معدني.
- عقد اللسان بعناية في ملحق كامل مع ملقط صغير وماصة 50 ميليلتر من تعليق كونيديا/برنامج تلفزيوني في قاعدة اللسان.
- عقد اللسان في ملحق كامل؛ الاستماع للتنفس السريع والضوضاء النقر متميزة من الطموح. عقد 20 ق أو حتى تعليق ويستنشق كاملا.
- إزالة الماوس من لوحة منحدر ولطف في قفص للمراقبة.
- عقب الشفط، الماوس ينبغي أن يستعيد وعيه داخل 1 دقيقة رصد الماوس حتى تدرك تماما وقادرة على المشي حول القفص. ينبغي أن يقع في 21 درجة مئوية الحيوانات ورصد مرتين يوميا حتى يتم حصادها الرئتين.
- كرر نضوب العَدلات (الخطوة 2، 2) 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 2).
رقم 2: الجدول الزمني التجريبي. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8.
3-الحصاد والحفاظ على الرئتين الماوس للتحليل النسيجي
- وإذ يساورها بالغ تخدير الحيوان بجرعة قاتلة من 0.1 مل من الصوديوم بينتوباربيتال 390 ملغ/مل حل الملكية الفكرية.
- تأكيد القتل الرحيم ملاحظاً انعدام التنفس العفوي وعدم وجود استجابة للتحفيز أطرافهم بالملقط. عندما euthanized، رش الذبيحة مع الإيثانول 70% لتعقيم.
- ضع الذبيحة على متن رغوة مغطاة وسادة ماصة.
ملاحظة: يجب وضع الذبيحة على ظهرها مع دبابيس تأمين جميع أطرافه الأربعة للمجلس الرغوة. - فتح تجويف الصدر العلوي باستخدام المقص بحذر. قص القفص الصدري بعيداً من أجل فضح الرئتين والقلب. قطع الأجوف فينا أدنى للسماح التروية. تجنب قطع الأوعية الدموية وثقب الأجهزة.
- نتخلل ببطء مع 5 مل دببس الباردة في البطين الأيمن من القلب بزاوية 45 درجة مع إبرة 25-ز. كرر التروية مع 5 مل من الفورمالين 10%.
- كشف القصبة الهوائية وفصل منصات الدهون المحيطة بعناية. يجب توخي الحذر وتجنب ثقب القصبة الهوائية. ضمان إزالة النسيج الضام الزائدة حتى تماما تصور القصبة الهوائية قبل المتابعة. حالما يتم كشفها في القصبة الهوائية، ضع الملقط تحت القصبة الهوائية للارتقاء بذلك.
- كزة ثقب صغير في القصبة الهوائية العليا باستخدام إبرة 25-ز.
ملاحظة: يجب أن ترحل الحفرة حيث يناسب قنية كامل في القصبة الهوائية. توخي الحذر لتجنب تمزيق القصبة الهوائية. - إدراج قنية من خلال الثقب ونحو الرئتين. تأمين القنية بخيط جراحي مرتبطة فضفاضة حول القصبة الهوائية.
ملاحظة: إذا كان هو تمزق في القصبة الهوائية، قد تكون إدراج القنية في الماضي القصبة الهوائية قدر الإمكان في مجرى الهواء. - استخدام المحاقن، تضخم الرئتين مع 1 مل 10% فورمالين المخزن المؤقت من خلال القنية. ضمان أن تضخم الرئتين بشكل مرئي. إذا لم يكن كذلك، ضبط القسطرة وتكرار. حالما يتم تضخم الرئتين، بسرعة إزالة قنية بحذر وتشديد مؤشر الترابط بشكل أمن غلق القصبة الهوائية.
ملاحظة: إذا هو تمزق في القصبة الهوائية والرئتين لا يمكن أن يكون مبالغا فيها، قد لا يزال يكون حصادها الرئتين ولكن هذا قد يمنع التثبيت الصحيح. - بلطف إزالة القصبة الهوائية والرئتين من صدره بقطع النسيج الضام من القصبة الهوائية بعناية مع الملقط أثناء سحب مؤشر ترابط برفق. ضع الرئتين والقصبة الهوائية في أنبوب 50 مل مخروطية مع 15 مل من 10% فورمالين المخزن المؤقت. ضع نهاية واحد من مؤشر ترابط خارج الأنبوب وختم عملية النداءات الموحدة. عكس الأنبوب إلى غمر العينة في مثبت تماما.
- تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة 24 ساعة على الأقل أو حتى إجراء مزيد من المعالجة.
تنبيه: الفورمالين الخطرة. ارتداء "معدات الحماية الشخصية" المناسبة بما فيها نظارات وقناع لوجه. تعمل تحت غطاء كيميائية عند تجهيز العينات.
4-الحصاد والحفاظ على الرئتين الماوس لعبء الفطرية الحمض النووي
- اتبع الخطوات من 3.1 إلى 3.5 كما هو موضح أعلاه في ماوس منفصلة.
- نتخلل ببطء مع 10 مل دببس الباردة في البطين الأيمن من القلب بزاوية 45 درجة مع إبرة 25-ز.
- المكوس الرئتين مع المقص ووضعه في أنابيب المسمى 1.5 مل.
- تخزين الرئتين في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
- استخدام التقنيات القياسية كما هو موضح (التضمين وتمزيقها) ووفقا للبروتوكولات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
5-الفحص المجهري والتصوير
- افتح برنامج التصوير الكمي (انظر الجدول للمواد).
- استخدام مجهر ضوء، الحصول على مالا يقل عن 4 حقول متميزة لمنطقة الميكونج الكبرى الملون الشرائح (10 X الهدف). التأكد من وجود الصور ممثل الخطوط الجوية المصابة داخل الرئة مع كثافة أنسجة مماثلة.
ملاحظة: إذا ظهرت كثافة وتوزيع البؤر أصله تختلف اختلافاً كبيرا بين السيطرة والمجموعات التجريبية، حقول إضافية يمكن اتخاذها، أو قد يكون تصويرها منطقة الميكونج قسم الرئة كاملة (4 X الهدف). الحصول على صور من نفس المناطق في الرئة (المعرفة بواسطة مورفولوجيا الأنسجة ما يعادلها) في مقطع الرئة مسلسل الملون والهيماتوكسيلين ويوزين، إذا رغبت في ذلك. - إضافة أشرطة مقياس للصور عند الاقتضاء، وحفظ الصور كمياً. اختر تحرير > إضافة/تحرير "علامات المعايرة" > القائمة: اختر حجم شريط سمك ولون وحجم الخط > اضغط على الصورة ليوضع فيه شريط مقياس. إغلاق القائمة واختر تحرير > دمج > "دمج علامات المعايرة" > اختر "حفظ كملف" > اسم الملف ثم انقر فوق حفظ.
6. باستخدام أحد برامج معالجة صورة لحساب عبء الفطرية (الشكل 3)
- فتح برنامج معالجة صور. حدد ملف > مجلد مع العينات تحديد مقدار > صورة (الشكل 3A). اختر صورة > نوع > تحويل إلى "RGB المكدس" (الشكل 3).
- استخدم المفتاح سهم لليمين لتحديد الثاني من ثلاث صور معينة (الشكل 3B). ضرب "control + shift + T" لإحضار معاين إعدادات القائمة "عتبة" (الشكل 3). حدد موقع الصورة الأصلية.tiff أو.jpg كمرجع وفتح مع صورة عرض البرنامج (الشكل 3).
- اسحب مربع التمرير العلوي وصولاً إلى اليسار وضبط مربع التمرير أسفل حتى منطقة مختارة (باللون الأحمر) ممثل صورة مجهرية (عادة ما تتراوح بين 130-160 كما هو مبين على يمين شريط التمرير (الشكل 3).
- بمجرد تحديد، اضغط على "تعيين" > "OK" (3D الشكل). حدد "تحليل" > "تعيين قياسات" > التحقق من "المنطقة، منطقة الكسر، الحد الأقصى للعتبة، عرض التسمية" وترك الإعدادات أسفل (القائمة المنسدلة والعشرية) كافتراضي > "OK" (3D الشكل).
- قد يستبعد مساحات كبيرة من مساحة بيضاء أو تلوين الخلفية بتحديد الأنسجة مناسبة مع أداة المساحة أو مضلع.
- وأخيراً حدد، "تحليل" > "قياس" (يجب أن تظهر نافذة تحتوي على بيانات، أو سوف تظهر علامة تبويب على شريط مهام windows المسمى، "النتائج") (رقم 3E). نقل البيانات إلى برنامج تحليل بيانات للرسوم البيانية والتحليل الإحصائي.
- أدخل متوسط النسب المئوية المنطقة أربعة لكل عينة من الرئة. 5-8 عينات تكفي عادة للكشف عن اختلافات كبيرة بين المجموعات. إذا كانت المقارنة بين مجموعتين تجريبية، أداء الطالب مزاوج تي-اختبار لتحديد أهمية.
الشكل 3: لقطات من ممثل لكل خطوة من منطقة الميكونج الكبرى النسيجي الحقل الكمي. (أ) "حدد ملف" > مجلد مع العينات تحديد مقدار > حدد الصورة. (ب) "حدد الصورة" > نوع > تحويل إلى "RGB المكدس". استخدم المفتاح سهم لليمين لتحديد الثاني من ثلاث صور معينة. (ج) ضرب "control + shift + T" لإحضار معاين إعدادات القائمة "العتبة". حدد موقع الصورة الأصلية.tiff أو.jpg كمرجع وفتحه باستخدام برنامج عارض صور. اسحب مربع التمرير العلوي طول الطريق اليسار وضبط مربع التمرير أسفل حتى منطقة مختارة (باللون الأحمر) ممثل صورة مجهرية (عادة ما تتراوح بين 130-160 كما هو مبين على يمين مربع التمرير. (د) مجرد صحفية مختارة "تعيين" > "موافق". حدد "تحليل" > "تعيين قياسات" > التحقق من "المنطقة، منطقة الكسر، الحد الأقصى للعتبة، عرض التسمية" وترك الإعدادات أسفل (القائمة المنسدلة والعشرية) كافتراضي > "موافق". (ه) وأخيراً حدد "تحليل" > "قياس" (يجب أن تظهر نافذة تحتوي على بيانات، أو سوف تظهر علامة تبويب على شريط مهام windows المسمى "النتائج"). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7-الحمض النووي عبء الفطرية
- إزالة الرئتين من-80 درجة مئوية وليوفيليزي على الأقل 4 ح (وهو الأمثل بين عشية وضحاها) أو حتى جفت تماما بنظام تجميد جاف.
- في حين يتم تجفيف الرئتين، إعداد المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (كلوريد الصوديوم 0.1 M، 10 مم يدتا pH 8.0، 10 مم HCl تريس pH 8.0، والحزب الديمقراطي الصربي 0.5%).
- مكان استخراج الحمض النووي إعداد المخزن المؤقت في حمام مائي 60 درجة مئوية قبل الحارة. أيضا، ضع الفينول: كلوروفورم: الكحول إيسواميل (25:24:1) في أنبوب 50 مل مخروطية والسماح للانفصال.
- ضع الرئتين المجففة بالتبريد في أنبوب 2 مل ملولبة مع 0.2 مل حبات الزجاج. استخدام الخافق حبة، طحن أنسجة الرئة الجافة عن 15-30 ثانية حتى أنه يشكل مسحوق ناعم.
- إضافة المخزن المؤقت "استخراج الحمض النووي" 0.8 مل الحارة إلى كل أنبوب ودوامه جيدا. احتضان كل أنبوب لمدة 15 دقيقة في حمام حبة 65 درجة مئوية ثم دوامة قبل حضانة لمدة 15 دقيقة إضافية. بعد حضانة، أنابيب دوامة، ومن ثم الطرد المركزي في س 25,000 ز لمدة 10 دقائق.
- تسمية 3 مجموعات من أنابيب 1.5 مل لكل من العينات ونقل الطبقة العليا من المادة طافية في مجموعة واحدة من الأنابيب. توخي الحذر أثناء بيبيتينج خارج الطبقة العليا مائي لتفادي الإخلال بالطبقة الوسطى.
- إضافة إلى حجم متساوية من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل ومزيج جيد. ثم الطرد المركزي في 25,000 ز س لمدة 15 دقيقة قبل بيبيتينج من الطبقة العليا في المجموعة الثانية من الأنابيب.
- إضافة إلى حجم متساوية من كلوروفورم كلوروفورم: إيسواميل ومزيج جيد والطرد المركزي في 25,000 ز x 10 كحد أدنى بعناية ماصة بالطبقة العليا في المجموعة الثالثة من الأنابيب.
- إضافة 500 ميليلتر الايزوبروبانول و 50 ميليلتر ناواك (pH 5.2)، مزيج جيد، والسماح لعينات لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم الطرد المركزي في 25,000 ز س لمدة 30 دقيقة وصب المادة طافية.
- تغسل بيليه الحمض النووي مع ميليلتر 750 إيثانول 70% الباردة الجليد والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 25,000 س زاي صب الإيثانول وتسمح الكريات للهواء الجاف في الأنابيب في أغطية دخان لمدة 40 دقيقة.
- ريسوسبيند الكريات الجافة في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
ملاحظة: قد تكون مخزنة في الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى كمياً. - التحديد الكمي للحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي وإعداد 100 ميليلتر من 0.2 ميكروغرام/ميليلتر لكل عينة من الحمض النووي لتحليل قبكر.
- أداء qPCR قياسية في ثلاث نسخ كما تم وصفه سابقا مع 1 ميكروغرام من عينات الحمض النووي، 18S الفطرية المتاشب التمهيدي، ويحدد التحقيق مع يحتوي مسبار معدلة (5 '--/56-الاتحاد الماليزي/AGC وظفته كاج/زن/مجلس التعاون الجمركي الائتلاف صرفة G/3IABkFQ-3')12،13.
- إعداد منحنى قياسي من الحمض النووي (أ) دخناء ، وحساب تركيز الحمض النووي الفطرية في جزء من الغرام في كل صبغ العينة باستخدام المراسل متوسط القيم المقطعية.
- ارسم بيكوغرام/ميكروغرام للحمض النووي الفطرية مع الخطأ المعياري للوسط. أداء الطالب t-اختبار تحليل لتحديد أهمية.
ملاحظة: كأقل سمية بديل لاستخراج الحمض النووي الفينول كلوروفورم المستخدمة هنا، العمود على أساس استخراج الحمض النووي يمكن استخدام مجموعات.
Representative Results
الشكل 4 يتضمن رسم بياني للبقاء على قيد الحياة نوع البرية أو الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل مع IA تعامل مع كاسبوفونجين. وتبين النتائج أن الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل أظهرت زيادة البقاء على قيد الحياة بالمقارنة مع الفئران البرية من نوع (الوفيات 50% مقابل معدل وفيات 100%، على التوالي). يبين الشكل 5 ممثل منطقة الميكونج الكبرى تلطيخ من نيوتروبينيك البرية من نوع والفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل مع IA تعامل أو دون علاج مع كاسبوفونجين. العلاج كاسبوفونجين أدت إلى إزالة الفطريات النسبي في eosinophil-ناقصة، لكن الفئران البرية ليست من نوع (حق الألواح)، بينما كلا الفريقين تتلق caspofungin مماثلة (لوحات الأيسر). الشكل 6 يوضح المقارنة بين عبء الفطرية في التعامل مع كاسبوفونجين والسيطرة على الفئران البرية من نوع أو تفتقر إلى اوسينوفيل غير المعالجة، واستخدام كلا qPCR الفطرية الحمض النووي (الشكل 6A) وممثل منطقة الميكونج الكبرى حقول القياس الكمي 4 (10 X الهدف) ( الشكل 6B). وتظهر النتائج التي تم إنشاؤها من كلتا الطريقتين أن نتائج العلاج كاسبوفونجين في عبء الفطرية أهم انخفاض بين الفئران البرية من نوع وتفتقر إلى اوسينوفيل (الشكل 6A). ومع ذلك، أدى فقط منطقة الميكونج الكبرى الكمي في الفئران غير المعالجة، انخفاضا كبيرا في الفئران التي تفتقر إلى الحمضات (الشكل 6B). عندما تم حساب متوسط مجال أقسام الجامعة والرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى (4 X الهدف)، الفروق كانت مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها مع الممثل 10 4 X الحقول، ولو بأقل دلالة إحصائية (الشكل 6). يبين الشكل 7 البقاء على قيد الحياة، صور لممثل منطقة الميكونج الكبرى المصبوغة (المجالات 4 10 X)، والتقدير الكمي لعبء الفطرية بكلتا الطريقتين في γδ الفئران تفتقر إلى خلية T (TCRδKO) التي كانت تعامل مع كاسبوفونجين بالمقارنة مع التحكم، دون علاج الفئران. Caspofungin العلاج تحسين البقاء على قيد الحياة (الشكل 7 أ) وعبء الفطرية (الشكل 7-د) في الفئران TCRδKO. مماثلة لنتائج الرقم 6، عبء الفطرية مقاسا ب qPCR (الشكل 7) وممثل منطقة الميكونج الكبرى الكمي (الشكل 7) وكانت النتائج قابلة للمقارنة.
الشكل 4: زيادة البقاء على قيد الحياة في الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل (ΔdblGATA) بألف بعد العلاج مع كاسبوفونجين- 15-30 الفئران/المجموعة. ملخص التجارب 3-6. ف < 0.0001. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: صور الممثل لأقسام الرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى من البرية من نوع أو eosinophil ناقصة، وتعامل كاسبوفونجين أو عنصر التحكم دون علاج الفئران مع جوعه ممثل الفئران/المجموعة 3-4. شريط مقياس ما يعادل 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: عبء الفطرية في البرية من نوع الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل مع IA العلاج أو التحكم تعامل مع كاسبوفونجين- (أ) qPCR للحمض النووي الفطرية. 15-30 الفئران/مجموعة موجزة من تجارب 3-6. (ب) منطقة الميكونج الكبرى التحديد الكمي للمقاطع النسيجي، يعني في المائة لمنطقة الميكونج الكبرى تلطيخ من الحقول 4 (10 x الهدف). (ج) منطقة الميكونج الكبرى الكمي، % يعني قسم الرئة كاملة (4 X الهدف). B و C ملخص للفئران/المجموعة 5. ف < 0.05. ف < 0.001. ف < 0.0001. وهذا الرقم تم إنشاؤها باستخدام البيانات التي تم الإبلاغ عنها في منشور سابق8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: تناقص شدة IA في الفئران تفتقر إلى خلية T γδ بعد العلاج كاسبوفونجين. (أ) البقاء على قيد الحياة. (ب) qPCR للحمض النووي الفطرية. (ج) منطقة الميكونج الكبرى التحديد الكمي لعلم الأنسجة. (د) الممثل الصور الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى أقسام من الخلايا γδ تي مع IA، caspofungin المعالجة أو غير المعالجة. A و B ملخص لتجربتين مع 7-10 الفئران/المجموعة. ج ود ملخص للفئران/المجموعة 4. ف < 0.05. ف < 0.01. ف < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وكان الغرض من هذه المادة الأخذ بأسلوب لتحديد عبء الرئة الفطرية في الفئران مع IA باستخدام مقاطع نسيجية الرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى لتحليل الصور والقياس الكمي. في هذه الدراسة، العلاج بالمخدرات المضادة للفطور β-غلوكان-توليف-استهداف caspofungin14 لم يحسن البقاء على قيد الحياة أو عبء الفطرية في الفئران البرية من نوع نيوتروبينيك مع IA8. ومع ذلك، في غياب الحمضات أو خلايا γδ T، البقاء على قيد الحياة وعبء الفطرية تحسنت. وأظهرت نتائج الدراسة أيضا أن عبء الفطرية منطقة الميكونج الكبرى بالمقارنة تستخدم على نطاق واسع الفطرية الحمض النووي qPCR الأسلوب6ويمكن الحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
هناك فوائد عديدة لاستخدام منطقة الميكونج الكبرى الفطرية العبء الكمي. أولاً، العملية قد تستخدم عينات نسيجية القائمة، وبالتالي يحتمل أن خفض عدد التجارب اللازمة لتحديد الاختلافات الهامة. وثانيا، في هذه الدراسة، كانت أقل الحيوانات المطلوبة لمنطقة الميكونج الكبرى الفطرية العبء الكمي لتحقيق فروق كبيرة بالمقارنة مع قبكر الفطرية الحمض النووي (الشكل 6، رقم 7). ثالثا، مقارنة بين عبء الفطرية في يعزل مختلفة من قبكر قد تتأثر تعتمد على عزل الاختلافات في نسخة الحمض النووي ريبوسومال رقم15. وفي المقابل، التقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى لا يتأثر بعدد النسخ، كما يتحدد عبء الفطرية بالمستويات النسبية لنمو الفطريات الرئة. وهكذا، استخدام منطقة الميكونج الكبرى التقدير الكمي لعبء الفطرية يقلل من استخدام الحيوانات الفقارية ولا تتطلب قبل تحديد عدد النسخ المتاشب. وأخيراً، بالإضافة إلى تعديل مورفولوجيا الفطرية، العلاج كاسبوفونجين يزيد من تجزئة الفطرية، وبالتالي قد مصطنع زيادة عبء الفطرية عندما تقاس بعزل الوحدات تشكيل مستعمرة من الرئة هوموجيناتيس12،16 ،17. وهكذا يتجنب الكمي GMS لعبء الفطرية العديد من القيود المتأصلة مع أساليب أخرى شائعة الاستخدام.
بيد أن القيود المفروضة على منطقة الميكونج الكبرى القياس الكمي و/أو هذه الدراسة من المهم ملاحظة. أولاً، الكتاب يفترض توزيع النمو أصله في جميع أنحاء الرئتين لكل مجموعة تجريبية بصورة قابلة لمقارنة، وهكذا تستخدم الكمي من الممثل 4 10 × حقول موضوعية كقياس تمثيلي لعبء الفطرية في الرئة كاملة (الشكل 6B). فمن الممكن أن في بعض الحالات التوزيع النسبي، وحجم وكثافة من البؤر أصله بما فيه الكفاية تختلف حيث أن عبء الفطرية تبدو مختلفة مع هذا الأسلوب وما يعادلها بواسطة الأسلوب قبكر. ومع ذلك، لدينا نتائج إضافية مع الرئة كله قسم الكمي باستخدام مجالات موضوعية X 4 أظهرت مماثلة، وأن كانت أقل فروق معتد بها إحصائيا، بين المجموعات (الشكل 6). الخطأ المعياري للتقدير الكمي هذا زيد مع هذه الاستراتيجية، يرجح أن سبب انخفاض القرار أصله مع 4 × الهدف والخلفية زيادة في الحقول دون الحد الأمثل. لذلك، إجراء تقييم كمي ممثل لحقول أقل في أعلى التكبير المفضل. وثانيا، استخدمت فقط قسم واحد، وسط لكل عينة. فمن الممكن، استناداً إلى يعزل الفطرية أو استخدام سلالات الفئران، أن بعض الدراسات قد تؤدي إلى توزيع غير متكافئ للنمو أصله. وفي تلك الحالات، ينبغي كمياً مقاطع إضافية في جميع أنحاء كل كتلة البارافين للحصول على عبئا أكثر تمثيلاً. ثالثا، في التجارب التي تحفز إنتاج كبيرة من موكنيس (أي، تحديد مجرى الهواء نمو الفطريات في الحساسية القصبية الرئوية aspergillosis (ABPA)18 أو التليف الكيسي (CF)18)، منطقة الميكونج الكبرى تفاعلية مع يمكن غير محددة إلى منطقة الميكونج الكبرى + نتائج الغنية السكاريد موكنيس19 وهكذا انحراف بعض العينات صالح أعلى عبء الفطرية. منذ فقط نموذج نيوتروبينيك IA استخدمت في هذه الدراسة، فمن الممكن أن استخدام النماذج المختصة أو القمعية الأخرى محصنة يمكن أن يسفر عن نتائج أقل قابلة للمقارنة. وعلى الرغم من هذه المحاذير، والكمي GMS يوفر تقنية قابلة لمقارنة لتحديد عبء الفطرية، واستعماله المستمر في إجراء دراسات إضافية قد كذلك التحقق من فائدة هذا الأسلوب متسقة وموثوق بها وفعالة من حيث التكلفة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة في جزء من "إنديانا جامعة مدرسة من الطب البحوث تعزيز منحة" ومن المعاهد الوطنية للصحة-نييد 1R03AI122127-01. N.A. جزئيا تدعمها خلال هذه الفترة مهن في "زمالة علم المناعة" من "الرابطة الأمريكية للمناعة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
