Summary
Her beskriver vi en protokoll for å finne lunge fungal byrden i mus med invasiv aspergillose av kvantifisering av Gomoris modifisert methanamine sølv flekker i histologiske deler. Bruk av denne metoden resulterte i sammenlignbare resultater med mindre dyr sammenlignet med vurdering av sopp byrden av kvantitative PCR lunge fungal DNA.
Abstract
Kvantifisering av lunge fungal byrde er avgjørende for fastsettelse av relativ nivåene av immun beskyttelse og fungal virulens i musen modeller av lunge soppinfeksjon. Selv om flere metoder brukes til å vurdere fungal byrden, kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) av sopp DNA har dukket opp som en teknikk med flere fordeler sammenlignet med tidligere kultur-baserte metoder. Foreløpig nødvendiggjør en helhetlig vurdering av lunge patologi, leukocytter rekruttering, fungal byrden og genuttrykk i mus med invasiv aspergillose (IA) bruk av et betydelig antall eksperimentelle og kontroll dyr. Her ble kvantifisering av lunge histologiske flekker for å fastslå fungal byrden med et redusert antall dyr undersøkt i detalj. Lunge deler var farget for å identifisere fungal strukturer med Gomoris modifisert methanamine sølv (GMS) flekker. Bildene ble tatt fra GMS-farget delene fra 4 separate felt av hver formalin-fast parafin-embedded lunge. GMS farget områder innenfor hvert bilde kvantifisert bruker et bilde analyse, og fra denne kvantifisering, mener andelen stained området ble fastslått for hvert utvalg. Bruker denne strategien, redusert eosinophil dårlig mus utstilt fungal byrden og sykdom med caspofungin terapi, mens vill-type mus med IA ikke ble bedre med caspofungin. Tilsvarende fungal byrden i mus mangler γδ T celler ble også forbedret ved caspofungin, målt ved qPCR og GMS kvantifisering. GMS kvantifisering er derfor innført som en metode for bestemmelse av relativ lunge fungal byrden som til slutt redusere antall forsøksdyr kreves for omfattende studier av invasiv aspergillose.
Introduction
IA er en opportunistisk infeksjon som kan utvikle hos disponerte individer med medfødt eller ervervet immun mankoen på grunn av immun undertrykkende terapi eller kronisk infeksjon1,2. Primær infeksjon ofte oppstår i lungene, men i noen tilfeller formidling av Aspergillus fumigatus lever, nyrer, hjertet og hjernen kan oppstå, som resulterer i omfattende vev invasjonen av hyfer ledsaget av alvorlig sykdom og høy utbredelsen av dødelighet1,2. Videre effekten av eksisterende farmakoterapi er begrenset, og kan bli ytterligere svekket av fremveksten av soppdrepende-resistente stammer i miljøet3. Derfor er det viktig å forstå mekanismene for sopp virulens og vert patologi som fremmer utvikling eller forverring av invasiv fungal sykdommen.
Murine modeller fortsatt viktig for mekanistisk IA studier, som de tillater forskere å vurdere rollene fungal virulens gener og vert immun effektor for etablering og vekst av A. fumigatus i vivo4,5. Følgelig utarbeidet flere strategier for å effektivt kvantifisere eller sammenligne fungal byrden i grupper forsøksdyr6,7. Disse strategiene omfatter kultur-basert, biokjemiske, immunanalyse eller qPCR metoder, hver med forskjellige fordeler og ulemper. Videre hver av disse metodene omfatter innvielsen av et delsett av dyr i tillegg til de ofret for vurderinger av immun effektor funksjon, gene expression analyse og komparativ histopatologi7. Dermed krever omfattende IA studier ofte betydelig antall forskning dyr til en betydelig kostnad. Effektive strategier som reduserer eksperimentelle tid, dyr kostnader og etiske betraktninger ved å benytte dyr vev for flere analyser er derfor svært verdifull7.
I denne rapporten er en metode som beskriver kvantifisering av GMS farging i histologiske seksjoner for sammenligning av relativ fungal byrden eksperimentelle undergrupper av mus med IA innført. Hvert trinn fra sopp kultur infeksjon, vev innhøsting og behandling, og bildeopptak dataanalyse, er beskrevet i detalj. Fungal byrdene ved GMS kvantifisering ble sammenlignet med qPCR neutropenic modeller av IA og caspofungin-behandlet vill-type eller eosinophil dårlig mus med IA8. Resultatene viser likhet med GMS kvantifisering og qPCR av sopp DNA. Dette tyder på at GMS kvantifisering kan være nyttig for forskerne engasjert i histologiske analyser som supplerende eller alternativ sammenligning av relativ fungal byrden i mus med IA, og til slutt redusere kostnadene og bruk av forskning dyr i komplekse, mekanistisk studier.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen av Indiana State University, vert campus ved Indiana University School of Medicine-Terre Haute.
1. utarbeidelse av A. fumigatus Conidia for infeksjon
- Mens du arbeider i godt ventilert avtrekksvifte, legge til 125 µL av A. fumigatus 293 lagerløsning 900 µL celle kultur klasse vann (CCGW). Deretter overføre løsningen malt ekstrakt agar (MEA) plate via pipette og jevnt med en inoculating løkke.
- Lagre fungal platen i mørket på 24 ° C i minst 14 dager og ikke mer enn 28 dager.
- Høste conidia med paljetter som beskrevet tidligere9.
- Hell 1,5 g 0,5 mm glassperler på platen og forsiktig vippe den frem og tilbake til perlene er belagt for å trekke ut conidia. Samle perle/conidia blandingen i en 15-mL konisk rør. Avbryte 5 mL Dulbecco fosfat-bufret saltvann (DPBS) og vortex.
- Telle conidia i en 50 x fortynning av nedbryting i DPBS med en hemocytometer. Antall conidia i området som vises i figur 1 og bruk Formel 1 for å Beregn konsentrasjonen.
#Conidia × fortynning faktor × 104= Conidia/mL (Formel 1)
Merk: Flere 4 x 4 rette hjørner områder kan telles, med gjennomsnittet av disse områdene som #Conidia i Formel 1.
Figur 1: Hemocytometer representant området brukes for conidia teller (boksen, pil).
- Fortynn conidia suspensjon med sterilt saltvann (DPBS) for å få ønsket konsentrasjonen, 1.0 x 108 conidia/mL infisert med 5 x 106 conidia/50 µL. forberede 50 µL conidia løsning 'n + 2 mus er infisert kontoen for pipettering feil.
Merk: Standard sopp harvest og forberedelse/filtrering kan være alternativt brukte10. Glass bead metoden brukes til å sikre at conidia prøver med minimal liten/løselig hyphal antigener hentes for aspirasjon.
2. immunsuppresjon og infeksjon i Murine modell
- Bruk 7-10-uke-gamle mus.
Merk: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil-mangelfull (ΔdblGATA, BALB/c bakgrunn), og γδ T celle-mangelfull (TCRδ-/-, B6 bakgrunn) mus ble brukt for denne studien. For hver eksperimentere, alder og kjønn-matchet ble (både menn og kvinner) mus brukt for hver gruppe. - Tømme nøytrofile via intraperitoneal (IP) injeksjon 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly - 6G antistoff i sterilt saltvann på 45° i laterale nederste høyre kvadrant (For en eksperimentell tidsplan, se figur 2).
- 24 timer senere, infisere mus ved aspirasjon med 5.0 x 106A. fumigatus conidia suspendert i 50 µL sterilt saltvann (se trinnene 2.4-2.10) som tidligere beskrevet11. Etter infeksjon, injisere et delsett av dyr med soppdrepende middel som 5 mg/kg caspofungin diacetate i DPBS brukt i denne studien (daglig, se figur 2).
- Bedøve mus med 99,9% isoflurane bruker en veterinær-anestesi maskin.
- Plass et papirhåndkle på gulvet av induksjon kammer å fange avføring og urin.
- Plasser musen i induksjon kammeret sikre lokket og satt vaporizer til 5% isoflurane for 2 minutter og 30 s.
Merk: Vet salve brukes ikke fordi den totale tiden under anestesi er mindre enn 5 minutter. - Redusere vaporizer halvparten av maksimumsinnstilling for 30 s.
- Bekrefte at musen er riktig anesthetized ved å observere bremset puste, manglende bevegelsen og manglende respons til tå-klype stimulans.
- Fjerne musen fra induksjon kammer og sted på en skrå bord. Plass musen med ryggen mot styret. Kontroller at dens øvre fortenner er forsiktig tilbakeholdne med en gummi band og lavere fortenner er forsiktig tilbakeholdne med en metalltråd.
- Nøye holde tungen på full forlengelse med liten tang og pipette 50 µL av conidia/PBS suspensjon på undersiden av tungen.
- Holde tungen på full forlengelse; Lytt etter rask pust og distinkte klikke støy av aspirasjon. Hold i 20 s eller til suspensjon er fullt pustende.
- Fjern musen fra skrå brettet og forsiktig plassere i bur for observasjon.
- Etter aspirasjon, skal musen gjenvinne bevissthet innen 1 min. dataskjerm musen til fullt bevisst og kunne gå rundt buret. Dyrene bør være plassert på 21 ° C og overvåket to ganger daglig til lungene høstes.
- Gjenta uttømming av nøytrofile (trinn 2.2) 24 timer etter infeksjon (figur 2).
Figur 2: eksperimentell tidsplan. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon8.
3. harvest og bevaring av musen lungene for histologiske analyse
- Dypt bedøve dyret med en dødelig dose 0,1 ml 390 mg/ml pentobarbital natrium løsning IP.
- Bekreft euthanasia ved å observere mangel av spontan pusting og fravær av svar lem stimulering med pinsett. Når euthanized, spray i carcass med 70% etanol å sterilisere.
- Plass carcass på et skum bord dekket med en absorberende puten.
Merk: Carcass bør plasseres på ryggen med pinner å sikre alle fire lemmer skum styret. - Åpne øvre brysthulen med saks med forsiktighet. Utstanset ribbe buret slik at lungene og hjertet. Klipp den underlegne vena cava å tillate perfusjon. Unngå klipping blodkar og punktering organer.
- Sakte perfuse med 5 mL kaldt DPBS i høyre ventricle av hjertet i 45° vinkel med en 25-G nål. Gjenta perfusjon med 5 mL av 10% formalin.
- Forsiktig avsløre luftrøret og koble de omkringliggende fett pads. Vær forsiktig og unngå punktering luftrøret. Sørge overflødig bindevevet fjernes for å visualisere fullt luftrøret før du fortsetter. Når luftrøret er utsatt, plassere tang under luftrøret å heve det.
- Dytte et lite hull i øvre luftrøret bruker en 25-G nål.
Merk: Hullet bør plasseres slik at hele kanyle passer i luftrøret. Vær forsiktig for å unngå rupturing luftrøret. - Setter inn en kanyle gjennom hullet og lungene. Sikker kanyle med en kirurgisk tråd knyttet løst rundt luftrøret.
Merk: Hvis luftrøret er utløst, kanyle kan settes forbi luftrøret så langt som mulig i luftveiene. - Bruker en sprøyte, blåse lungene med 1 mL av 10% formalin buffer gjennom kanyle. Kontroller at inflasjonen i lungene er synlig. Hvis ikke, justere kateter og gjenta. Når lungene er oppblåst, raskt fjerne kanyle med forsiktighet og snurp trygt å forsegle av luftrøret.
Merk: Hvis luftrøret er sprukket og lungene kan ikke være oppblåst, lungene kan fortsatt bli høstet, men dette kan hindre riktig fiksering. - Forsiktig fjerne trachea og lungene fra brystet ved nøye koble bindevevet i luftrøret med tang mens forsiktig trekke opp på tråden. Plass lungene og luftrøret i en 50-mL konisk rør med 15 mL 10% formalin bufferen. Plasser én ende av tråden utenfor røret og forsegle cap. Invertere røret å absolutt dykke eksemplet i bindemiddel.
- Lagre prøvene i romtemperatur i minst 24 timer eller til videre behandling.
Forsiktig: Formalin er farlig. Bruke riktig personlig verneutstyr som vernebriller og en ansiktsmaske. Fungerer under kjemiske hette når prosessering prøver.
4. harvest og bevaring av musen lungene for DNA Fungal byrden
- Følg trinnene 3.1-3.5 som beskrevet ovenfor på en separat mus.
- Sakte perfuse med 10 mL kaldt DPBS i høyre ventricle av hjertet i 45° vinkel med en 25-G nål.
- Avgiftsdirektoratet lungene med saks, og plasser i merket 1,5 mL rør.
- Lagre lungene ved-80 ° C før videre behandling.
- Bruk standard teknikk som beskrevet (innebygging og skjæring) og i henhold til produsentens protokoller (se Tabell for materiale).
5. mikroskopi og bildebehandling
- Åpne bildebehandlingsprogrammet kvantifisering (se Tabell for materiale).
- Bruker lys mikroskop, få minst 4 forskjellige felt av Stormestrene farget lysbilder (10 X objektiv). Kontroller at bildene er representant for infiserte luftveiene i lungene med lignende vevs tetthet.
Merk: Hvis tetthet og distribusjon av hyphal foci vises markant forskjellige mellom kontrollen og eksperimentelle grupper, flere felt kan tas eller GMS området delen hele lunge kan avbildes (4 X objektiv). Skaff bilder av de samme områdene i lungene (identifisert av tilsvarende vev morfologi) på en seriell lunge delen med hematoxylin og eosin, om ønskelig. - Legg til skala barer til bildene der det er nødvendig og lagre bilder for å være kvantifisert. Velg Rediger > Legg til/Rediger kalibrering merker > menyen: velge linje tykkelse, farge og skala bar størrelse > Klikk på bildet for hvor baren skala som skal plasseres. Lukk menyen og velg Rediger > flette > flette kalibrering merker > velge Lagre som > gi filen og klikk på lagre.
6. Bruk et behandlingsprogram for Image å beregne Fungal byrden (Figur 3)
- Åpne et bilde-behandlingsprogram. Velg Fil > mappe med prøver å kvantifisere > bilde (figur 3A). Velg bilde > Type > Konverter til "RGB Stack" (figur 3B).
- Bruk piltasten høyre for å velge andre av de tre gitte bildene (figur 3B). Trykk "Ctrl + Skift + T" å oppdra "Terskelen" menyen innstillinger justerer (Figur 3 c). Finn det opprinnelige TIFF eller jpg bildet som referanse og åpne med en bildet viser programmet (Figur 3 c).
- Dra glidebryteren øverst til venstre og justerer bunnen glidebryteren til markert (i rødt) er representant for mikroskopi bildet (vanligvis varierer fra 130-160 som vist til høyre for glidebryteren (Figur 3 c).
- Når valgt, trykk på "Set" > "OK" (figur 3D). Velg "Analysere" > "Sette mål" > Sjekk "Området, området brøk, Limit terskelen, Vis etikett" og la de nederste innstillingene (rullegardinmenyen og desimaler) som standard > "OK" (figur 3D).
- Betydelige deler av mellomrom eller bakgrunn flekker kan ekskluderes ved valg av riktige vevet med et område eller polygon-verktøyet.
- Til slutt velger, "Analysere" > "Tiltak" (et vindu med data skal vises, eller en fane på oppgavelinjen vises merket, "Resultater") (figur 3E). Overføre data til en data analyseprogram for grafisk og statistiske analyser.
- Angi gjennomsnittet av fire området prosenter for hvert lunge utvalg. 5-8 prøver er vanligvis nok til å oppdage betydelige forskjeller mellom grupper. Hvis sammenligne to eksperimentell grupper, utføre en kort student t-test for å fastslå betydningen.
Figur 3: representant skjermbilder for hvert trinn i GMS histologiske feltet kvantifisering. (A) Velg Fil > mappe med prøver å kvantifisere > Velg bilde. (B) Velg bilde > Type > Konverter til "RGB Stack". Bruk piltasten høyre for å velge andre av de tre gitte bildene. (C) Trykk "Ctrl + Skift + T" å oppdra "Terskelen" menyen innstillinger justerer. Finn det opprinnelige TIFF eller jpg bildet som referanse og åpne med Foto Seer program. Dra glidebryteren øverst helt igjen og Juster glidebryteren nederst til markert (i rødt) er representant for mikroskopi bildet (vanligvis varierer fra 130-160 som vist til høyre for glidebryteren. (D) når valgt trykk "sett" > "OK". Velg "Analysere" > "Sette mål" > Sjekk "Området, området brøk, Limit terskelen, Vis etikett" og la de nederste innstillingene (rullegardinmenyen og desimaler) som standard > "OK". (E) til slutt velge "analysere" > "Tiltak" (et vindu med data skal vises, eller en fane på oppgavelinjen vises merket "Resultater"). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. DNA Fungal byrden
- Fjern lungene fra-80 ° C og lyophilize minst 4 h (over natten er optimale) eller til helt tørket av fryse tørr.
- Mens lungene er tørke, forberede DNA utvinning buffer (0.1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, og 0,5% SDS).
- Sted forberedt DNA utvinning bufferen i et vannbad 60 ° C å forvarme. Også legge fenol: kloroform: isoamyl alkohol (25:24:1) i et 50-mL konisk rør og tillate for separasjon.
- Plass lyofilisert lungene i en 2-mL skrukork rør med 0,2 mL glassperler. Bruke en perle visp, grind tørr lungevev for 15-30 s inntil den danner et fint pulver.
- Legge 0,8 mL varm DNA utvinning buffer til hver rør og vortex godt. Inkuber hver rør i 15 min i 65 ° C perle badekar og deretter vortex før rugende for en ekstra 15 min. Etter rugende, vortex og deretter sentrifuge rør 25.000 x g i 10 min.
- Etikett 3 sett med 1,5 mL rør for hver av prøvene og overføre det øverste laget av nedbryting til ett sett med rør. Vær forsiktig mens pipettering ut vandig topplaget for å unngå å forstyrre det midterste laget.
- Legg like volum av fenol: kloroform: isoamyl alkohol og bland godt. Deretter sentrifuge 25.000 x g i 15 min før pipettering ut øvre laget i det andre settet av rør.
- Legge like volum av kloroform: isoamyl kloroform, bland godt og sentrifuge 25.000 x g for 10 min. nøye pipette ut øvre laget i det tredje settet med rør.
- Legger til 500 µL av isopropanol og 50 µL NaoAc (pH 5.2), bland godt og la prøver å ruge ved romtemperatur for 10 min. Deretter sentrifuge 25.000 x g i 30 min og Dekanter nedbryting.
- Vask DNA pellets med 750 µL av is kaldt 70% etanol og sentrifuge for 5 min på 25.000 x g. Decant etanol og la pellets til luft tørke i rørene i en røyk hetter for 40 min.
- Resuspend tørr pellets i 300 µL TE bufferen.
Merk: DNA kan lagres på 20 ° C til kvantifisert. - Kvantifisere DNA bruker et spektrofotometer og forberede 100 µL av 0,2 µg/µL av hver DNA-prøve qPCR analyse.
- Utfører en standard qPCR i tre eksemplarer som tidligere beskrevet med 1 µg av DNA-prøve, fungal 18S rDNA primer, og sonde med en modifisert sonde avsluttes (5'- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3 ")12,13.
- Forberede en standardkurve fra A. fumigatus genomisk DNA og Beregn konsentrasjonen fungal DNA pg i hvert eksempel bruker gjennomsnittlig reporteren fargestoff Ct verdier.
- Tegne pg/µg fungal DNA med standard feil av gjsnitt. Utfører en student t-test analyse å finne betydningen.
Merk: som et mindre giftig alternativ til fenol-kloroform DNA utvinning brukt her, kolonnen basert DNA utvinning grensesnittsett kan bli brukt.
Representative Results
Figur 4 inneholder en graf av overlevelse av vill type eller eosinophil dårlig mus med IA behandlet med caspofungin. Resultatene viser at eosinophil dårlig mus utstilt økt overlevelse sammenlignet med vill-type mus (50% dødelighet versus 100% dødelighet, henholdsvis). Figur 5 viser representant GMS flekker fra neutropenic vill-type og eosinophil dårlig mus med IA behandlet eller ubehandlet med caspofungin. Caspofungin behandlingen resulterte i relativ fungal klarering i eosinophil dårlig, men ikke vill-type mus (høyre panel), mens begge grupper som ikke fikk caspofungin lignende (venstre panel). Figur 6 viser sammenligningen av sopp byrden i caspofungin-behandlet og kontrollere ubehandlet vill-type eller eosinophil dårlig mus, med begge qPCR av sopp DNA (figur 6A) og representant GMS kvantifisering av 4 (10 X objektiv) felt) Figur 6B). Resultatene fra begge teknikkene viser at caspofungin behandling resultater i viktigste fungal byrden redusere mellom vill-type og eosinophil dårlig mus (figur 6A). Men i ubehandlet mus resultert bare GMS kvantifisering i en betydelig reduksjon i mus mangler eosinofile (figur 6B). Når hele-lunge GMS-farget deler mener området ble beregnet (4 X mål), forskjellene var lik resultatene med 4 representant 10 X felt, men med mindre statistisk signifikans (figur 6C). Figur 7 viser overlevelse, bilder av representant GMS flekker (4 10 X felt) og kvantifisering av sopp byrden av begge metoder i γδ T celle-mangelfull (TCRδKO) mus som ble behandlet med caspofungin i forhold til kontrollen, ubehandlet mus. Caspofungin behandling økt overlevelse (figur 7A) og fungal byrden (figur 7BD) i TCRδKO mus. Ligner resultatet av figur 6, resultatene av sopp byrden målt ved qPCR (figur 7B) og representant GMS kvantifisering (figur 7C) var sammenlignbare.
Figur 4: økt overlevelse i eosinophil-mangelfull (ΔdblGATA) mus med IA etter behandling med caspofungin. 15-30 mus/gruppe. Sammendrag av 3-6 eksperimenter. p < 0,0001. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant bilder av GMS-farget lunge inndelinger fra vill-type, eosinophil mangelfull, og caspofungin-behandlet eller kontrollen ubehandlet mus med IA. Representant for 3-4 mus/gruppe. Skala bar tilsvarer 100 µm. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Fungal byrden i vill-type, eosinophil dårlig mus med IA behandlet eller kontroll behandlet med caspofungin. (A) qPCR av sopp DNA. 15-30 mus/gruppen Sammendrag av 3-6 eksperimenter. (B) GMS kvantifisering av histologiske seksjoner, mener % av GMS flekker fra 4 felt (10 x objektiv). (C) GMS kvantifisering, mener % av hele lunge delen (4 X objektiv). B og C er en oppsummering av 5 mus/gruppe. p < 0,05. p < 0,001. p < 0,0001. Dette tallet ble generert ved hjelp av data som ble rapportert i forrige publikasjonen8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: redusert alvorlighetsgraden av IA i γδ T celle-mangelfull mus etter caspofungin behandling. (A) overlevelse. (B) qPCR av sopp DNA. (C) GMS kvantifisering av histology. (D) representant bilder av GMS-farget inndelinger fra γδ T celler med IA, behandlet eller ubehandlet med caspofungin. A og B er en oppsummering av to eksperimenter med 7-10 mus/gruppe. C og D er en oppsummering av 4 mus/gruppe. p < 0,05. p < 0,01. p < 0,001. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Hensikten med denne artikkelen var å innføre en metode for bestemmelse av lunge fungal byrden i mus med IA ved å benytte GMS-farget lunge histologiske seksjoner for bildeanalyse og kvantifisering. I denne studien, behandling med β Glukan-syntese-målretting soppdrepende stoffet caspofungin14 ble ikke bedre overlevelse eller sopp byrden i neutropenic vill-type mus med IA8. Men i fravær av eosinofile eller γδ T celler, overlevelse og fungal byrden forbedret. Resultatene av vår undersøkelse viste også at sammenlignbare resultater kan oppnås ved GMS fungal byrden i forhold til den brukte fungal DNA qPCR metode6.
Det er flere fordeler med å utnytte GMS fungal byrden kvantifisering. Først kan prosessen utnytte eksisterende histologiske prøver, dermed potensielt redusere antall eksperimenter må bestemme betydelige forskjeller. Andre i denne studien var mindre dyr nødvendige for GMS fungal byrden kvantifisering å oppnå betydelige forskjeller i forhold til qPCR av sopp DNA (figur 6, figur 7). Tredje påvirkes sammenligning av sopp byrden på ulike isolater av qPCR av isolere-avhengige forskjeller i ribosomal DNA kopi nummer15. Derimot er GMS kvantifisering ikke berørt av antall kopier, som sopp byrden bestemmes av relativ lunge soppvekst. Dermed bruk av GMS kvantifisering for sopp belastningen minsker vertebrate dyr og krever ikke før fastsettelse av rDNA kopi. Til slutt, i tillegg til å endre fungal morfologi, caspofungin terapi øker fungal fragmentering og dermed øke kunstig fungal byrden med isolering av kolonien danner enheter fra lunge homogenates12,16 ,17. Dermed unngår GMS kvantifisering av sopp byrden flere begrensninger med andre vanlige metoder.
Begrensningene for GMS kvantifisering og/eller denne studien er imidlertid viktig å merke seg. Først forfatterne antatt en sammenlignbare fordeling av hyphal vekst gjennom lungene av hver forsøksgruppen, og dermed brukes kvantifisering fra 4 representant 10 x objektive felt som et representativt mål for sopp byrden i hele lungene (Figur 6B). Det er mulig at i noen tilfeller relativ fordeling, størrelsen og tettheten av hyphal foci ville tilstrekkelig varierer slik at sopp byrden vises annerledes med denne metoden og tilsvarende av metoden qPCR. Imidlertid våre flere resultater med hele lunge delen kvantifisering ved hjelp av 4 X objektiv viste lignende, men mindre statistisk signifikante forskjeller mellom grupper (figur 6C). Standardfeilen for denne kvantifisering ble økt med denne strategien, sannsynligvis på grunn av redusert hyphal oppløsning med 4 X mål og økt bakgrunn i suboptimal felt. Derfor foretrekkes en representant kvantifisering av færre felt på høyere forstørrelse. Andre er ble bare en enkel, sentral del brukt til hvert utvalg. Det er mulig, basert på sopp isolert eller mus stammer brukes, at noen studier kan resultere i en ujevn fordeling av hyphal vekst. I slike tilfeller, bør inndelinger i hver parafin blokk kvantifiseres for å få et mer representativt byrden. Tredje i eksperimenter som induserer betydelig produksjon av mucins (dvs., kvantifisere airway soppvekst allergisk bronkopulmonal aspergillose (ABPA finner)18 eller cystisk fibrose (CF)18), GMS kryssreaksjon med polysakkarid-rike mucins19 kan ikke-spesifikk GMS + resultater og dermed forskyve eksempler for høyere fungal byrden. Siden bare neutropenic modell av IA ble brukt i denne studien, er det mulig at bruk av andre immun kompetent eller undertrykkende modeller kan resulterer i mindre sammenlignbare resultater. Til tross for disse begrensningene, GMS kvantifisering gir en tilsvarende teknikk for å fastslå fungal byrden, og dens fortsatte bruk i flere studier kan videre validere nytten av denne metoden som konsekvent, pålitelig og kostnadseffektiv.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien var støttes delvis av en Indiana universitet skolen av medisin ekstrautstyr forskningsstipend og NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. ble delvis støttet i denne perioden av en karriere innen immunologi fellesskap fra den amerikanske foreningen Immunologists.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
