Summary
Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.
Abstract
Inselversetzung ist vorgeschlagen worden, eine mögliche Behandlung für Typ-1-Diabetes sein. Den letzten überzeugende Hinweise darauf, dass intravaskulären Inselchen Infusion bei weitem nicht Ideal ist und daher das Omentum ist wieder auf dem Vormarsch als potenziell wertvollen Standort für Inselversetzung. Dieses Experiment erfordert die Isolierung von hochwertigen Inselchen und die Implantation von den kleinen Inseln an der diabetischen Empfänger. Transplantation, das Omentum erfordert chirurgische Schritte, die optisch besser nachgewiesen werden können. Hier sind die einzelnen Schritte für dieses Verfahren vorgestellt. Zwei Methoden die isolierte Inseln mit Hydrogel zu mischen, bevor Sie die Mischung in den omentalis Beutel von diabetischen Mäusen platzieren werden hier beschrieben. Verschiedenen Hydrogele werden für die unterschiedlichen Bedingungen verwendet. Blutzuckerspiegel der Diabetiker Maus Empfänger Phänomen Inselchen in der Omentum wurden bis zu 35 Tagen beobachtet. Einige Tiere geopfert wurden nach 14 Tagen, Immuno-histochemische Analyse durchzuführen. Diese prä-klinischen Transplantation Ansatz kann als vorläufige Daten vor der Übersetzung bis zur klinischen Transplantation verwendet werden.
Introduction
Laut der International Diabetes Federation (IDF) betrifft Diabetes Mellitus derzeit 382 Millionen Menschen mit einer projizierten Anstieg auf 592 Millionen Menschen durch 2035-1. In beiden allogene und xenogene Inselversetzung ist systemischer immunsuppressive Therapie notwendig. Ohne Immunsuppression ist Immunabwehr eine der Hauptursachen des Transplantats Verlust2. Auch gibt es ein erhebliches Problem der transplantierten Inselchen Verlust aufgrund der sofortigen Blut vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR)3,4. Aber auch in Abwesenheit einer Immunantwort z. B. in Phänomen oder Auto-Transplantation Modelle, Inselzellen transplantiert in der Leber über die Pfortader verloren aufgrund einer Entzündung und/oder ungünstigen Umgebungsbedingungen, wie z. B. schlechte Durchblutung Versorgung mit eingeschränkter Oxygenierung und/oder Nährstoffe5,6. Infolgedessen um langfristige metabolische Funktion zu gewährleisten, sind höhere Inselchen Zahlen notwendig, um die erste Zelle Verlust auszugleichen, die Engraftment7reduziert.
In einem Versuch, die Insel Engraftment optimieren mehrere alternative anatomische Standorte wurden experimentell untersucht sowie klinisch, mit dem Versprechen, noch keine endgültige Ergebnisse8. Während einige der alternativen Websites einfachen und sicheren Zugang bieten (zB., Haut, Niere Kapsel, gastrische Submukosa und Vorderkammer des Auges) oder eine breitere Fläche für größere Insel Massen (zB., Bauchhöhle), überleben und physiologische metabolische Leistung der transplantierten Inselchen noch begrenzt sind und bleiben ein Anliegen-9. Die Suche nach einem geeigneteren Standort für Inselchen Engraftment ist im Gange.
Das Omentum war unter den vielen anatomischen Stätten, die in der frühen Entwicklung der Inselversetzung untersucht und erwies sich eine erfolgreiche Umgebung für Inselchen10,11,12,13wurden, 14. Allerdings intraportal Inselchen Infusion wurde die klinische Wahl Due teilweise auf die relative Einfachheit des Verfahrens und erste Erfolge in der Tier-Modelle6. Auch auszugsweise, die negative damit verbundenen Website, besonders massive frühem Verlust der Insel, waren weniger verstanden und weniger einschränkend in den frühen Tagen der experimentellen Inselversetzung als Feld gereift. Mit neueren zwingende Beweise, die darauf hinweist, dass intravaskulären Inselchen Infusion weit von ist eignet sich das Omentum wieder auf dem Vormarsch als potentiell wertvolle Website für Stammzelltransplantation.
Das Omentum (in Form von einem omentalis Beutel) bietet relative Vorteile gegenüber der Leber15,16. Es ist gut vaskularisierte und leicht zugänglich. Es ermöglicht Abruf des Transplantats (falls erforderlich) und/oder Biopsie. Die ischämische Periode erlebt durch die kleinen Inseln ist im Vergleich zu der Leber reduziert, und das Omentum kann relativ akzeptieren, dass große Inselchen Massen, die nicht intraportally, wo ein Druckanstieg Portal kann Komplikationen verursachen können.
Ein Phänomen Mausmodell der Transplantation diente in das Protokoll in der Studie beschäftigt C57BL/6 männliche Mäuse zwischen 6 – 8 Wochen alt, mit einem Körpergewicht von 20 – 25, g. Islet Empfänger Diabetiker mit einer einzigen Injektion von Streptozocin mit einer Dosis von 250 gerendert wurden, getestet mg/kg Ip. Die Induktion von Diabetes kann als erfolgreich, wenn der Blutzuckerspiegel der Maus größer als 24 Mmol/L 48 h nach der Injektion ist und über diesem Niveau bei einem Mindestaufenthalt von 5 Tagen bleibt.
Phänomen Inselchen wurden isoliert aus der Bauchspeicheldrüse von Alter abgestimmt Geber auf zuvor veröffentlichten Methoden mit einigen Änderungen. Kurz gesagt, wurde die Kollagenbildung in der Gallenblase anstelle der Gallengang injiziert. Dies geschah als eine Verbesserung um die Benutzerfreundlichkeit der Injektion zu erleichtern. Kollagenase-Infusion war gefolgt von Inkubation, Gewebe Störungen, gradient Dichtetrennung und Handlese, reine Inselchen zu erhalten. Inselchen wurden kultiviert über Nacht in CMRL-1066 Medium ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in Korbflaschen T175 bei 37 ° C unter 95 % Luft - 5 % CO2 vor der Transplantation.
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Protocol
Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden von der medizinischen Animal Center der Guangdong Provinz erhalten. Die Verwendung von Tieren wurde von der Ethik Review Committee der Shenzhen zweiten Volks Krankenhaus, nach den Grundsätzen des Tierschutzes genehmigt.
(1) Inselversetzung, das Omentum
Hinweis: Dieses Protokoll erfordert 2 Personen zu erreichen.
- Montieren Sie chirurgische Materialien, die in Tabelle 1aufgeführt sind. Bereiten Sie aseptischen Bereich im OP-Bereich mit sterilen Materialien wie Vorhänge und Einwegartikel und erhalten Sie aseptische Bedingungen in der gesamten Operation zu. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente. Sterile Kleider zu tragen.
- Wählen Sie die Inseln mit einer 200 µL Pipettenspitze unter dem Stereomikroskop. Jede Maus erhalten 450 – 500 Islet Äquivalent (IEQ) pro Tansplant. Für jedes Tier Platz genug Inselchen für eine einzelne Transplantation in ein steriles 1,5 mL Snap-Top Rohr mit 100 µL CMRL-1066 Medium.
Hinweis: Inselchen können am Tag der Transplantation isoliert werden, aber es ist besser, sie am Vortag zu isolieren, um Wiederherstellung für die Isolierung Prozess ermöglichen. - Halten Sie die Snap-Top-Rohre mit kleinen Inseln auf dem Eis bis zu verpflanzen.
- Tauen Sie der Basalmembran Matrix Hydrogel auf und halten sie auf dem Eis nach Herausnahme aus der Tiefkühltruhe-20 ° C. Das Hydrogel ist bei 4 ° C bis 10 ° C flüssig und erstarrt bei höheren Temperaturen.
- Wiegen Sie und Etikettieren Sie aller diabetische Mäusen Empfänger. 60 mg/kg Pentobarbital-Natrium intraperitoneale Injektion. Test der die Tiefe der Narkose durch die Verabreichung einer Zehe-Klemme. Geben Sie eine zusätzliche 10 mg/kg-Pentobarbital-Natrium, reagiert das Tier auf die Prise. Wenn es gibt keine zurückziehen Reflex, das Niveau der Anästhesie ist korrekt für die Chirurgie.
- Tupfer der Operationsstelle auf dem Bauch mit 70 % Ethanol. Rasieren Sie die Haare von der Website mit einer Razer Blade und desinfizieren Sie den Bereich mit Jodophor. Verwalten Sie Tierarzt Salbe für die Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Verwenden Sie die ophthalmologische Schere um den Bauch entlang der Mittellinie des Bauches durch einen Schnitt von 4 bis 5 cm. Bewegung öffnen den Darm auf die linke Seite und decken mit Kochsalzlösung getränkten Gaze, übermäßige Austrocknung bei der Operation zu verhindern.
- Können Sie Wattestäbchen vollständig aussetzen das Gesichtsfeld des Magens und lokalisieren das Omentum (befindet sich unterhalb des Magens). Verwenden Sie zwei Paare von feinen Pinzette um das Omentum ausdehnen. Achten Sie darauf, um Beschädigungen durch reißen zu vermeiden.
- Das Hydrogel ist zu diesem Zeitpunkt vollständig aufgetaut. Drehen Sie das Rohr mit den Inselchen für 30 s bei 200 x g und Entfernen der Überstand. Aspirieren Sie 50 µL Hydrogel, das Röhrchen mit den kleinen Inseln hinzu, und Aufschwemmen Sie die Mischung sanft Vermeidung von Blasenbildung. Halten Sie die Rohre auf dem Eis während des Verfahrens.
- Verwenden Sie zwei Paare der Zange zu holen die Kanten der Omentum und sanft heben Sie es zum bilden einer Furche zwischen den Magen Wand und Darm, die eine kleine Menge Flüssigkeit mit der Islet Transplantation aufnehmen können.
- Lassen Sie die zweite Person in das Verfahren zu unterstützen und aspirieren Sie die resuspendierte Insel-Hydrogel-Mischung (der gesamte Inhalt des Röhrchens) mit einer Pipettenspitze 200 µL, liefern Sie die Inhalte in die Nut.
- Stellen Sie sicher, dass die Mischung in die Nut gut aufgestellt ist, durch sanft anheben oder Absenken der Kanten der Omentum. Komplette Positionierung der Mischung innerhalb von 3 Minuten vor dem Hydrogel erstarrt als Effekt der Körpertemperatur. Wenn das Hydrogel untergegangen ist, Falten Sie das Omentum um das Transplantat zu decken.
Hinweis: das Omentum haften an der umgebenden Magen Wand wie Hydrogel erstarrt. - Nachdem das Hydrogel völlig erstarrt ist, verwenden Sie Wattestäbchen, um den Darm wieder in die Bauchhöhle, kümmert sich um die Website der Transplantation nicht berühren neu zu positionieren.
- 20 µL der Cephalosporin hinzufügen (5 ~ 10 mg) in der Bauchhöhle um Infektionen zu vermeiden, verwenden Sie dann 4: 0 Naht um den Bauch zu schließen.
- Die Maus in seinen Käfig zurück und wiederholen Sie alle Schritte für jede Maus-Empfänger. Halten Sie die Mäuse warm und überwachen Sie visuell zu, bis sie voll und ganz ausreichend Bewusstsein um sternalen liegen beizubehalten wiederhergestellt. Bewahren Sie die Mäuse von anderen Tieren getrennt auf, bis sie sich vollständig erholt haben.
- Injizieren Sie 50 µL Cefazolin Natrium (0,05 mg/mL) pro Tag für eine Woche als postoperative Prophylaxe. Bupivicaine + Buprenorphin zu verwalten, d. h. gelten 1-3 Tropfen von 0,25 % Bupivicaine an der Schnitt Stelle topisch vor Platzierung der Wunde Clips. Verwalten Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) über die intraperitoneal (IP)-Route.
- -Fasten Blutzuckerspiegel aus einer Rute-Vein Blutprobe mit einem Blutzuckermessgerät Messen einmal am Tag nach der Transplantation. Beim Umpflanzen, das Omentum, kann die Islet Transplantation haben eine verzögerte Funktion und ein ganz normaler Blutzuckerspiegel für 2 – 3 Wochen nicht zu erreichen.
- Entfernen Sie für Histologie das omentalis Transplantat von der Maus am Ende des Experiments nach der Transplantation. Befestigen Sie das Gewebe nach der histologischen Protokolle. Das Transplantat kann für Immunostaining oder Immunfluoreszenz Studien analysiert werden.
2. alternative Methode für die Transplantation, das Omentum
Hinweis: Eine alternative Fibrin-Thrombin-Hydrogel, die bei Raumtemperatur verwendet wird kann die Basalmembran Matrix Hydrogel ersetzt werden. Es besteht aus 2 Komponenten, einem Fibrin Sealer Proteinlösung (50 U/mL Thrombin und 10 mg/mL Fibrinogen). Wenn die Komponenten vermischt sind, bilden sie ein Blutgerinnsel, das die kleinen Inseln an Ihrem Platz hält.
- Verwenden Sie das Fibrin-Thombin Hydrogel zusammengesetzte bei Raumtemperatur. Wie in Schritt 1.2 erhält jede Maus 450 – 500 Inselchen Äquivalente (IEQ) / Transplantation. Legen Sie die kleinen Inseln in einem sterilen 1,5 mL Snap-Top-Rohr mit 100 µL CMRL-1066 Medium. Unmittelbar vor der Transplantation, aspirieren Sie die kleinen Inseln in einer sterilen PE50 Schläuche für eine Länge von 10 cm und sanft Zentrifugieren (30 s bei 200 X g), eine lose Pellets zu bilden.
- Bereiten Sie das Tier, wie oben (Schritte 1,5-1,8) mit dem Omentum ausgebreitet. Mischen Sie die Hydrogel-Komponenten (10 µL/Stück) und auf das Omentum. (Abbildung 3D)
- Die Inseln von den Schlauch auf das Hydrogel sofort zu vertreiben. Das Hydrogel bildet ein Gerinnsel um die Inseln. (Abbildung 3E)
- Umklappen Sie das Omentum, Hydrogel und Inselchen, einen Beutel zu bilden. (Abbildung 3F) Führen Sie Schritte 1.13 auf 1.18.
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Representative Results
Post-Digestive Zustand der Bauchspeicheldrüse ist in Figur 1Adargestellt. Gereinigte Inselchen sind in Abbildung 1 bdargestellt. Dithizone Färbung und Lebensfähigkeit Prüfung der Inseln sind in Abbildung 2dargestellt. Die wichtigsten Schritte von der Inselversetzung, das Omentum sind in Abbildung 3dargestellt. Die Blutzuckerwerte der Empfänger nach omentalis Transplantation sind in Abbildung 4dargestellt. Histologische Analyse der Transplantate ist in Abbildung 5dargestellt.
Abbildung 1 : Pankreas Verdauung und Inselchen Isolation. (A) der Bauchspeicheldrüse nach der Verdauung. Beachten Sie die Sand-Partikel in der Suspension. (B) Lichtmikroskopie Bild der Inseln nach Isolierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Insel Dithizone Färbung und Fluoreszenz Lebensfähigkeit Farbstoffe. (A) Inseln sind durch Dithizone rot gefärbt. (B) Lichtmikroskopie. (C) Propidium Jodid-Fluoreszenz-rote Färbung (abgestorbene Zellen). (D) Calcein-AM grünen Färbung (lebensfähige Zellen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Transplantation in das Omentum. (A) nach dem Empfänger Laparotomie Magen ausgesetzt ist und das Omentum gelegen. (B) Inseln sind gemischt in Hydrogel und langsam auf das omentalis Gewebe platziert. (C) Islet Transplantation bei höherer Vergrößerung. Das Hydrogel ist ein halb erstarrten Zustand. (D) Alternative Methode. Hydrogel befindet sich auf dem Omentum ohne Inselchen. (E) Inseln befinden sich auf der Oberseite der Hydrogel. (F) das Omentum wird um die Inseln gefaltet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Blut Glukose Niveau nach der Transplantation. Nicht nüchtern Blutzuckerwerte von Empfängern (n = 7) bis zu 35 Tage nach der Transplantation. Die Transplantat-Empfänger hat nicht alle die gleiche Charge von Inseln erhalten, so gibt es Unterschiede in Qualität und Funktion, was zu starken Schwankungen im Blutzuckerspiegel.
Abbildung 5 : Histologie. Transplantat-Abschnitte (Transplantat Abruf 14 Tage nach der Transplantation) waren mit DAPI (Kerne), Anti-Maus-Insulin-Antikörper und Hämatoxylin gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Inselversetzung in die Leber über die Pfortader ist die am häufigsten verwendete Methode der Inselversetzung beim Menschen, aber es gibt noch Effizienz und Sicherheitsbedenken wie Portalader Thrombosis und Leber Steatose17. Neuere Studien zeigen, dass das Omentum eine geeignete Alternative zu der Leber, aber muss noch mehr Forschung vor der Übersetzung klinischer12,14,18,19durchgeführt werden kann.
Die Maus ist ein geeignetes Modell für die Prüfung der Omentum als Standort für Inselversetzung. In der Maus das Omentum befindet sich unter der Magenwand und wird in der Regel gefaltet. Jedoch ist die Größe des Omentum bei Mäusen klein und schwierig zu erreichen. Um es für die Transplantation zu verwenden, ist es notwendig, sanft zu seiner vollen Größe verteilt dann umklappen, nach der Inseln/Hydrogel-Mix hinterlegt ist. Bei einem größeren Tier omentalis Gewebe ist umfangreicher und kann eine oder mehrere Beutel zu konstruieren, in denen die kleinen Inseln abgelagert werden, vernäht. Die Maus Omentum ist zerbrechlich und leicht lehnt Nähte ohne zu brechen. Aus diesem Grund wird ein Hydrogel verwendet, um die Tasche ohne Nähte.
Bei der ersten Methode (Schritte 1.1 – 1,18) das Hydrogel verwendet ist eine Basalmembran Matrix und besteht aus Laminin, Kollagen IV und Wachstumsfaktoren. Es erstarrt wie es auf Körpertemperatur erwärmt. Bei der zweiten Methode (Schritte 2.1-2.4) dient eine unterschiedliche Hydrogel, bestehend aus 50U/mL Thrombin und 10 mg/mL Fibrinogen. Zwei verschiedene Hydrogele werden verwendet, um die Vielseitigkeit dieser Technik zeigen. Es kann zu vielen Gegebenheiten anpassen und nachweisen des Prinzips angepasst werden. Für klinische Anwendungen, ob eine genähten Tasche oder eine klinische Grade Hydrogel verwendet wird, die Technik ist kombinierbar mit einem minimal-invasiven Ansatz (zB., eine endoskopische Methode der Lieferung an das Omentum). Zu diesem Zweck sind zusätzliche Studien mit größeren Säugetieren präklinischen Modellen erforderlich.
Die Zeit, die Blutzuckerwerte in der Maus-Empfänger zu normalisieren, nach Transplantation in das Omentum in unseren sowie andere Studien legen nahe, dass die Inseln in der Omentum benötigen etwas längere Zeit ausreichend Insulin-Produktion zu erreichen. Revaskularisation Effizienz scheint ein wichtiger Faktor zu sein, wie in der Studie beschrieben. Ob das Vorhandensein von einem Hydrogel die Geschwindigkeit der Insel Revaskularisation und Leistung betrifft, bleibt das ermittelt werden.
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Disclosures
Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Einige der Autoren dieser Arbeit wurden zum Teil durch Zuschüsse aus nationalen Schlüssel R & D Program of China (2017YFC1103704), Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds für High Level medizinische Disziplin Bau von Shenzhen (2016031638), unterstützt Shenzhen-Stiftung für Wissenschaft und Technologie (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Stiftung Gesundheit und Familienplanung-Kommission (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
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