Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Summary

Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.

Abstract

La microscopia confocal proporciona una metodología accesible para capturar las interacciones celulares esenciales para la caracterización y el desarrollo de los agentes marcados con sondas fluorescentes. Con los avances recientes en droga citotóxica anticuerpo basado en sistemas de entrega, comprensión de las alteraciones inducidas por estos agentes en el ámbito de agregación del receptor y de internalización es de vital importancia. Este protocolo utiliza la metodología bien establecida de immunocytochemistry fluorescente y la distribución de FIJI de código abierto de ImageJ, autocorrelación incorporado y funciones matemáticas de la imagen, para realizar la correlación espacial de la imagen Espectroscopia (ICS). Este protocolo quantitates la intensidad fluorescente de receptores etiquetados en función de la zona de la viga del microscopio confocal. Esto proporciona una medida cuantitativa del estado de agregación de la molécula blanco en la superficie celular. Esta metodología se centra en la caracterización de las células estáticas con potencial para ampliar en las investigaciones temporales de la agregación del receptor. Este protocolo presenta una metodología accesible para proporcionar la cuantificación de la agrupación los eventos que ocurren en la superficie de la célula, utilizando bien establecido técnicas y aparatos de proyección de imagen no especializado.

Introduction

El desarrollo de anticuerpos terapéuticos ha demostrado un éxito notable en el tratamiento de varios tipos de tumor¹. Los avances recientes de conjugados de anticuerpos-drogas (ADC) como mecanismos de entrega para los compuestos citotóxicos ha ampliado los requisitos para la comprensión de la dinámica de las interacciones del anticuerpo: receptor en la célula superficial². Tras la selección exitosa de un anticuerpo para el receptor de superficie celular, estos complejos pueden inducir patrones de agregación similares a los observados en las interacciones de ligand: anticuerpo³. Alteraciones en la agregación de receptores pueden inducir cambios en la membrana y el resultado de la internalización de los receptores y su retiro de la superficie de la célula. En el contexto de un conjugado de anticuerpo-drogas, este proceso libera posteriormente la carga citotóxica en endosomas internalizada y, posteriormente, el citoplasma, resultando en muerte celular efectiva.

La microscopia confocal ha proporcionado un medio eficaz de visualizar estas interacciones importantes de anticuerpos y sus receptores de destino⁴. Para explorar los cambios de agregación de la molécula de la blanco en la superficie celular de este protocolo utiliza el post procesamiento de imágenes de microscopía confocal mediante una imagen espacial correlación espectroscopia (ICS) técnica ^5,6,7 .

La base de la espectroscopia de correlación de la imagen es la observación que las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia espacial comparten una relación con el estado de agregación y densidad de las estructuras marcadas. Esta relación se establece siguiendo el cálculo de una función de autocorrelación espacial de una imagen capturada⁵.

Todas las variantes de la espectroscopia de correlación de imagen requieren el cálculo de la autocorrelación de una imagen. Esto es seguido por el montaje de esta función a una curva gaussiana bidimensional para la extracción de parámetros de estado de agregación Cuantitativa contenida en la imagen. En términos simples, el cálculo de la autocorrelación de una imagen implica comparar todos los pares de píxeles posible dentro de una imagen y calcular la probabilidad de que ambos igualmente tan brillante como uno al otro. Esto se visualiza como una función de la distancia y las direcciones de píxeles de separación⁸.

El marco teórico de la espectroscopia de correlación de imagen fue establecido y definido por Petersen y Wiseman et al. ^{5 , 6}. en el presente Protocolo, se realizan los cálculos de la autocorrelación en Fiji/ImageJ, así como una aplicación de hoja de cálculo, la base para la función de autocorrelación espacial de fluctuación de intensidad puede ser descrita como (Eq 1):

     

donde F representa la transformada de Fourier; F⁻¹ lo contrario Fourier transforma; F * su conjugado complejo; y el desfase espacial variables ε y η. En el ICS espacial, como se describe en este protocolo, la función de autocorrelación se puede calcular utilizando un 2D fast Fourier transform algoritmo^7,9. La autocorrelación en cero separación espacial conocido como cero lag, g₁₁(0,0), proporciona la inversa media del número de partículas presentes por área de la viga del microscopio. Puede obtenerse ajustando la función de autocorrelación espacial para una función Gaussiana bidimensional (Eq 2):

     

Como los píxeles capturados dentro de una imagen se encuentran dentro de un área de juego y estas mediciones no se extienden al infinito, el término g∞ se utiliza como un desvío para tener en cuenta las correlaciones espaciales largo alcance dentro de la imagen. Para agregados de tamaño molecular, ω es la función de punto de difusión del microscopio y descrito por el ancho en el medio máximo de la función de autocorrelación espacial. El área contenida dentro de la función de punto de extensión del instrumento se puede calibrar mediante el uso de perlas fluorescentes resolución sub.

Para el protocolo de espectroscopia de correlación imágenes descrito, la autocorrelación y funciones matemáticas requeridas para completar el ICS se realizan utilizando la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto, Fiji¹⁰, una distribución del ImageJ programa^11,12. Fiji/ImageJ utiliza la transformación de Fourier rápida preinstalada en la función FFT matemáticas. Esta función reduce el tiempo de cálculo necesario de este cálculo reduciendo el intervalo de datos por un factor de dos en cada dimensión¹³. Como la función de autocorrelación 2D es aproximadamente simétrica en x, eje y, un diagrama de Perfil de sola línea a través de la imagen de autocorrelación puede utilizarse para medir la autocorrelación crudo como una función de rezago espacial. Elimina cualquier ruido cero lag antes de más cálculo, con la consiguiente amplitud de autocorrelación (valor máximo de g(0)_T) corregida para el fondo con la expresión (Eq 3):

     

donde I_{es la intensidad media de una región de fondo excluyendo la célula} . La densidad de cluster, o densidad de los objetos fluorescentes, es definida por (Eq 4):

    

En el protocolo descrito en este documento, lo más simplemente el cálculo de la densidad de cluster (CD), con la asunción basada en la observación de que una función de autocorrelación normalizada decaerá en un valor a 1.0 con el aumento de rezago espacial. Con máximo desfase espacial, hay no más cualquier correlación de fluorescencia valores de intensidad y así sin una correlación los cálculos en esta región son computando el valor de una intensidad multiplicada por esta intensidad que posteriormente se divide por el Plaza de esa intensidad, que por definición es igual a 1.0. Por lo tanto, densidad de clúster desde una función de autocorrelación normalizada puede ser computado restando 1.0 de la función de autocorrelación normalizada antes de tomar su recíproco (Eq 5):

     

Calibración adicional de la zona de la viga se puede realizar para cuantificar el número de grupos dentro de la zona de la función de punto de extensión del instrumento. Esta calibración debe realizarse con las mismas condiciones ópticas utilizadas durante el análisis de espectroscopia de correlación de imágenes.

Protocol

1. siembra de células adherentes para el experimento de la proyección de imagen Semilla de 10.000 células de carcinoma epidermoide A431 por bien durante la noche (O/N) en 300 μL de medios de Eagle modificado medio/nutrientes mezcla F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco con 10% Suero Fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% GlutaMAX en 8 cámaras de imagen diapositiva apto para lentes de objetivo de inmersión de aceite de alta resolución (por ejemplo, NuncTM Lab-TekTM cámaras cubreobjetos)….

Representative Results

Un experimento de espectroscopia de correlación de imagen exitosa depende de la correcta aplicación de los controles de tratamiento. Estos grupos de tratamiento incluyen la examinación de la fluorescencia en ningún anticuerpo primario y no grupos de tratamiento de anticuerpo secundario. Una vez que la configuración óptima láser confocal se establece para un experimento, deben capturar imágenes de estos grupos de control para confirmar la ausencia de fluorescencia no específica de…

Discussion

La técnica de espectroscopia de correlación de imagen (ICS) que describimos en el presente Protocolo utiliza microscopios confocales estándar sin la necesidad de detectores especializados. La técnica ICS descrita utiliza métodos de inmunocitoquímica bien establecidos a prever el muestreo rápido de múltiples condiciones de tratamiento para el análisis estadístico mayor. Esta metodología lo hace con una ligera reducción en la precisión absoluta en comparación con técnicas alternativas a la sola molécula bas…

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG