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Developmental Biology

रासायनिक विच्छेदन और Planarian में ग्रसनी के पुनर्जनन Schmidtea mediterranea

Published: March 26, 2018 doi: 10.3791/57168
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Medicine, College of Veterinary Medicine, Cornell University

Summary

planarian Schmidtea mediterranea स्टेम सेल और ऊतक पुनर्जनन के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । इस प्रकाशन के चुनिंदा एक अंग हटाने के लिए एक विधि का वर्णन है, ग्रसनी, रासायनिक सोडियम azide के लिए जानवरों को उजागर करके. इस प्रोटोकॉल भी ग्रसनी पुनर्जनन की निगरानी के लिए तरीकों की रूपरेखा ।

Abstract

Planarians flatworms हैं जो उत्थान में अत्यंत दक्ष हैं. वे स्टेम सेल की एक बड़ी संख्या है कि तेजी से चोट के किसी भी प्रकार का जवाब कर सकते है करने के लिए इस क्षमता देना है । इन जानवरों में आम चोट मॉडल ऊतक है, जो कई अंगों को नुकसान की बड़ी मात्रा को हटा दें । इस व्यापक ऊतक क्षति को दूर करने के लिए, हम यहाँ एक विधि चुनिंदा planarian Schmidtea mediterraneaमें एक ही अंग, ग्रसनी, हटाने के लिए वर्णन. हम cytochrome oxidase अवरोधक सोडियम azide युक्त समाधान में पशुओं को भिगोने के द्वारा इस लक्ष्य को प्राप्त । सोडियम azide के लिए संक्षिप्त जोखिम पशु से ग्रसनी के बाहर निकालना का कारण बनता है, जिसे हम "रासायनिक विच्छेदन" कहते हैं । रासायनिक विच्छेदन पूरे ग्रसनी निकालता है, और एक छोटे से घाव उत्पन्न करता है जहां ग्रसनी आंत के लिए देता है । व्यापक धोने के बाद, सभी विच्छेदित जानवरों लगभग एक सप्ताह में एक पूरी तरह कार्यात्मक ग्रसनी पुनर्जीवित । शरीर के बाकी हिस्सों में स्टेम कोशिकाओं को नए ग्रसनी के पुनर्जनन । यहां, हम रासायनिक विच्छेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और दोनों ऊतकवैज्ञानिक और व्यवहार विधियों का वर्णन करने के लिए सफल विच्छेदन और उत्थान का आकलन ।

Introduction

पुनर्जनन एक घटना है कि पशु किंगडम भर में होता है, कुछ अकशेरूकीय में पूर्ण शरीर पुनर्जनन से रीढ़ में अधिक प्रतिबंधित क्षमताओं को लेकर अपक्षयी क्षमता के साथ1. कार्यात्मक ऊतकों के प्रतिस्थापन एक जटिल प्रक्रिया है और अक्सर एकाधिक कोशिका प्रकार के एक साथ बहाली पर जोर देता है । उदाहरण के लिए, समन्दर का अंग, osteoblasts, chondrocytes, न्यूरॉन्स, मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने के लिए, और उपकला कोशिकाओं को प्रतिस्थापित किया जा करने की आवश्यकता2. इन नव उत्पंन सेल प्रकार भी व्यवस्थित करने के लिए ठीक से नए अंग समारोह की सुविधा की जरूरत है । इन जटिल प्रक्रियाओं को समझना तकनीक है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के उत्थान और अंगों में उनके एकीकरण पर ध्यान केंद्रित की आवश्यकता है ।

एक reअपक्षयी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सरल करने के लिए नियोजित रणनीतियों में से एक या तो कुछ सेल प्रकार या ऊतकों का बड़ा संग्रह के लक्षित पृथक है । उदाहरण के लिए, zebrafish में, विशिष्ट कक्ष प्रकारों में nitroreductase की अभिव्यक्ति metronidazole3,4के अनुप्रयोग के बाद उनके विनाश की ओर ले जाती है । Drosophila लार्वा में ऊतक-विशिष्ट प्रवर्तकों के अधीन समर्थक अपोप्तोटिक जीन व्यक्त कर काल्पनिक डिस्क5,6के विशिष्ट क्षेत्रों को चुनिंदा रूप से ablate कर सकते हैं । इन रणनीतियों के दोनों तेजी से लेकिन नियंत्रित क्षति का कारण है, और आणविक और सेलुलर काटना उत्थान के लिए जिंमेदार तंत्र का इस्तेमाल किया गया है ।

इस पांडुलिपि में, हम चुनिंदा एक पूरे अंग ablate planarian Schmidtea mediterraneaमें ग्रसनी बुलाया एक विधि का वर्णन । Planarians पुनर्जनन के एक शास्त्रीय मॉडल, उनके विपुल अपक्षयी क्षमता के लिए जाना जाता है, जहां भी मिनट टुकड़े पूरे जानवरों को फिर से विकसित कर सकते है 7,8। वे दोनों pluripotent कोशिकाओं और वंश-प्रतिबंधित progenitors9,10,11से मिलकर स्टेम कोशिकाओं की एक बड़ी, विषम जनसंख्या है । इन कोशिकाओं पैदा करना और सभी लापता ऊतकों, ग्रसनी, तंत्रिका, पाचन और निकालनेवाला प्रणालियों, और मांसपेशी और उपकला कोशिकाओं 9, 10, 12 सहित बदलने के लिए अंतर । जबकि हम जानते है कि इन स्टेम सेल पुनर्जनन शुरू, हम पूरी तरह से आणविक तंत्र है कि उंहें ड्राइव इन सभी विभिंन प्रकार के सेल की जगह समझ नहीं है । परिभाषित घायल तरीकों कि सटीक स्टेम सेल की प्रतिक्रियाएं इस जटिल प्रक्रिया चित्रित मदद कर सकते है ।

ग्रसनी एक बड़े, बेलनाकार ट्यूब खिलाने के लिए आवश्यक है, और न्यूरॉन्स, मांसपेशी, उपकला और स्रावी कोशिकाओं13,29शामिल हैं. आम तौर पर जानवर के ventral पक्ष पर एक थैली में छिपा हुआ, यह भोजन की उपस्थिति संवेदन पर जानवर के एकल शरीर खोलने के माध्यम से फैली हुई है । चुनिंदा ग्रसनी विच्छेदन करने के लिए, हम एक रसायन सोडियम azide बुलाया में planarians सोख, एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया संवेदनाहारी में सी. एलिगेंस14,15,16। planarians में इसका इस्तेमाल पहले एडलर एट अल., 201412में द्वारा सूचित किया गया था । सोडियम azide के लिए जोखिम के मिनट के भीतर, planarians अपने pharynges बाहर निकालना, और कोमल आंदोलन के साथ, ग्रसनी जानवर से अलग । हम "रासायनिक विच्छेदन" के रूप में ग्रसनी के इस पूर्ण और चयनात्मक नुकसान का उल्लेख । विच्छेदन के बाद एक सप्ताह, एक पूरी तरह कार्यात्मक ग्रसनी12बहाल कर रहा है । क्योंकि ग्रसनी खिलाने के लिए आवश्यक है, कार्यात्मक पुनर्जनन खिला व्यवहार की निगरानी द्वारा मापा जा सकता है । नीचे, हम रासायनिक विच्छेदन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है, और ग्रसनी और खिला व्यवहार की बहाली के उत्थान का आकलन करने के लिए ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. planaria पानी की तैयारी 17
    1. एक 1x montju मैं सी नमक समाधान में planarians बनाए रखें । planarian पानी तैयार करने के लिए, 1 मीटर CaCl2, 1 एम MgSO4, 1 एम MgCl2, 1 मीटर KCl और 5 मीटर NaCl के ultrapure पानी में व्यक्तिगत स्टॉक समाधान करें । फ़िल्टर-एक 0.2 µm बोतल टॉप filterfor लंबी अवधि के भंडारण के साथ निष्फल ।
      नोट: montju मैं सी लवण तैयार करने के लिए केवल ultrapure जल (25 डिग्री सेल्सियस पर 18.2 MΩ की एक प्रतिरोधकता के साथ) का उपयोग करें ।
    2. 5x नमक सॉल्यूशन का 1 एल स्टॉक तैयार करने के लिए, 1 मीटर CaCl2, 5 एमएल के 1 एम MgSO4, MgCl2के 0.5 एमएल, 0.5 एमएल के KCl और 1.6 एमएल के 5 एमएल NaCl के ५ मिलीलीटर का मिश्रण, 900 मिलीलीटर ultrapure पानी में । इस समाधान के लिए, NaHCO3 के ०.५०४ g जोड़ें और मिश्रण करने के लिए हलचल । हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ पीएच 7.0 को समायोजित करें ।
    3. इस तरह एक बड़ी क्षमता काबोइ के रूप में एक बाँझ कंटेनर में ultrapure पानी में एक 1x काम एकाग्रता के लिए इस 5x स्टॉक समाधान को पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) । अलैंगिक planarians को बनाए रखने के लिए इस 1x समाधान का प्रयोग करें ।
      नोट: montju मैं सी नमक समाधान के लिए एक विकल्प के रूप में, स्थानीय रूप से खरीदा वसंत पानी या ultrapure एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मछलीघर नमक मिश्रण युक्त पानी का उपयोग करें (सामग्रीकी तालिका देखें) 0.5 g/L18 की एकाग्रता पर ।
    4. स्थिर संस्कृति19में बैक्टीरियल संक्रमण को रोकने के लिए, एक एंटीबायोटिक युक्त पानी में planarians बनाए रखने । एक 50 मिलीग्राम/एमएल gentamicin सल्फेट के ultrapure पानी और फिल्टर-बंध्याकरण में स्टॉक समाधान तैयार करें । कंटेनरों जहां जानवरों को बनाए रखा है करने के लिए, 50 µ g/एमएल (1:1000 कमजोर पड़ने) के एक अंतिम एकाग्रता के लिए gentamicin सल्फेट जोड़ें ।
  2. लिवर चिपकाने की तैयारी
    1. के रूप में planarians कार्बनिक, घास खिलाया बीफ़ जिगर के एक आहार पर पनपे, ताजा जिगर और प्रक्रिया 24 घंटे के भीतर खरीद झिल्लीदार यह बंद छील धीरे से जिगर encapsulating कैप्सूल निकालें । में जिगर काट ~ 1-cm cubes, और एक ब्लेड का उपयोग करने के लिए बंद परिमार्जन और सभी यकृत नसों और धमनियों का त्याग ।
    2. Macerate जिगर टुकड़े एक खाना मिल या एक खाद्य प्रोसेसर का उपयोग कर और फिर यह एक तार मेष खाद्य छलनी के माध्यम से पारित । पेस्ट्री बैग में गठबंधन, और सीरिंज या 35 मिमी पेट्री व्यंजन में बांटना । खिलाने से पहले, धीरे से हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए केंद्रापसारक ।
    3. का उपयोग करने से पहले एक वर्ष और गल के लिए-80 डिग्री सेल्सियस पर जिगर की दुकान aliquots । गल जाने के बाद, किसी भी बचे हुए जिगर को एक बार फिर से फ्रीज करें, या 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. पशुओं के रखरखाव
    1. Planarians बढ़ेगा और खिलाने की आवृत्ति के आधार पर विभिन्न आकारों के लिए हटना होगा । हर दूसरे हफ्ते planarians फ़ीड (एक बार हर 14 दिन) । लंबी अवधि के थोक संस्कृतियों के लिए, विभिन्न आकारों के प्लास्टिक कंटेनरों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. पशुओं को खिलाने के लिए, एक धातु रंग या प्लास्टिक हस्तांतरण प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए एक बॉक्स में एक मटर-जिगर की बूंद आकार जगह है । जानवरों को 1-2 एच के लिए खाने की अनुमति दें । डिब्बा साफ करने से पहले शेष भोजन निकालें ।
    3. साफ कीड़े एक सप्ताह में दो बार अगर खिलाया (एक बार सीधे खिलाने के बाद और एक बार दो दिन बाद), या एक बार एक सप्ताह अगर नहीं खिलाया । साफ करने के लिए, एक प्लास्टिक के चोंच में पानी को ध्यान से बाहर डालने के लिए पानी से बाहर planarians जबकि बॉक्स में रखना । एक कागज तौलिया के साथ बॉक्स सतह पोंछें, तो सभी पक्षों पर दोहराने जब तक बॉक्स साफ है ।
    4. पानी की जगह (बॉक्स मात्रा के लगभग ¾ के लिए) और 50 µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए gentamicin जोड़ें । एक अंधेरे कैबिनेट में या एक 20 डिग्री सेल्सियस मशीन में जानवरों की दुकान ।
  4. कीड़े का चयन
    1. चुनें कीड़े कि फेड थे 5-7 दिन पहले ।
      नोट: यह काफी अधिक है कि हाल ही में खिलाया गया है कीड़े से pharynges काटना मुश्किल है (1-2 दिन विच्छेदन से पहले) । तंग पशु भी सोडियम azide के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं ।
    2. कीड़े कि लंबाई में लगभग 6 मिमी का चयन करें । कीड़ा के आकार का अनुमान लगाने के लिए, यह एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण । या तो एक फ्लैट 6-शासक में या 5 मिमी x 5 मिमी पेट्री डिश के नीचे ग्राफ कागज और यह क्रॉल जबकि कृमि लंबाई उपाय ।
      नोट: कीड़े लंबाई में 6 मिमी से छोटे और अधिक काटना मुश्किल है ।
  5. सोडियम azide की तैयारी
    1. planaria पानी में सोडियम azide पाउडर को भंग करके एक 100 mM घोल तैयार करें ।
      सावधानी: सोडियम azide विषाक्त है और ध्यान से संभाला जाना चाहिए । नाली के नीचे सोडियम azide न छोड़ें । उपयोग के बाद, यह खतरनाक कचरे के रूप में निपटान के लिए अलग से इकट्ठा ।

2. ग्रसनी विच्छेदन

  1. एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश में कीड़े प्लेस । सावधानी से एक प्लास्टिक हस्तांतरण प्लास्टिक का उपयोग करके पकवान से सभी planarian पानी निकालें ।
    नोट: २० ६ मिमी के एक अधिकतम कीड़े आराम से इस आकार की एक डिश में शामिल किया जा सकता है ।
  2. इस डिश को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और आवर्धन को समायोजित करें ताकि एकाधिक वॉर्म एक साथ देखे जा सकें (उदा. 10x आवर्धन). 100 मिमी सोडियम azide समाधान के साथ planarian पानी बदलें ।
    नोट: एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए, सोडियम azide के लगभग 5 मिलीलीटर पर्याप्त है । समाधान planarians को पूरी तरह से जलमग्न कर देना चाहिए । आवश्यक के रूप में बड़े व्यंजन के लिए समाधान मात्रा समायोजित करें ।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत जानवरों की निगरानी और पहले 3-4 मिनट के लिए पकवान जाने से बचना.
  4. माइक्रोस्कोप के माध्यम से ग्रसनी के बाहर निकालना निरीक्षण; ग्रसनी ग्रसनी थैली से बहर और पूरी तरह से विस्तार होगा (लगभग लंबाई में 1 मिमी) के रूप में चित्र 1bमें दिखाया गया है ।
    नोट: यह जब तक ग्रसनी आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से विस्तार समाप्त हो गया है इंतज़ार करना महत्वपूर्ण है । एक बार ग्रसनी जानवर से उभर, पूर्ण विस्तार लगभग 1 मिनट लेता है ।
  5. एक प्लास्टिक हस्तांतरण प्लास्टिक का प्रयोग करें पकवान चारों ओर पशु धार । प्लास्टिक में जानवरों चूसना और जबरन उंहें पकवान में रिलीज के कई बार । यदि ग्रसनी पूरी तरह से विस्तारित है, इस जोरदार pipetting यह अलग करने के लिए कारण होगा ।
  6. वैकल्पिक रूप से, ग्रसनी को या तो उसकी लम्बाई के साथ, या क्षैतिज रूप से ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर अपनी परिधि के साथ समझ ( सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में चित्रा 1Cमें दिखाया गया है । ग्रसनी संदंश में चुटकी के साथ, meniscus की ओर पशु ऊपर उठा । जानवर उठाया है के रूप में, सतह तनाव ग्रसनी पशु से अलग करने के लिए कारण होगा ।
    नोट: इस विधि का इस्तेमाल छोटे जानवरों की pharynges को दूर करने के लिए किया जा सकता है (1-3 mm लंबाई में) जहां जबरदस्ती घूमता पर्याप्त नहीं है । poking से बचें या अंयथा पशु के शरीर को घायल ।
  7. एक स्थानांतरण प्लास्टिक का प्रयोग, ताजा planaria पानी युक्त एक नई डिश के लिए काट जानवरों को स्थानांतरित ।
  8. एक बार तबादला, planaria पानी में अच्छी तरह से काट जानवरों कुल्ला, पूर्ण रूप से पानी का आदान प्रदान तीन बार । gentamicin के 50 µ g/मब के साथ planaria जल युक्त एक नई डिश को अंतरण ।
    नोट: इन तीन बहाकर के दौरान पूरा बफर एक्सचेंज सोडियम azide को हटाना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।
  9. अगले दिन, ताजा planaria पानी के साथ पकवान में पानी की जगह 50 µ g/gentamicin के एमएल । इसके बाद हर दूसरे दिन दोहराएं ।

3. विच्छेदन के बाद ग्रसनी हटाने का आकलन

  1. एक माइक्रोस्कोप के तहत पशुओं की जांच करें (10-20X आवर्धन के साथ) एक अंधेरी जगह ग्रसनी के सफल हटाने के बाद दिखाई दिया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया है ।
  2. वैकल्पिक रूप से, फिक्स और ब्लीच जानवरों पियरसन एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार. 20. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) या फ्लोरोसेंट-संयुग्मित streptavidin (1 मिलीग्राम/एमएल पतला 1:500 में रात भर जानवरों को सोख 0.3% ट्राइटन-एक्स युक्त खारा) । में स्लाइड पर माउंट पशु 80% ग्लिसरॉल/20% 1x फास्फेट एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope (चित्रा बी) के तहत खारा और छवि बफर.
    नोट: इस पांडुलिपि में सभी छवियों को एक 1.0 x उद्देश्य के साथ एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope पर कब्जा कर लिया गया ।

4. भोजन के व्यवहार को मापने के द्वारा ग्रसनी पुनर्जनन का मूल्यांकन

  1. जिगर की तैयारी
    1. एक microcentrifuge या शंकु ट्यूब में जिगर पेस्ट की आवश्यक मात्रा स्थानांतरण । एयर बुलबुले को दूर करने के लिए संक्षेप में स्पिन । जिगर की मात्रा का अनुमान है, और फिर इसकी मात्रा के 1/5 के लिए planaria पानी जोड़ने के लिए, और लाल खाद्य रंग में कुल मात्रा का 2%. उदाहरण के लिए, जिगर पेस्ट के 1000 µ एल, planaria पानी के 200 µ एल जोड़ें और खाद्य रंग के 24 µ एल.
    2. एक प्लास्टिक खल, पिपेट टिप या धातु रंग का प्रयोग, अच्छी तरह से मिश्रण जब तक खाद्य रंग समान रूप से जिगर पेस्ट में वितरित किया जाता है । फिर संक्षेप में स्पिन । जिगर पेस्ट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है 24 ज या aliquots में जमे हुए-80 ° c लंबी अवधि के भंडारण के लिए ।
    3. 25 पशुओं के लिए परीक्षण करते हैं, प्रति डिश जिगर पेस्ट के 25 µ एल तैयार (लगभग 1 µ एल प्रति पशु जिगर पेस्ट की) ।
  2. पशु खिला
    1. रासायनिक विच्छेदन के बाद सात दिन, एक नई पेट्री डिश के लिए पशुओं हस्तांतरण । यदि 10-15 पशुओं के परीक्षण, एक 35 मिमी पकवान का उपयोग करें; 60 एमएम पेट्री डिश में 15 से अधिक जानवरों का परीक्षण किया जाना चाहिए । पशुओं को अंधेरे में रखें, परेशान न करें, लगभग 1 घंटे तक दूध पिलाने से पहले ।
    2. कैंची का प्रयोग, संकीर्ण अंत के बंद मोटे तौर पर ½ सेमी trimming द्वारा एक P200 पिपेट टिप की चौड़ाई में वृद्धि । प्लास्टिक डिश में लाल लिवर पेस्ट के 25 µ एल.
      नोट: अंत ट्रिमिंग pipetting चिपचिपा जिगर पेस्ट आसान बनाता है । जिगर को सतह पर तैरते से रोकने के लिए, वितरण करते समय डिश के नीचे करने के लिए टिप को छूने ।
    3. पशुओं के लिए 30 मिनट के लिए फ़ीड की अनुमति दें ।
    4. एक सफेद पृष्ठभूमि पर जानवरों को रखने या उन्हें 10-20X आवर्धन के साथ एक खुर्दबीन के नीचे की जांच करके खाया है कि जानवरों की संख्या स्कोर ।
    5. खिलाने के बाद, पकवान और साफ से जिगर को हटा दें ।

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Representative Results

सोडियम azide के लिए जोखिम planarians के सामान्य गतिशीलता बाधित, जानवरों के कारण खिंचाव और writhe. इन आंदोलनों ग्रसनी जानवर के ventral पक्ष से उभरने के लिए मजबूर, और सोडियम azide समाधान में लगभग 6 मिनट के बाद, ग्रसनी के सफेद टिप देखा जा सकता है (चित्रा 1b-बाएँ पैनल). कुछ ही मिनटों के बाद, जानवरों को सक्रिय रूप से अनुबंध और पूरी तरह से जोर से शरीर के बाहर धक्का द्वारा ग्रसनी का विस्तार । (आरेख 1b-मध्य फलक)। लगभग 11 मिनट azide एक्सपोजर के बाद, जानवरों और ग्रसनी आराम करो । इस स्तर पर, ग्रसनी की विशेषता घंटी आकार स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है (चित्रा 1b-सही पैनल). आसान विच्छेदन के लिए, यह ग्रसनी आराम करने के लिए प्रतीक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

ग्रसनी ऊतक के एक बड़े, विकृत जन है, क्योंकि यह काट जानवरों के पृष्ठीय पक्ष पर एक अंधेरी जगह की उपस्थिति में यह परिणाम को हटाने (चित्रा 2a). इस अंधेरे क्षेत्र जीवित पशुओं में सफल विच्छेदन का एक दृश्य सूचक है । स्पॉट विच्छेदन के बाद तुरंत दिखाई दे रहा है और अगले दिन और अधिक प्रमुख हो जाता है । के रूप में ग्रसनी पुनर्जीवित, इस क्षेत्र हल्का । ग्रसनी पुनर्जनन अधिक ठीक की निगरानी करने के लिए, जानवरों DAPI या फ्लोरोसेंट-संयुग्मित streptavidin रात भर के साथ दाग किया जा सकता है (चित्रा बी)। मात्रात्मक ग्रसनी पुनर्जनन की सीमा का आकलन करने के लिए, अपने क्षेत्र ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा जा सकता है ।

ग्रसनी chemosensation और भोजन घूस के लिए एक आवश्यक अंग है । जब इन कार्यों पुनर्जनन के दौरान बहाल कर रहे है निर्धारित करने के लिए, हम पशुओं के व्यवहार की निगरानी परख खिला इस्तेमाल किया । जिगर पेस्ट के साथ रंग भरने वाली खाद्य के संयोजन से, हम जानवरों है कि उन है कि नहीं था से खाया भेद करने में सक्षम थे (3 ए चित्रा)। हम तो एक कार्यात्मक ग्रसनी के साथ पशुओं के प्रतिशत का आकलन करने के लिए लाल जानवरों की संख्या quantified । चित्र3 में दिखाए गए परिणामों के आधार पर, सफल खिला व्यवहार विच्छेदन के बाद 7 दिनों बहाल किया गया था, यह दर्शाता है कि एक सप्ताह ग्रसनी हटाने के बाद, जानवरों एक कार्यात्मक ग्रसनी पुनर्जीवित किया है । सोडियम azide जोखिम खिला व्यवहार प्रभावित है कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम सोडियम azide में जानवरों को भिगोया, लेकिन यह तुरंत ग्रसनी इंजेक्शन से पहले बाहर धोया. एक दिन बाद, हम मूल्यांकन कि भोजन की मांग व्यवहार सोडियम azide जोखिम से खिला परख के साथ बदल गया था । एक ग्रसनी की कमी रासायनिक-काट जानवरों के विपरीत, सभी जानवरों सोडियम azide जोखिम के बाद एक बरकरार ग्रसनी को बनाए रखने खाया (n = 30 प्रत्येक शर्त के लिए जानवरों) खाना । यह परिणाम इंगित करता है कि सोडियम azide एक्सपोज़र खिला व्यवहार को प्रभावित नहीं करता है, जब तक ग्रसनी बरकरार रहता है ।

Figure 1
चित्र 1 . ग्रसनी इंजेक्शन और विच्छेदन । (क) planarian एनाटॉमी की योजनाबद्ध. (ख) 100 मिमी सोडियम azide में भिगोने पर ग्रसनी इंजेक्शन दिखा लाइव जानवरों की छवियाँ. लाल तीर ग्रसनी हाइलाइट । स्केल सलाखों = 750 µm. (ग) जीवित पशु की छवि (बाएं) और योजनाबद्ध विच्छेदन का उपयोग (दाएं) संदंश । पैनलों ग्रसनी मनोरंजक के लिए दो अलग विकल्प दिखाते हैं । पशु चेहरे के Ventral ओर । स्केल बार्स = 500 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . ग्रसनी विच्छेदन और पुनर्जनन के मूल्यांकन । (क) पहले और विच्छेदन के बाद निर्दिष्ट समय पर जीवित पशुओं के प्रतिनिधि छवियों । मध्य पैनल विच्छेदन के बाद ग्रसनी क्षेत्र में अंधेरे स्थान से पता चलता है, धराशायी सफेद बॉक्स से प्रकाश डाला । पृष्ठीय ओर चेहरे । स्केल सलाखों = 500 µm. (ख) पहले और विच्छेदन के बाद निर्दिष्ट समय पर Alexa488-streptavidin के साथ दाग जानवरों के प्रतिनिधि छवियों. मध्य पैनल विच्छेदन के बाद ग्रसनी के अभाव से पता चलता है । ग्रसनी क्षेत्र सफेद बॉक्स से प्रकाश डाला । Ventral ओर चेहरे. स्केल बार = 500 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3। ग्रसनी पुनर्जनन के मूल्यांकन । (एक) छवियों और खिला परख के योजनाबद्ध, एक 60 मिमी पेट्री डिश के केंद्र में 25 µ एल जिगर के रख द्वारा आयोजित किया । योजनाबद्ध (ऊपर, बाएँ) और छवि (मध्य) बरकरार pharynges के साथ जानवरों में खिला व्यवहार दिखाएँ. ऊपर सही, जानवर है कि खाया है की छवि । योजनाबद्ध (नीचे बाएं) और विच्छेदन के बाद 1 दिन जानवरों में खिला व्यवहार के (मध्य) छवि । नीचे सही, पशु है कि नहीं खाया है । स्केल बार = 750 µm. (ख) खिला परख के परिणाम । विच्छेदन के बाद विशिष्ट समय में भोजन (लाल रंगाई द्वारा quantified) निगल लिया है कि जानवरों का प्रतिशत । प्रत्येक समय बिंदु के लिए, n = 10 पशुओं, तपसिल में दोहराया । त्रुटि बार = एसडी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल सोडियम azide का उपयोग ग्रसनी के चयनात्मक पृथक की एक विधि का वर्णन । planarians में अंय लक्षित पृथक अध्ययन संशोधित सर्जरी का इस्तेमाल किया है photoreceptors21 या औषधीय उपचार ablate dopaminergic ंयूरॉंस को दूर करने के लिए22। मौजूदा तरीकों पर रासायनिक विच्छेदन का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह सर्जरी की आवश्यकता नहीं है । planarian शरीर के बाकी की तुलना में ग्रसनी की कठोर संरचना जानवर है, जो बहुत नरम शरीर से अपनी पूरी हटाने की सुविधा । इसके अलावा, ग्रसनी एक छोटे से जंक्शन पर पशु से अलग (घेघा)30 ग्रसनी और आंत में शामिल होने, एक बड़ा शल्य चिकित्सा उपकरण द्वारा प्रेरित एक से अधिक reproducible घाव पैदा. अपने भौतिक गुणों और पशु के आराम करने के लिए छोटे संरचनात्मक संबंध के आधार पर, ग्रसनी हटाने इसलिए अन्य शल्य विच्छेदों की तुलना में अधिक सजातीय घाव उत्पन्न करता है ।

सोडियम azide के लिए जोखिम की लंबाई भी इस तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि सोडियम azide के लिए संक्षिप्त जोखिम प्रतिकूल planarians को प्रभावित नहीं करता है, लंबे समय तक जोखिम विषाक्त है और अंततः जानवरों को मार देंगे । सोडियम azide cytochrome oxidase23,24के निषेध के माध्यम से ऊर्जा पर निर्भर प्रक्रियाओं को बाधित करने के लिए जाना जाता है । इसके अलावा, यह प्रतिलेखन और अनुवाद, तनाव granules25में इन प्रतिक्रियाओं के प्रमुख घटकों के संचय की संभावना को रोकता है । planarians में, सोडियम azide एक्सपोजर 24 घंटे के लिए बँटवारा को दबा देता है, जिसके बाद कोशिकाओं के प्रसार12फिर से शुरू. इस तरह के azide जोखिम के समय सीमित रूप में संशोधन, पूरी तरह से धोने के साथ azide को हटाने, और प्रयोगात्मक डिजाइन में क्षणिक mitotic दमन के लिए लेखांकन इन सीमाओं को दूर मदद कर सकते हैं ।

ग्रसनी और इसकी विशेषता रेडियल समरूपता के अद्वितीय संरचनात्मक स्थिति नव पुनर्जीवित ग्रसनी ऊतक के पहले से मौजूदा स्टेम कोशिकाओं के आसान अंतर के लिए अनुमति देते हैं । ग्रसनी पुनर्जनन सेलुलर और संरचनात्मक streptavidin और DAPI, immunohistochemistry, या सीटू संकरण में 26द्वारा जैसे ऊतक दाग का उपयोग कर स्तर पर नजर रखी जा सकती है । खिला परख यहां बताया परख ग्रसनी के कार्यात्मक पुनर्जनन । भोजन के प्रति Chemotaxis ग्रसनी27,28 और एक पूरी तरह कार्यात्मक ग्रसनी के बिना पशुओं के भोजन की घूस नहीं कर सकते की आवश्यकता है । अंग समारोह के इस सरल, मात्रात्मक मूल्यांकन इसलिए संरचनात्मक पुनर्जनन पूरक । इसके अतिरिक्त, रासायनिक विच्छेदन जानवरों की आबादी पर किया जा सकता है, और समान चोटों के साथ कई जानवरों उत्पन्न कर सकते हैं । प्रक्रिया इसलिए बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए सुविधाजनक है । ये फायदे, तथ्य यह है कि एक परिपक्व ग्रसनी के पुनर्जनन स्टेम कोशिकाओं की आवश्यकता के साथ युग्मित, ग्रसनी विच्छेदन एक आदर्श मॉडल अंग पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए बनाता है । व्यापक विच्छेदन के साथ संयोजन में प्रयुक्त, ग्रसनी हटाने कैसे घाव आकार और संरचनात्मक स्थिति प्रभाव स्टेम सेल की प्रतिक्रिया के बारे में परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चोट, जो पुनर्जनन क्षेत्र21में एक महत्वपूर्ण सवाल है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम ऐलेजैंड्रो Sánchez Alvarado, जो इस तकनीक के प्रारंभिक अनुकूलन और विकास का समर्थन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । कैरोलिन है एडलर प्रयोगशाला में काम कॉर्नेल विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Fisher Chemical C79-3 Montjuïc salt solution
Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) Fisher Chemical M65-3 Montjuïc salt solution
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) Acros/VWR 41341-5000 Montjuïc salt solution
Potassium Chloride (KCl) Acros Organics/VWR 196770010 Montjuïc salt solution
Sodium Chloride (NaCl) Acros Organics/VWR 207790050 Montjuïc salt solution
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Acros Organics/VWR 123360010 Montjuïc salt solution
Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot ThermoFisher Scientific/VWR 2324-0015 Storing planaria water
Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands Amazon Planaria water
Gentamicin Sulfate Gemini Bio-products 400-100P Planaria water
Razor blades Electron Microscopy Sciences 71970 Mincing liver 
Disposable pastry bags-16”, 12 pack Wilton Amazon Liver aliquots
5 mL syringes BD/VWR 309647 Liver aliquots
Petri dishes-35mm/60mm Greiner Bio-One/VWR 82050-536/82050-544
Plastic containers (various sizes) Ziploc Amazon Housing planarians in static culture
Sodium Azide Sigma S2002
Transfer pipette Globe Scientific 138030
Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 Electron Microscopy Sciences  72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100 Sigma T8787
DAPI  ThermoFisher 62247
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher S11223
Glycerol Fisher BioReagents BP229-1

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References

  1. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
  2. Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
  3. Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
  4. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
  5. Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
  6. Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
  7. Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
  8. Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
  9. Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
  10. Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
  11. van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
  12. Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
  13. Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
  14. Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
  16. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
  17. Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
  18. Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
  19. Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
  20. Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
  21. LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
  22. Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
  23. Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
  24. Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
  25. Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
  26. Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
  27. Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
  28. Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
  29. Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
  30. Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).

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विकास जीवविज्ञान अंक 133 Planaria ग्रसनी अंग विच्छेदन स्टेम सेल पुनर्जनन खिला व्यवहार
रासायनिक विच्छेदन और Planarian में ग्रसनी के पुनर्जनन <em>Schmidtea mediterranea</em>
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Shiroor, D. A., Bohr, T. E., Adler,… More

Shiroor, D. A., Bohr, T. E., Adler, C. E. Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea. J. Vis. Exp. (133), e57168, doi:10.3791/57168 (2018).

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