Summary
Planarian Schmidtea mediterranea er en utmerket modell for å studere stilk celler og vev gjenfødelse. Denne publikasjonen beskriver en metode for å selektivt fjerne en orgel, pharynx, ved å utsette dyr til den kjemiske Natriumazid. Denne protokollen skisserer også metoder for å kartlegge pharynx gjenfødelse.
Abstract
Planarians er Flatormer som er svært effektiv i fornyelse. De skylder denne evnen til et stort antall stamceller som raskt kan svare på alle typer skader. Felles skade modeller i disse dyrene fjerne store mengder vev, som skader flere organer. For å overvinne dette brede vevsskade, beskriver vi her en metode for å selektivt fjerne en enkelt organ, pharynx, i planarian Schmidtea mediterranea. Vi oppnå dette ved soaking dyr i en løsning som inneholder cytochrome oxidase hemmer Natriumazid. Kort eksponering for Natriumazid fører utelukkelse av pharynx fra dyr, som vi kaller "kjemiske amputasjon." Kjemisk amputasjon fjerner hele pharynx og genererer et lite sår der pharynx festes til tarmen. Etter omfattende rense, generere alle amputert dyr en fullt funksjonell pharynx i ca en uke. Stamceller i resten av kroppen kjøre regenerering av nye pharynx. Her gir vi en detaljert protokoll for kjemiske amputasjon og beskrive både histologiske og atferdsmessige metoder for å vurdere vellykket amputasjon og gjenfødelse.
Introduction
Fornyelse er et fenomen som oppstår i hele dyreriket, med regenerativ akselrasjonsevner oppstiller fra hele kroppen gjenfødelse i enkelte dyr til mer begrenset evner i virveldyr1. Utskifting av funksjonelle vev er en kompleks prosess og ofte innebærer samtidige restaurering av flere celletyper. For eksempel å regenerere salamander lem, osteoblasts, chondrocytes, nerveceller, muskler og epitelceller må erstattet2. Disse nygenererte celletyper må også organiseres riktig å lette nye lem funksjonen. Forstå disse komplekse prosesser krever teknikker som fokuserer på fornyelse av spesifikke celletyper og deres integrering i organer.
En av strategiene ansatt å forenkle studere regenerative svar er den målrettede ablation enten visse celletyper eller større samlinger av vev. For eksempel i sebrafisk fører uttrykk for nitroreductase i spesifikke celletyper til deres ødeleggelse etter metronidazole3,4. I Drosophila larvene, kan uttrykke pro-apoptotisk gener under vev-spesifikke arrangører selektivt ablate regioner imaginal plate5,6. Begge disse strategiene rask, men kontrollerte skade, og har blitt brukt til å analysere molekylære og cellulære mekanismer ansvarlig for gjenfødelse.
I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å selektivt ablate et hele organ kalt pharynx i planarian Schmidtea mediterranea. Planarians er en klassisk modell av gjenfødelse, kjent for sine produktive regenerativ, der selv minutt fragmenter kan regrow hele dyr 7,8. De har et stort, heterogent befolkningen av stamceller bestående av både pluripotent celler og avstamning begrenset progenitors9,10,11. Disse cellene spredning og differensiere for å erstatte alle manglende vev, inkludert svelg, nervøs, fordøyelseskanal og excretory systemer og muskel og epitelceller9,10,12. Mens vi vet at disse stamcellene starte gjenfødelse, forstår vi ikke fullt ut molekylære mekanismer som driver dem til å erstatte alle disse forskjellige celletyper. Definerte såret metoder som framprovosere presis stamcelleforskningen reaksjoner kan bidra til å avgrense denne komplekse prosessen.
Pharynx er en stor, sylindriske tube kreves for fôring, og inneholder nerveceller, muskel, epitel og sekretoriske celler13,29. Normalt gjemt i en pose på ventral side av dyret, den strekker seg gjennom dyrets enkelt kroppen åpning ved sensing mat. For å selektivt amputere pharynx, suge vi planarians i en kjemisk kalt Natriumazid, en brukte bedøvelse i C. elegans14,15,16. Bruk i planarians ble først rapportert av Adler et al., i 201412. Planarians extrude deres pharynges minutter av eksponering for Natriumazid, og med milde agitasjon, pharynx løsner fra dyret. Vi kaller dette komplett og selektiv tapet av pharynx "kjemiske amputasjon". En uke etter amputasjon, er en fullt funksjonell pharynx restaurerte12. Fordi pharynx kreves for fôring, kan funksjonelle gjenfødelse måles ved å overvåke fôring atferd. Nedenfor beskriver vi protokollen for kjemiske amputasjon og vurdere fornyelse av pharynx og restaurering av fôring atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
-
Utarbeidelse av planaria vann 17
- Opprettholde planarians i en 1 X Montjuïc salt løsning. For å forberede planarian vann, gjør personlige lager løsninger av 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl og 5 M NaCl i ultrapure vann. Filter-sterilisere med 0,2 µm plastflaske-top filterfor langsiktig lagring.
Merk: Bruk bare ultrapure deionisert vann (med en resistivitet av 18.2 MΩ ved 25 ° C) å forberede Montjuïc salter. - For å forberede en 1 L lager av 5 X salt løsning, Kombiner 5 mL 1 M CaCl2, 5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL av MgCl2, 0,5 mL av KCl og 1.6 mL 5 M NaCl løsninger i 900 mL ultrapure vann. Denne løsningen, legge 0.504 g NaHCO3 og røres for å blande. Justere pH 7.0 med saltsyre.
- Fortynne denne 5 X lagerløsning til en 1 X arbeider konsentrasjon i ultrapure vann i et sterilt beholder som en stor kapasitet carboy (se Tabell for materiale). Bruk denne 1 X-løsningen for å opprettholde aseksuell planarians.
Merk: Som et alternativ til Montjuïc salt løsning, bruke lokalt kjøpt kildevann eller ultrapure vann med en kommersielt tilgjengelig akvariet salt blande (se Tabell for materiale) en konsentrasjon of0.5 finans18. - For å hindre bakteriell infeksjon i statisk kultur19, opprettholde planarians i vann som inneholder en antibiotika. Forberede en 50 mg/mL lager løsning av gentamicin sulfate i ultrapure vann og filter-sterilisere. Beholdere der dyr vedlikeholdes, legge gentamicin sulfate til en siste konsentrasjon av 50 µg/mL (1:1000 fortynning).
- Opprettholde planarians i en 1 X Montjuïc salt løsning. For å forberede planarian vann, gjør personlige lager løsninger av 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl og 5 M NaCl i ultrapure vann. Filter-sterilisere med 0,2 µm plastflaske-top filterfor langsiktig lagring.
-
Utarbeidelse av leveren lim
- Som planarians trives på en diett av organisk, gress-matet biff lever, kjøpe fersk leveren og prosess innen 24 h. fjerne membranous kapselen innkapsle leveren av peeling det av forsiktig. Skjær leveren i ~ 1 cm terninger, og bruke et blad å skrape av og forkaste alle hepatic vener og arterier.
- Macerate leveren stykker med en mat mill eller en food prosessor og sende den via en ledning maske mat sil. Kombinere i bakverk poser og dispensere til sprøyter eller 35 mm Petri retter. Før fôring, sentrifuge forsiktig for å fjerne luftbobler.
- Lagre dele leveren ved-80 ° C for et år og tine før du bruker. Etter tining, nytt fryse noen leftover leveren når, eller lagre ved 4 ° C i opptil 24 timer.
-
Vedlikehold av dyr
- Planarians vil vokse og krympe til forskjellige størrelser avhengig av hyppigheten av fôring. Mate planarians annenhver uke (en gang hver 14 dager). For langsiktige bulk kulturer, bruke plast beholdere av ulike størrelser (se Tabell for materiale).
- For å mate dyr, bruk en metall spatula eller plast overføring Pipetter plassere en ert størrelse dråpe lever i en boks. Tillate dyr å spise til 1-2 h. Fjern gjenværende mat før rengjøring boksen.
- Rengjør ormer to ganger i uken hvis matet (en gang rett etter fôring og når to dager senere) eller en gang i uken dersom ikke matet. For å rengjøre, tømme vann i en plast kanne ved å forsiktig helle ut vannet samtidig beholde planarians i boksen. Tørk boksen overflaten med et papirhåndkle, og gjenta på alle sidene til boksen er ren.
- Erstatte vann (til omtrent ¾ av boksen volumet) og legge gentamicin til en siste konsentrasjon av 50 µg/mL. Lagre dyr i en mørk regjering eller en 20 ° C inkubator.
-
Utvalg av ormer
- Velg ormer som ble foret med 5-7 dager før.
Merk: Det er betydelig vanskeligere å amputere pharynges fra ormer som nylig er lei (1-2 dager før amputasjon). Matet dyr er også mer følsomme for Natriumazid. - Velg ormer som er omtrent 6 mm i lengde. For å beregne størrelsen på ormen, kan du overføre den til en Petriskål bruker en plast overføring pipette. Plasser en flat 6 - i hersker eller 5 x 5 mm millimeterpapir under Petriskål og måle ormen lengden mens den kravlesøker.
Merk: Ormer mindre enn 6 mm i lengde er vanskeligere å amputere.
- Velg ormer som ble foret med 5-7 dager før.
-
Utarbeidelse av Natriumazid
- Forbered en 100 mM løsning ved oppløsning natrium azide pulver i planaria vann.
Forsiktig: Natriumazid er giftig og bør håndteres forsiktig. Ikke kast Natriumazid i avløpet. Følgende bruk, samler det separat for avhending som spesialavfall.
- Forbered en 100 mM løsning ved oppløsning natrium azide pulver i planaria vann.
2. pharynx amputasjon
- Sted ormer i 35 mm diameter Petriskål. Nøye fjerne alle planarian vann fra retten ved hjelp av en plast overføring pipetter.
Merk: Maksimalt 20 6 mm ormer kan innpasses komfortabelt i en rett av denne størrelsen. - Plasser rett under mikroskopet og justere forstørrelsen slik at flere ormer kan vises samtidig (f.eks 10 X forstørrelse). Erstatt planarian vann med 100 mM natrium azide løsning.
Merk: For en 35 mm Petriskål er ca 5 mL av Natriumazid tilstrekkelig. Løsningen bør helt Senk planarians. Lydstyrke løsning for større retter etter behov. - Overvåke dyrene under mikroskopet og avstå fra å flytte rett for de første 3-4 min.
- Observere byggesystemer i pharynx gjennom mikroskop; pharynx vil stikker ut fra pharyngeal posen og utvide fullt (ca 1 mm i lengde) som vist i figur 1B.
Merk: Det er viktig å vente til pharynx er ferdig utvide helt før du fortsetter. Når pharynx framgår av dyret, tar full forlengelse omtrent 1 min. - Bruk en plast overføring Pipetter for å sprute dyr rundt parabolen. Suge dyrene i Pipetter og makt slipp dem i retten et par ganger. Hvis pharynx ut, vil denne kraftig pipettering føre det å koble.
- Alternativt ta tak pharynx enten vertikalt langs, eller horisontalt langs omkretsen med en fin tang (se Tabell for materiale) som vist i figur 1 c. Med pharynx kløp i tang, løft dyret oppover mot meniscus. Som dyret er hevet, vil overflatespenning føre pharynx koble fra dyret.
Merk: Denne metoden kan brukes til å fjerne pharynges av mindre dyrene (1-3 mm i lengde) hvor kraftig virvlende er ikke tilstrekkelig. Unngå poking eller annen måte skadet kroppen på dyret. - Bruker en overføring Pipetter, flytte amputert dyr til en ny rett som inneholder ferske planaria vann.
- Når overført, skyll amputert dyr grundig i planaria vann, helt utveksle vannet tre ganger. Overføre til en ny rett som inneholder planaria vann med 50µg/mL gentamicin.
Merk: Komplett buffer er under disse tre vasker avgjørende for å sikre fjerning av Natriumazid. - Neste dag, erstatte vann i fatet med fersk planaria vann som inneholder 50 µg/mL av gentamicin. Gjenta hver dag etter.
3. vurdering av Pharynx fjerning etter amputasjon
- Undersøke dyr under et mikroskop (med 10-20 X forstørrelse) for å fastslå om en mørke flekker har dukket opp etter vellykket fjerning av pharynx, som vist i figur 2A.
- Alternativt, fikse og bleke dyr i henhold til protokollen beskrevet av Pearson et al. 20. suge dyr overnatting i 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller fluorescently-konjugerte streptavidin (1 mg/mL fortynnet 1:500 i 1 X fosfat Buffered Saline 0,3 prosent Triton-X). Montere dyr på lysbilder i 80% glycerol/20% 1 X fosfat Buffered Saline og bildet under en fluorescerende stereomicroscope (figur 2B).
Merk: Alle bilder i dette manuskriptet ble tatt på en fluorescerende stereomicroscope med en 1,0 X-målet.
4. vurdering av Pharynx gjenfødelse ved å måle fôring atferd
-
Utarbeidelse av leveren
- Overføre behovsantallet leveren lim til en microcentrifuge eller konisk rør. Spin kort for å fjerne luftbobler. Beregne volumet av leveren, og deretter legge planaria vann til 1/5 av volumet og 2% av det totale volumet i rød konditorfarge. For eksempel 1000 µL av leveren lim, legge til 200 µL planaria vann og 24 µL av konditorfarge.
- Bruker en plast pistil, pipette tips eller metall spatula, bland godt til konditorfarge er jevnt fordelt i leveren lime. Spinn igjen kort. Leveren lim kan lagres ved 4 ° C i 24 timer eller frosset i dele ved-80 ° C for langtidslagring.
- Hvis du tester opptil 25 dyr, forberede 25 µL leveren lim per fat (ca 1 µL leveren lim per dyr).
-
Mate dyr
- Syv dager etter kjemiske amputasjon, overføre dyr til en ny Petriskål. Hvis du tester 10-15 dyr, bruke en 35 mm rett; mer enn 15 dyr bør testes i en Petriskål 60 mm. Holde dyr i mørket, uforstyrret, ca 1t før fôring.
- Med saks, øke bredden på et P200 pipette tips ved trimming omtrent ½ cm av smale slutten. Pipetter 25 µL av røde leveren lime inn parabolen.
Merk: Trimming slutten gjør pipettering tyktflytende leveren lim enklere. For å forhindre leveren flytende på overflaten, trykk spissen til bunnen av parabolen mens dispensing. - Tillate dyr å mate i 30 min.
- Score antall dyr som har spist av plasserer dyrene på en hvit bakgrunn eller undersøke dem under et mikroskop med 10-20 X forstørrelse.
- Etter mating, fjerne leveren fra retten og feilfri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksponering for Natriumazid forstyrrer den normale motilitet av planarians, forårsaker dyr å strekke og writhe. Disse bevegelsene tvinge pharynx fra ventral side av dyret, og etter ca 6 min i natrium azide løsning, hvit spissen av pharynx ses (figur 1B-venstre panel). Noen minutter senere, dyr kontrakt aktivt og utvide fullt pharynx ved kraftig skyve den ut av kroppen. (Figur 1B-midtre panelet). Ca slappe 11 min etter azide eksponering, dyrene og pharynx. På dette stadiet, karakteristiske bell formen på pharynx er tydelig (figur 1B-høyre panel). For enkel amputasjon er det viktig å vente på pharynx å slappe av.
Pharynx er en stor, resulterer unpigmented masse vev, fjerner det i utseendet på en mørk flekk på dorsal side amputert dyr (figur 2A). Denne mørke regionen er visuelt vellykket amputasjon i levende dyr. Stedet er synlig umiddelbart etter amputasjon og blir mer fremtredende neste dag. Som pharynx regenererer, lysere denne regionen. For å overvåke pharynx gjenfødelse mer presist, dyr kan være farget med DAPI eller fluorescently-konjugerte streptavidin overnatting (figur 2B). Å kvantitativt vurdere omfanget av pharynx gjenfødelse, kan sitt område måles med ImageJ programvare.
Pharynx er et viktig organ for chemosensation og mat inntak. For å avgjøre når disse funksjonene er gjenopprettet under regenerasjon, brukte vi fôring analyser overvåke dyr oppførsel. Ved å kombinere konditorfarge med leveren lim, kunne vi skille dyrene som spiste fra de som gjorde ikke (figur 3A). Vi deretter kvantifisert antall røde dyr å vurdere andelen dyr med en funksjonell svelget. Basert på resultatene som vises i figur 3B, ble vellykket fôring atferd gjenopprettet 7 dager etter amputasjon, som indikerer at en uke etter pharynx fjerning, dyr har regenerert en funksjonell svelget. For å teste om natrium azide eksponering berørt fôring atferd, vi dynket dyr i Natriumazid men vasket den ut umiddelbart før pharynx utstøting. En dag senere ble vurdert vi om mat-søker atferd ble endret av natrium azide eksponering med fôring analysen. I motsetning til kjemisk amputert dyr mangler en svelg, alle dyr beholde en intakt pharynx etter natrium azide eksponering spiste (n = 30 dyr for hvert vilkår) maten. Resultatet indikerer at natrium azide eksponering ikke påvirker fôring atferd, så lenge pharynx forblir intakt.
Figur 1 . Svelg utstøting og amputasjon. (A) skjematisk av planarian anatomi. (B) bilder av bo dyrene viser pharynx utstøting på soaking i 100 mM Natriumazid. Røde piler markere svelget. Skalere barer = 750 µm. (C) bilde av levende dyr (venstre) og skjematisk (høyre) amputasjon ved hjelp av pinsett. Paneler viser to ulike alternativer for gripende pharynx. Ventral side av dyret vender opp. Skalere barer = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Vurdering av pharynx amputasjon og gjenfødelse. (A) representant bilder av levende dyr på angitt ganger før og etter amputasjon. Midtre panelet viser mørke flekker i pharyngeal regionen etter amputasjon, fremhevet av stiplet hvit boks. Dorsal siden vender opp. Skalere barer = 500 µm. (B) representant bilder av dyr med Alexa488-streptavidin på angitt ganger før og etter amputasjon. Midtre panelet viser fraværet av pharynx etter amputasjon. Pharyngeal regionen fremhevet av hvit boks. Ventrale siden vender opp. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Evaluering av pharynx gjenfødelse. (A) bilder og skjematisk av fôring analysen, gjennomført ved å plassere 25 µl av lever i midten av en 60 mm Petriskål. Skjematisk (øverst, venstre) og bilde (midten) viser fôring atferd i dyrene med intakt pharynges. Øverst til høyre, bilde dyr som har spist. Skjematisk (nederst til venstre) og bilde (midten) av fôring atferd i dyr en dag etter amputasjon. Bunnen rett, dyr som ikke har spist. Skala bar = 750 µm. (B) resultater av fôring analysen. Prosent av dyr som har inntatt mat (kvantifisert ved rød farge) til bestemte tider etter amputasjon. For hvert tidspunkt, n = 10 dyr, gjentatt i tre eksemplarer. Feilfelt = SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for selektiv ablasjon av pharynx bruker Natriumazid. Andre målrettede ablasjon studier i planarians har brukt endret kirurgi for å fjerne fotoreseptorer21 eller farmakologisk behandling å ablate dopaminergic neurons22. En betydelig fordel av kjemiske amputasjon over eksisterende metoder er at den ikke krever kirurgi. Stive strukturen i pharynx sammenlignet med resten av planarian kroppen forenkler fullstendig fjerning fra dyr, som er mye mykere-bodied. Også, pharynx løsner fra dyret ved veikryss (spiserøret)30 pharynx og tarmen, generere et mer reproduserbar sår enn indusert av en større kirurgiske verktøy. Basert på sine fysiske egenskaper og små anatomiske kobling til resten av dyret, genererer pharynx fjerning derfor mer homogen sår enn andre kirurgiske amputasjoner.
Lengden på eksponering for Natriumazid er også avgjørende for å lykkes med denne teknikken. Selv om kort eksponering for Natriumazid ikke negativt påvirke planarians, langvarig eksponering er giftig og til slutt vil drepe dyr. Natriumazid er kjent for å hemme energi avhengig av prosesser via hemming av cytochrome oxidase23,24. I tillegg undertrykker transkripsjon og oversettelse, sannsynlig ved akkumulering av sentrale komponenter av disse reaksjonene i stress granulater25. I planarians undertrykker natrium azide eksponering mitose 24 h, hvoretter celler gjenoppta spredning12. Endringer overvinne som begrenser tiden azide eksponering, fjerne azide med grundig skylling og regnskap for forbigående mitotisk undertrykkelse i eksperimentell design kan hjelpe disse begrensningene.
Den unike anatomiske posisjonen pharynx og dens karakteristiske radial symmetri tillate lett æren av nylig Spartments pharyngeal vev fra eksisterende stamceller. Svelg gjenfødelse kan overvåkes på mobilnettet og anatomisk bruker vev flekker som streptavidin og DAPI, immunohistochemistry, eller i situ hybridisering26. Fôring analysen beskrevet her søk funksjonelle regenerering av pharynx. Chemotaxis mot mat krever pharynx27,28 og dyr uten en fullt funksjonell pharynx kan innta mat. Denne enkle, kvantitativ vurdering av organfunksjon utfyller derfor strukturelle gjenfødelse. I tillegg kjemiske amputasjon kan utføres på populasjoner av dyr, og kan generere mange dyr med identiske skader. Prosedyren er derfor praktisk for store studier. Disse fordelene, kombinert med det faktum at regenerering av en moden pharynx krever stamceller, gjør pharynx amputasjon en ideell modell å studere organ gjenfødelse. Brukes i kombinasjon med bredere amputasjoner, kan pharynx fjerning brukes til å teste hypoteser om hvordan sår størrelse og anatomisk posisjon påvirke stamcelleforskningen svaret skader som er et sentralt spørsmål i gjenfødelse feltet21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Alejandro Sánchez Alvarado, som støttet den første optimalisering og utvikling av denne teknikken. Arbeid i Carolyn Adlers laboratorium støttes av Cornell University oppstart midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).
