Summary
Planarian Schmidtea mediterranea er en fremragende model for at studere stamceller og væv revitalisering. Denne publikation beskriver en metode til at selektivt fjerne en orgel, svælget, ved at udsætte dyr for den kemiske natriumazid. Denne protokol beskriver også metoder til overvågning af svælget regenerering.
Abstract
Planarians er fladorme, der er ekstremt effektive på regenerering. De skylder denne evne til at et stort antal stamceller, der kan hurtigt reagere på enhver form for skade. Fælles skade modeller i disse dyr fjerne store mængder af væv, som skader flere organer. For at overvinde denne brede vævsskader, beskriver vi her en metode hen til selektivt fjerne en enkelt orgel, svælget, i planarian Schmidtea mediterranea. Det opnår vi ved iblødsætning dyr i en oploesning indeholdende natriumazid cytokrom oxidase inhibitor. Kortvarig påvirkning til natriumazid forårsager ekstrudering af svælget fra dyr, som vi kalder "kemiske amputation." Kemiske amputation fjerner hele svælget, og genererer et lille sår hvor svælget tillægger tarmen. Efter omfattende skylning, regenerere alle amputerede dyr en fuldt funktionel svælget i cirka en uge. Stamceller i resten af kroppen drive regenerering af nye svælget. Her, vi leverer en detaljeret protokol for kemiske amputation, og beskriver både histologiske og adfærdsmæssige metoder til at vurdere vellykket amputation og regenerering.
Introduction
Regeneration er et fænomen, der opstår overalt i dyreriget, med regenererende kapacitet spænder fra fuld krop regenerering i visse hvirvelløse dyr til mere begrænsede evner i hvirveldyr1. Udskiftning af funktionelle væv er en kompleks proces, og ofte medfører den samtidige restaurering af flere celletyper. For eksempel, at regenerere salamander lemmer, osteoblaster, chondrocytter, neuroner, muskler og epitelceller skal være erstattet2. Disse nyligt genererede celletyper skal også være organiseret korrekt at lette nye lemmer funktion. Forstå disse komplekse processer kræver teknikker, der fokuserer på regenerering af specifikke celletyper og deres integration i organer.
En af de strategier, der er ansat til at forenkle studiet af regenerativ svar er den målrettede ablation af enten visse celletyper eller større samlinger af væv. For eksempel i zebrafisk fører udtryk for nitroreductase i bestemte celletyper til deres ødelæggelse efter anvendelse af metronidazol3,4. I Drosophila larver, kan udtrykker pro-apoptotiske gener under væv-specifikke initiativtagere selektivt ablate bestemte områder af fantasiens disc5,6. Begge af disse strategier hurtige men kontrolleret skade, og har været brugt til at dissekere de molekylære og cellulære mekanismer, der er ansvarlige for regenerering.
I dette manuskript beskriver vi en metode til at selektivt ablate hele organ kaldet svælget i planarian Schmidtea mediterranea. Planarians er en klassisk model af regenerering, kendt for deres produktive regenerative evne, hvor selv minut fragmenter kan regrow hele dyr 7,8. De har en stor, heterogen population af stamceller bestående af både pluripotente celler og afstamning-begrænset stamfaderen9,10,11. Disse celler formere sig og differentiere for at erstatte alle mangler væv, herunder svælget, nervøs, fordøjelseskanalen og ekskretionsorganerne systemer, og muskel og epitelceller9,10,12. Selv om vi ved, at disse stamceller indlede regenerering, vi ikke fuldt ud forstå de molekylære mekanismer, der driver dem til at erstatte alle disse forskellige celletyper. Definerede såret metoder, der fremkalde præcise stamcelle svar kan hjælpe med at afgrænse denne komplekse proces.
Svælget er et stort, cylindriske rør kræves for fodring, og indeholder neuroner, muskel, epithelial og sekretoriske celler13,29. Normalt skjult i en pose på den ventrale side af dyret, det strækker sig gennem dyrets enkelt organ åbning ved sensing tilstedeværelsen af føde. Du kan selektivt amputere svælget, sættetid vi planarians i en kemisk kaldet natriumazid, et almindeligt anvendte bedøvelsesmiddel i C. elegans14,15,16. Dets anvendelse i planarians blev først rapporteret af Adler mfl., i 201412. Inden for minutter af eksponering for natriumazid, planarians presse deres pharynges, og med blide agitation, svælget frigøres fra dyret. Vi henviser til denne komplette og selektiv tab af svælget som "kemiske amputation". En uge efter amputation, er en fuldt funktionel svælget restaureret12. Fordi svælget er påkrævet for fodring, kan funktionelle regeneration måles ved at overvåge fodring adfærd. Nedenfor beskriver vi protokollen for kemiske amputation, og for at vurdere regenerering af svælget og restaurering af fodring adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
-
Forberedelse af planaria vand 17
- Opretholde planarians i en 1 X Montjuïc saltopløsning. For at forberede planarian vand, lave individuelle stamopløsninger af 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl og 5 M NaCl i ultrarent vand. Filter-sterilisere med en 0,2 µm flaske-top filterfor langtidsopbevaring.
Bemærk: Brug kun laves deioniseret vand (med en resistivitet på 18.2 MΩ ved 25 ° C) til at forberede Montjuïc salte. - For at forberede en 1 L bestand af 5 X saltopløsning, kombinere 5 mL 1 M CaCl2, 5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL af MgCl2, 0,5 mL af KCl og 1,6 mL 5 M NaCl løsninger i 900 mL ultrarent vand. Til denne løsning, Tilføj 0.504 g NaHCO3 og rør for at blande. PH indstilles til 7.0 med saltsyre.
- Fortynde denne 5 X stamopløsning til en 1 X arbejder koncentration i ultrarent vand i en steril beholder, såsom en stor kapacitet flaske (Se Tabel af materialer). Brug dette 1 X løsning for at opretholde aseksuelle planarians.
Bemærk: Som et alternativ til Montjuïc saltopløsning, bruge lokalt købt kildevand eller ultrarent vand indeholdende et kommercielt tilgængelige akvariet salt blandes (Se Tabel af materialer) på en koncentration of0.5 g/L18. - For at forhindre bakteriel infektion i statisk kultur19, opretholde planarians i vand, der indeholder et antibiotikum. Forberede en 50 mg/mL stamopløsning af gentamicin sulfat i ultrarent vand og filter-sterilisere. På beholdere, hvor dyr holdes, skal du tilføje gentamicin sulfat til en endelig koncentration på 50 µg/mL (1:1000 fortynding).
- Opretholde planarians i en 1 X Montjuïc saltopløsning. For at forberede planarian vand, lave individuelle stamopløsninger af 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl og 5 M NaCl i ultrarent vand. Filter-sterilisere med en 0,2 µm flaske-top filterfor langtidsopbevaring.
-
Forberedelse af leveren pasta
- Planarians trives på en kost af økologisk, græs oksekød lever, købe friske leveren og proces inden for 24 h. fjerne hindeagtige kapslen indkapsling leveren ved at skrælle det forsigtigt. Skær leveren i ~ 1 cm tern, og brug en kniv til at skrabe ud og kassere alle hepatisk vener og arterier.
- Udblødte lever stykker ved hjælp af en fødevare mølle eller en foodprocessor og derefter passere det gennem en wire mesh mad si. Kombinere til wienerbrød poser, og dispensere til sprøjter eller 35-mm petriskåle. Før fodring, centrifugeres forsigtigt for at fjerne luftbobler.
- Gemme delprøver af leveren ved-80 ° C i op til et år og tø inden brug. Efter optøning, re fryse enhver sidesten lever en gang, eller opbevares ved 4 ° C i op til 24 timer.
-
Vedligeholdelse af dyr
- Planarians vil vokse og skrumpe ind til forskellige størrelser afhængig af hyppigheden af fodring. Feed planarians hver anden uge (en gang hver 14 dage). For langsigtet bulk kulturer, bruge plastic containere af forskellige størrelser (Se Tabel af materialer).
- For at fodre dyr, skal du bruge en metal spatel eller plast overførsel afpipetteres for at placere en ært dråbe af leveren i en boks. Tillad dyr at spise for 1-2 h. Fjern resterende mad før rengøring boksen.
- Ren orme to gange om ugen Hvis fodret (én gang direkte efter fodring og en gang to dage senere), eller en gang om ugen, hvis ikke fodret. For at rengøre, tømme vand ind i en plastik bæger af omhyggeligt udøste vandet samtidig bevare planarians i boksen. Tør boks overfladen med et stykke køkkenrulle, så gentag på alle sider, indtil boksen er ren.
- Erstatte vand (til ca ¾ af boksens rumfang) og tilføje gentamicin til en endelig koncentration på 50 µg/mL. Gemme dyr i et mørkt skab eller i en 20 ° C inkubator.
-
Udvalg af orme
- Vælg orme, der blev fodret med 5-7 dage før.
Bemærk: Det er betydeligt vanskeligere at amputere pharynges fra orme, der er for nylig blevet fodret (1-2 dage før amputation). Fodret dyr er også mere følsomme over for natriumazid. - Vælg orme, der er ca 6 mm i længden. For at anslå størrelsen af ormen, skal du overføre det til en petriskål ved hjælp af en plastik overførsel pipette. Sted enten en flad 6 - in lineal eller 5 mm x 5 mm millimeterpapir nedenunder petriskålen og måle orm længde, mens det gennemgår.
Bemærk: Orme mindre end 6 mm i længden er vanskeligere at amputere.
- Vælg orme, der blev fodret med 5-7 dage før.
-
Forberedelse af natriumazid
- Forberede en 100 mM løsning ved at opløse natrium indeholder pulver i planaria vand.
Forsigtighed: Natriumazid er giftigt og bør håndteres forsigtigt. Smid ikke natriumazid ned i afløbet. Følgende bruger, indsamle det separat til bortskaffelse som farligt affald.
- Forberede en 100 mM løsning ved at opløse natrium indeholder pulver i planaria vand.
2. svælget Amputation
- Sted orme i en 35-mm diameter petriskål. Fjern forsigtigt alle planarian vand fra skålen ved hjælp af en plastik overførsel pipette.
Bemærk: Højst 20 6-mm orme kan være komfortabelt indkvarterede i en skål af denne størrelse. - Placer fadet under mikroskop og justere forstørrelse, så flere orme kan ses samtidigt (f.eks. 10 X forstørrelse). Udskift planarian vand med 100 mM natrium indeholder løsning.
Bemærk: For en 35-mm petriskål er ca. 5 mL natriumazid tilstrækkeligt. Løsningen burde helt nedsænkes planarians. Justere løsning volumen for større retter efter behov. - Overvåge dyr under mikroskop og afstå fra at flytte parabol for de første 3-4 min.
- Observere ekstrudering af svælget gennem mikroskop; svælg vil Rage op fra svælg posen og udvide fuldt (ca. 1 mm i længden) som vist i figur 1B.
Bemærk: Det er vigtigt at vente, indtil svælget er færdig med at udvide helt før du går videre i processen. Når svælg fremgår af dyret, tager fuld extension ca 1 min. - Brug en plastik overførsel pipette til at sprøjte dyr rundt fad. Sutte dyrene i pipette og med magt frigive dem i skålen et par gange. Hvis svælget er fuldt udbygget, vil dette energisk pipettering få det til at løsne.
- Alternativt, forstå svælget enten lodret langs dens længde, eller vandret langs dets omkreds ved hjælp af et par fine pincet (Se Tabel af materialer), som vist i figur 1 c. Med svælget klemt i pincet, løfte dyret opad mod menisken. Som dyret er rejst, vil overfladespænding medføre svælget til at løsne sig fra dyret.
Bemærk: Denne metode kan bruges til at fjerne pharynges af mindre dyr (1-3 mm i længden) hvor kraftig hvirvlende er ikke tilstrækkelig. Undgå at stikke eller ellers sårede kroppen af dyret. - Brug en overførsel pipette, flytte amputerede dyr til en ny parabol indeholdende frisk planaria vand.
- Når overført, skyl amputerede dyr grundigt i planaria vand, helt udveksling vand tre gange. Overførsel til en ny parabol indeholdende planaria vand med 50µg/mL af gentamicin.
Bemærk: Komplet buffer exchange under disse tre vasker er afgørende for at sikre fjernelse af natriumazid. - Den næste dag, erstatte vand i skålen med friske planaria vand indeholdende 50 µg/mL af gentamicin. Gentag hver anden dag derefter.
3. vurdering af svælget fjernelse efter Amputation
- Undersøge dyrene under et mikroskop (med 10-20 X forstørrelse) for at afgøre, om en mørk plet har optrådt efter vellykket fjernelse af svælget, som vist i figur 2A.
- Alternativt kan du lave og blege dyr i henhold til protokollen, beskrevet af Pearson et al. 20. soak dyr overnatning i 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller fluorescently-konjugeret streptavidin (1 mg/mL fortyndet 1: 500 i 1 X fosfat Buffered saltopløsning med 0,3% Triton-X). Montere dyr på dias i 80% glycerol/20% 1 X fosfat Buffered saltvand og billede under et fluorescerende stereomikroskop (figur 2B).
Bemærk: Alle billeder i dette manuskript blev fanget på et fluorescerende stereomikroskop med en 1,0 X mål.
4. vurdering af svælget regenerering af måling af fodring adfærd
-
Forberedelse af leveren
- Overføre behovsantallet lever pasta til en microcentrifuge eller koniske rør. Spin kort for at fjerne luftbobler. Vurdere mængden af leveren, og derefter tilføje planaria vand til 1/5 af dens volumen, og 2% af den samlede mængde i rød frugtfarve. For eksempel, at 1000 µL af leveren indsætte, tilføje 200 µL planaria vand og 24 µL frugtfarve.
- Ved hjælp af en plastik pistil, pipette tip eller metal spatel, Bland grundigt indtil levnedsmiddelfarvestof er jævnt fordelt i leveren pasta. Spin igen kortvarigt. Leveren pasta kan opbevares ved 4 ° C i 24 timer eller frosne opbevares i alikvoter ved-80 ° C til langtidsopbevaring.
- Hvis test op til 25 dyr, forberede 25 µL af leveren pasta pr. fad (ca 1 µL af leveren pasta pr. dyr).
-
Fodring af dyr
- Syv dage efter kemiske amputation, overføre dyr til en ny petriskål. Hvis test 10-15 dyr, bruge en 35 mm parabol; mere end 15 dyr bør afprøves i en 60-mm petriskål. Holde dyr i mørke, uforstyrret, i cirka 1 time før fodring.
- Ved hjælp af saks, forøge bredden af et P200 pipette tip ved at trimme omtrent ½ cm ud af den smalle ende. Med pipette overfoeres 25 µL af røde lever pasta i skålen.
Bemærk: Trimning slutningen gør pipettering tyktflydende lever indsætningen nemmere. For at forhindre, at leveren flyder på overfladen, røre spidsen til bunden af skålen mens udlevering. - Tillade, at dyr til foder til 30 min.
- Score antal dyr, der har spist ved at placere dyr på en hvid baggrund eller undersøge dem under et mikroskop med 10-20 X forstørrelse.
- Efter fodring, fjerne leveren fra fadet og rengøre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksponering for natriumazid forstyrrer den normale motilitet af planarians, forårsager dyr til at strække og vride. Disse bevægelser tvinge svælget til at komme ud af den ventrale side af dyret, og efter ca. 6 min. i natrium indeholder løsning, den hvide spids i svælget kan ses (figur 1B-venstre panel). Et par minutter senere, dyr kontrakt aktivt og udvide fuldt svælget ved kraftigt at skubbe det ud af kroppen. (Figur 1B-midterste panel). Ca 11 min efter indeholder eksponering, dyrene og svælget slappe af. På dette stadium, den karakteristiske bell figur i svælget er klart synlige (figur 1B-højre panel). For nem amputation er det vigtigt at afvente svælget til at slappe af.
Fordi svælget er en stor, resulterer unpigmented masse af væv, at fjerne det i udseendet af en mørk plet på den dorsale side af amputerede dyr (figur 2A). Denne mørkelagt region er en visuel indikator for vellykket amputation med levende dyr. Stedet er synlige straks efter amputation og bliver mere fremtrædende næste dag. Som svælget regenererer, lysner denne region. For at overvåge svælget regenerering mere præcist, dyr kan være farvet med DAPI eller fluorescently-konjugeret streptavidin natten over (figur 2B). Kvantitativt vurdere omfanget af svælget regenerering, kan dens område måles ved hjælp af ImageJ software.
Svælget er et vigtigt organ for chemosensation og mad indtagelse. For at afgøre, hvornår disse funktioner gendannes under regenerering, brugte vi fodring assays til at overvåge dyrs adfærd. Ved at kombinere mad farvelægning med leveren pasta, var vi i stand til at skelne mellem dyr, der spiste fra dem, der gjorde ikke (figur 3A). Vi tal derefter antallet af røde dyr at vurdere andelen af dyr med en funktionel svælget. Baseret på resultaterne vist i figur 3B, blev vellykket fodring adfærd restaureret 7 dage efter amputation, der angiver, at en uge efter svælget fjernelse, dyr har regenereret en funktionel svælget. For at teste, om natrium indeholder eksponering påvirket fodring adfærd, vi gennemblødt dyr i natriumazid men vasket det ud umiddelbart før svælget udslyngning. En dag senere, vurderet vi om mad-søgende adfærd blev ændret af natrium indeholder eksponering fodring assay. I modsætning til kemisk amputeret dyr mangler et svælg, alle dyr bevare en intakt svælg efter natrium indeholder eksponering spiste (n = 30 dyr for hver betingelse) mad. Dette resultat indikerer at natrium indeholder eksponering ikke påvirker fodring adfærd, så længe svælget forbliver intakt.
Figur 1 . Svælget udslyngning og amputation. (A) skematisk af planarian anatomi. (B) billeder af levende dyr viser svælg udslyngning efter iblødsætning i 100 mM natriumazid. Røde pile fremhæve svælget. Skalere barer = 750 µm. (C) Image af levende dyr (til venstre) og skematisk (til højre) af amputation med pincet. Paneler viser to forskellige muligheder for gribende svælget. Ventrale side af dyret vender opad. Skalere barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Vurdering af svælget amputation og regenerering. (A) repræsentative billeder af levende dyr på angivne tidspunkter før og efter amputation. Midterste panel viser mørk plet i svælg region efter amputation, fremhævet af stiplede hvid boks. Dorsale side vender opad. Skalere barer = 500 µm. (B) repræsentative billeder af dyr farves med Alexa488-streptavidin på angivne tidspunkter før og efter amputation. Midterste panel viser manglende svælg efter amputation. Svælg region fremhævet af hvide boks. Ventrale side vender opad. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Evaluering af svælget regenerering. (A) billeder og skematisk af fodring assay, udført ved at placere 25 µl af leveren i midten af en 60 mm petriskål. Skematisk (øverst, til venstre) og billede (midten) Vis fodring adfærd hos dyr med intakte pharynges. Øverste højre, billede af dyret, der har spist. Skematisk (nederst til venstre) og billede (midten) af fodring adfærd i dyrene 1 dag efter amputation. Nederste højre, dyr, som ikke har spist. Skalalinjen = 750 µm. (B) resultater af fodring assay. Procentdel af dyr, der har indtaget mad (kvantificeres ved røde farve) på bestemte tidspunkter efter amputation. For hvert tidspunkt, n = 10 dyr, gentages i tre eksemplarer. Fejllinje = SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til selektiv ablation af svælget med natriumazid. Andre målrettede ablation undersøgelser i planarians har brugt modificerede kirurgi til at fjerne fotoreceptorer21 eller farmakologiske behandling til ablate dopaminerge neuroner22. En væsentlig fordel ved kemiske amputation over eksisterende metoder er, at det ikke kræver operation. Den stive struktur i svælget i forhold til resten af planarian kroppen letter dens fuldstændig fjernelse fra dyr, som er meget blødere-karrosseri. Også, svælget frigøres fra dyret på en lille junction (spiserøret)30 forbinder svælget og tarmen, skabe et mere reproducerbare sår end en induceret af et større kirurgisk værktøj. Baseret på dens fysiske egenskaber og små anatomiske kobling til resten af dyret, genererer svælget fjernelse derfor mere homogene sår end andre kirurgiske amputationer.
Længden af eksponering for natriumazid er også afgørende for succesen med denne teknik. Selv om kortvarig påvirkning til natriumazid ikke negativt påvirker planarians, langvarig eksponering er giftige og i sidste ende vil dræbe dyr. Natriumazid er kendt for at hæmme energiafhængige processer gennem hæmning af cytokrom oxidase23,24. Derudover undertrykker det transskription og translation, sandsynligvis af ophobning af centrale elementer i disse reaktioner på stress granulat25. I planarians undertrykker natrium indeholder eksponering mitosen i 24 timer, hvorefter celler genoptage spredning12. Ændringer overvinde såsom begrænsning af tidspunktet for indeholder eksponering, fjerne indeholder med grundig skylning og tegner sig for forbigående mitotiske undertrykkelse i eksperimentelle design kan hjælpe disse begrænsninger.
Svælget og dens karakteristiske radial symmetri unikt anatomisk stilling giver mulighed for nem sondringen nyligt folier svælg væv fra allerede eksisterende stamceller. Svælget regeneration kan overvåges på anatomiske og cellulære niveau ved hjælp af væv pletter som streptavidin og DAPI, immunhistokemi, eller ved i situ hybridisering26. Fodring analysen beskrives her-undersøgelser vedrørende funktionelle regenerering af svælget. Chemotaxis mod mad kræver svælget27,28 og dyr uden en fuldt funktionel svælget kan ikke indtage mad. Denne enkle, kvantitative vurdering af organfunktion supplerer derfor strukturelle regenerering. Derudover kemiske amputation kan udføres på populationer af dyr og kan generere mange dyr med identiske skader. Proceduren er derfor bekvemt for store undersøgelser. Disse fordele, kombineret med det faktum, at regenerering af en moden svælget kræver stamceller, gør svælget amputation en ideel model til at studere orgel regeneration. Bruges i kombination med bredere amputationer, kan svælget fjernelse bruges til at teste hypoteser om hvordan såret størrelse og anatomiske placering påvirke stamceller svaret til skade, som er et centralt spørgsmål i regenerering felt21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Alejandro Sánchez Alvarado, der støttede den indledende optimering og udvikling af denne teknik. Arbejde i Carolyn Adlers laboratorium understøttes af Cornell University start-up midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).
