Summary
この資料では、生態系の植物や高度に制御された実験室で植物微生物相互作用研究を可能にするデバイス (EcoFABs) の作製のための詳しいプロトコルについて説明します。
Abstract
有益な植物・微生物相互作用は、低入食品とバイオ エネルギー生産を後押しする可能性と持続可能な生物学的ソリューションを提供しています。これらの複雑な植物と微生物の相互作用のより機械論的理解は同様に実行する基本的な生態学的研究調査植物土壌微生物相互作用として工場の生産を改善することが重要になります。ここでは、生態系作製の詳細な説明が表示されが、広く利用可能な 3 D 印刷技術を使用して、環境固有の植物・微生物相互作用の解明のため制御室生息地 (EcoFABs) を作成するには条件。EcoFABs の 2 つのサイズは、シロイヌナズナ、コムギ distachyon、キビ virgatumなど様々 な植物と微生物の相互作用の調査に適しているとおりです。これらの流れによってデバイスは、制御操作とルート内細菌叢解析、ルート化学のサンプリングし同様根の形態および微生物のローカリゼーションのイメージングします。このプロトコルには、EcoFABs 内の無菌状態を維持してマウント EcoFABs に独立した LED ライト システムの詳細が含まれています。砂の土壌を含むメディアの種類を追加するための詳細な手順、およびイメージングを使ったこれらのシステムの評価と結合した液体の成長媒体メタボロミクスは、説明。一緒に、これらのシステムは植物の植物微生物コンソーシア マイクロバイ組成 (含む変異体)、植物の生育、根の形態、滲出液組成の監視操作を含む動的かつ詳細な調査を有効にして制御環境下における微生物のローカライズ。これらの詳細なプロトコルは、理想的には植物と微生物の相互作用を調査するための標準化された実験装置の作成を支援、他の研究者の重要な出発点となることを期待しています。
Introduction
農業植物有益な微生物の応用は、持続可能な食糧と成長人口1,2,3、4を提供するバイオ燃料の生産を向上させる大きな可能性を提供しています。かなりの作業量は、植物栄養摂取、ストレス、耐性と病気5,6,7,8への抵抗の工場内細菌叢解析の重要性をサポートします。しかし、それは複雑さと関連付けられている irreproducibility とマイクロバイ組成と遺伝学を正確に制御することができないのためのフィールド生態系における植物微生物相互作用のこれらのメカニズムを調査することは困難 (e.gを使用して。微生物突然変異体)4,9,10。
1 つの戦略は有効にする簡易モデル生態系を構築する制御、レプリケートされた実験フィールド10、11、さらにテストすることができます洞察力を生成する植物微生物相互作用の調査 12。この概念は、土入りのポット栽培植物を使用して従来のアプローチまたは温室やインキュベーター13内で寒天平板をビルドします。これらは、おそらくまま最も広く使用されるアプローチが、彼らは正確に監視および植物成長環境を操作する能力を欠いています。これらの端に地下プロセス14,15を勉強する能力の主要な改善を表す rhizoboxes と rhizotrons と、根圏土壌16代謝産物の分析のプロトコルは、最初が掲載されました。最近では、高スループットの解析を有効にするには、高度なマイクロ デバイス13,17工場チップ18,19、RootArray20、RootChip21などをされています。液体の流れの中で小さなモデル植物シロイヌナズナの初期成長段階を監視するマイクロ メートル スケールの空間分解能で植物を表現型解析のための効率的なツールとして開発されました。最近では、2 層のイメージング プラットフォームは、マイクロ流体プラットフォーム22幼苗期におけるシロイヌナズナ根毛イメージングを可能にする記述されていた。
ここでは、詳しいプロトコル制御研究所デバイス (EcoFABs) を構築するため、植物微生物相互作用やショーの多様な研究に使用できる植物シロイヌナズナ、コムギを含む提供distachyon23, 生態学的重要な野生エンバクエンバク barbataとバイオ エネルギー作物キビ virgatum (グラス)。EcoFAB は 2 つの主要なコンポーネントを含む無菌植物成長プラットフォーム: EcoFAB デバイスと滅菌工場サイズの透明容器。3 D 印刷プラスチック金型からレイヤーをデバイス製造プロセス鋳造 PDMS を含むポリジメチルシロキサン (PDMS) から作られています EcoFAB と24,25 報告以前メソッドを使用して顕微鏡スライド上に PDMS レイヤーを結合.EcoFAB ワークフロー、デバイス作製、殺菌、種子の発芽、苗移植、微生物接種/cocultivation、試料の調製、分析などの詳細な手順は、このプロトコル (図 1) のとおりです。基本的なワークフローのさらなる変更は、説明、コンピューターのインストールを含む可能 LED ライトを育てる、固体基板の使用率。イメージング技術の根の形態を調査するための利用、根の微生物植民地化および根分泌物の質量分光イメージングを説明しました。標準化研究所植物マイクロバイ研究紹介、詳細なプロトコルと同様に、すぐに利用できる材料に基づく単純な安価な設計コミュニティ リソースに EcoFAB プラットフォームになることと見込んでください。
Protocol
注意: このプロトコルには、有害化学物質、鋭利なもの、電気機器、ホット オブジェクト、および外傷を引き起こすその他の危険の使用が含まれています。適切な個人用保護具 (PPE は、例えば、化学的に抵抗力がある手袋、安全眼鏡、白衣、長い服、閉鎖つま先の靴、等。) 着用する必要があります、適切な安全手順・安全研修・ ヒューム フードの使用。等)従う必要があります。
1. EcoFAB デバイス作製技術: 鋳造 PDMS レイヤー (図 2および図 3)
- (デザイン ファイルにあります 3 D 印刷技術を使用して EcoFAB 金型を作成します。各金型には、3 つの部分が含まれています: 鋳造フレーム、注目のモールド ベース、および挿入、図 2に示すように。モールド ベースを印刷、プラスチック製の 3 D プリンターを使用して堅い不透明フォトポリマーから挿入します。100 μ m の解像度の最小値を活用し、アクリロニ トリル ・ ブタジエン ・ スチレン (ABS) と鋳造フレームを印刷します。
- シロキサン エラストマー ベース 40 mL を混ぜて、硬化剤使い捨て 1 L 容器で。(手順 2.1 および 2.2) 目的の実験に応じてベース/硬化剤 (5:1, 15:1、30: 1) エラストマーの異なる比率 (v/v) を使用します。1.3 から 1.8 の混合物のすべての種類のための手順に進みます。
注意: は、化学的に抵抗力がある手袋、安全眼鏡、その他委託を着用します。 - 少なくとも 30 分エラストマー混合物から空気の泡を削除する真空チャンバーに容器を置きます。
- 組み立てられた 3 D 印刷プラスチック金型 (図 3 a) に混合物を注ぐし、続ける金型加熱ブロック 85 ° c 4 h (図 3 b)。
注意: やけどを避けるため PPE を着用します。 - 金型を聞かせて 5 分クールダウン。金型からの挿入を優しく引き出します (図 3)、ユーティリティ ナイフ鋳造フレームとを区切ります (図 2 D) PDMS (凝固エラストマーの混合物) の間をゆっくりと挿入しています。
- 金型鋳造のフレーム (図 3E) を PDMS の基本キーを押します。ナイフまたは他のツールを使用して、優しく端 (図 3 f) ・ モールド ベースから PDMS 層を分離して、ゆっくりとそれからはがれて金型表面 (図 3)。
- 入口を作成し、コンセント チャンネル 15 で入口と出口ポート ~1.6 mm 穴をあけ、PDMS レイヤー上ゲージ鈍針 (図 3 H、私)。
注意: ワイド コンセント金型のみ入口ポート (図 3 H、I) を必要としながら、標準型、入口と出口ポートです。 - PDMS レイヤー.の端をトリミングするはさみを使用してください。
注: トリミング PDMS レイヤーは、ミリメートル x の小型 EcoFAB デバイス用 51 mm 四角形 ≥76 と ≥102 mm × 83 mm 四角形 EcoFAB デバイスが大きいはずです。
2. EcoFAB デバイスの作製: 顕微鏡スライド (図 3および図 4) 層の化学的に PDMS を取り付ける
- 完全に顕微鏡のスライドに PDMS レイヤーを結合
- リンス (製 15:1 エラストマー ベース剤の混合物を硬化する) PDMS 層と 7.6 × 5 cm 顕微鏡の接着面メタノールをスライドし、吹く乾燥に圧縮空気または高純度窒素銃。
注意: メタノールは有毒です。ヒューム フードの仕事し、目の保護カバー、手袋、その他委託を着用します。 - 顕微鏡のスライドと PDMS 層プラズマ クリーナー (図 3J) を彼らの接合面を持つ。プラズマ クリーナーを使用できない場合は、手順 2.2 に進みます。
- 商工会議所とクリーナー、プラズマのガス抜きバルブを閉じ、真空および 1 分のチャンバーをポンプに。
- プラズマ発生器の電源をオンにし、1 分の「こんにちは」に無線周波数 (RF) レベルを切り替えます。
- 真空ポンプとプラズマ電源を切り、チャンバー内の雰囲気を発散します。
- プラズマ室から顕微鏡スライドと PDMS 層を取るし、も圧 (図 3 L) を使用してスライド上に PDMS レイヤーのすべての 4 つのエッジをすばやく押します。PDMS 層 (ルート室) の中心楕円形領域にスライドが触れていないことを確認します。
- 暖房のさらに PDMS 層と顕微鏡スライドの間永久的な接着を確保するために 20 分間ブロック 120 ° C のシールの EcoFAB デバイスを設置します。
- デバイスのナイフで PDMS 層の 5 分の余分なエッジをトリムのクールダウン。
- リンス (製 15:1 エラストマー ベース剤の混合物を硬化する) PDMS 層と 7.6 × 5 cm 顕微鏡の接着面メタノールをスライドし、吹く乾燥に圧縮空気または高純度窒素銃。
- 顕微鏡のスライドに PDMS 層可逆的物理的なシーリング
- シーリング技術の可逆圧縮は、カスタム クランプ (いずれかの 3 D プラスチック製プリンターまたは金属の削り出し、図面印刷は図 4に示す、) のセットを利用しています。
- 下部クランプ プレートの顕微鏡スライドの切り欠きを置き、スライド上に (硬化剤混合物を 5:1 エラストマー ベース製) PDMS のレイヤーを整列します。
- PDMS 層に上側クランプ プレートを置きます。4 本の六角キャップのネジ、ネジを方向づけ、ナット、クランプの上からスレッドを使用して一緒にトップとボトム プレートを固定します。
- 顕微鏡のスライドに直接付着した PDMS
- 顕微鏡スライドの上に (エージェントの混合物を硬化に 30: 1 エラストマー ベース製) PDMS の層を配置します。
- スライドに PDMS 層を押します。柔らかく、非常に接着の PDMS 層 (30: 1) は、クランプ (図 3 L) から永久的な化学結合や物理的なプレスなし防水シールを作成するスライドに固執すべきです。
- シーリング技術の可逆圧縮は、カスタム クランプ (いずれかの 3 D プラスチック製プリンターまたは金属の削り出し、図面印刷は図 4に示す、) のセットを利用しています。
3. EcoFABs 滅菌
- 超純水 EcoFAB デバイスをすすいでください。
- EcoFAB コンテナーに 1 つの EcoFAB デバイスを配置し、デバイスの浸水まで 70% エタノールを追加します。コンテナーのふたを閉じ、エタノールで内部のすべての面をウェットに軽く振る。EcoFAB デバイスのルート成長室は非常に少ない、エタノールで満ちているまたは気泡がないことを確認します。
- 室温で 30 分放置後、70% エタノールを注ぎ、5 分の 100% エタノールと孵化を繰り返します。
- エタノール、流出、それを完全に乾燥するため層流フードの 16 h の滅菌 EcoFAB を孵化させなさい。利用可能な場合は、UV を 1 h のフード内で光を回すシステムを滅菌します。
注意: は、紫外線ライトを使用するときに適切な PPE を着用します。 - 滅菌 EcoFABs 滅菌フードまたは将来使用するためオートクレーブ バッグ格納します。
4 led EcoFABs ライト (図 5) を育てる
- EcoFAB コンテナーにストリップ LED を取り付ける
- 9 LED クリップの EcoFAB コンテナーの場所をマークします。最初のクリップを縁 (図 5 a)、容器の底から 120 ミリメートルで開始し、ドロップ 10 mm 各次のクリップで、コンテナーの周りのスパイラルにクリップの場所をマークする進みます。1 m LED ストリップ 2 回コンテナーの周りをラップすることができるクリップ 9 個のスパイラル。
- ホット接着剤それぞれに LED クリップは、クリップの取り付け穴の位置に揃えてコンテナーにホット接着剤の 2 つの指紋を追加することによって位置をマークしました。接着剤のこれらの 2 つの指紋にクリップの穴を押し、穴の上に接着剤のもう一つの軽打を追加します。9 クリップ スパイラル (図 5 b) を形成するまでに、すべてのクリップの手順を繰り返します。
注意: は火傷を避けるためにホット接着剤を使用するとき手袋と他の PPE を着用します。 - スレッド スパイラル形状のクリップを通して LED ストリップの Led コンテナーに直面するいると。ストリップ 2 倍のまわりで一周する必要があります (図 5)。
- コント ローラー (図 5の表示が点灯するライト、コント ローラーのプログラミングと EcoFAB の商工会議所は、4.3 に記載されて) と電源ストリップ LED を接続します。
警告: 感電の危険: ワイヤを接続する場合、電源ユニットが接続されていないことを確認します。- (コント ローラーのセットアップの図が表示されます図 5 e ) 2 線式ケーブルを使用してコント ローラーの「入力: V +」・"入力: V」の端子に電源の正と負の端子に接続します。
- コント ローラー上の 1 つの「出力」チャネルに裸の女性のケーブルの裸の端から負のリード線を接続します。
注: 5 枚まで 1 m の LED ストリップをサポートできるように、このプロトコルで利用されるコント ローラーの 5 つのチャンネルがあります。 - コンパクトなコネクタ (1 つ以上のチャンネルが必要な) 場合、接続ケーブルのすべての肯定的なリードを接続し、コント ローラーの出力「V +」端子にこのコネクタをリンク。
- 各 LED がある制御する独自のチャネルそれぞれの LED のストリップをケーブルのメス側に差し込みます。必要な場合は、女性から男性へケーブルを使用範囲を拡張します。
- 製造元の指示に従って必要なライト サイクルのためコント ローラーをプログラムします。
5. EcoFABs で植物を育てる
- 種子と発芽
注: 種子殺菌および実生植物とすべての次の手順は、無菌状態で行う必要があります。後述の滅菌工程はシロイヌナズナ, バーバータ エンバク, コムギ distachyonとパニカム virgatum の種子に適しています。パニカム virgatum種子の殺菌プロセスの前に 1 時間を 60% 硫酸で中断します。発芽率と発芽の均一性を考慮した EcoFAB デバイスあたり 1-2 種の準備をお勧めします。- 2 分の 70% エタノールで種子を浸します。
- ピペット、エタノールを削除、3 回滅菌水で種をすすいでください。
- 5 分間 10% の漂白剤の解決の種を残します。
- 漂白剤溶液を外し、3 回滅菌水を使用して種子を徹底的に洗います。
- 種子を滅菌水を追加し、4 ° C の冷却装置で遠心管をインキュベート 7 日間。
- 均等に 0.5 0.6 %phytagel 培地・培 (MS) 媒体へ種を広めるため、孔テープでプレートをシールします。
- 根長は約 5 mm EcoFABs (図 6 a) に転送するために植物を育てます。提示実験のためここでは、22 の ° C の成長チャンバ内 16 h 光/8 h 暗い照明政権を適用し、植物を孵化させなさい 2-7 d EcoFAB (エンバク barbataとコムギ distachyon、シロイヌナズナの 7 日の 2 日前に、シロイヌナズナとキビ virgatum)。
- 液体培地 (図 6) と EcoFABs に苗を転送すること
- 滅菌注射器やマイクロ ピペットを使用して、3 回の滅菌水と EcoFAB デバイスのルート室をフラッシュし、興味、(図 6 b、ステップ 5.1.6) たとえば 0.5 MS 培地の培地でルート室を埋めます。
- 慎重に EcoFAB デバイス (図 6) の工場タンクに 1 つ苗を挿入します。
注: ルートする必要があります完全に冠水するルート チャンバ内貯水池から突き出て撮影 - EcoFAB デバイスを回避するコンテナーに 3 mL の滅菌水を追加します。これは、湿度を高めるし、ルート室から培地の蒸発を減らします。
- コンテナーを閉じて孔テープ (図 6) で蓋をシールします。
- 植物インキュベーターに、EcoFAB を置くか (ステップ 4) のそれぞれの植物の生育に適した温度制御環境で EcoFAB 照明システムを利用します。本研究では、商工会議所を 24 ° C に設定します。
- ルート成長チャンバ内の成長媒体を補充し、水をコンテナーに追加する EcoFAB を定期的にチェックします。無菌状態ですべての手順を実行します。
注: 植物生育初期のルート成長室の補充は必要な 5 に 7 日ごとです。後の成長段階、詰め替えは必要なすべての 2 〜 3 日です。必要に応じて、ルート成長室から遠心管に根滲出液ソリューションを収集し、-80 ° C の冷凍庫に保管してスポイトやピペットを使用します。また、ゲルの撮像素子や顕微鏡で根の形態をイメージします。
- 固体基板 EcoFABs に苗を転送すること
- (K 図 3図 4) 顕微鏡のスライドに添付するカスタム クランプのセットを使用している場合、エラストマー ベース硬化剤を 5:1 の混合物で作製したルート室を使用します。または PDMS 層を作った 30: 1 の基本スライドを直接 (としてステップ 2.2 で説明) に PDMS 層を付着した場合エージェントの混合物を硬化するを選択します。
- 手順 3 で説明されているように EcoFAB 室を滅菌します。
- 慎重にルート室に滅菌土/砂を追加、PDMS 層を裏返し、およびルート室に基板を追加します。これは付着を低減するので顕微鏡スライド接触する領域に任意の粒子の落下を防ぐため。
- PDMS レイヤーの上に顕微鏡のスライドを置き、すべてのエッジをしっかりと押します。たまりの開口から土/砂が落ちないように、慎重に EcoFAB デバイスを反転します。
注: エージェントの混合物を硬化するのに基本を 5:1 の作った EcoFAB デバイス、シールを確保するためカスタム クランプを使用します。 - 液体培地または EcoFAB デバイスの入口または出口チャネルを通して水の流れし、ステップ 3.3 で説明したようにその工場貯水池に苗を転送します。
- EcoFABs に微生物を追加
- 流体培養基 LB の 8 ml 培養管に微生物のコロニーを転送し、外径 0.5 (約 12 時間) になります。
- 培養液を 15 mL 遠心管に移すし、微生物を餌に 3000 × g で 5 分間、室温で遠心分離します。
- 、上清を除去し、ターゲット EcoFAB で使用される植物成長媒体の 8 mL を追加します。微生物の餌を中断し、3000 × g で 5 分間室温でチューブを遠心分離します。
- 5.4.3 のステップを繰り返します。2 回に LB 栄養の痕跡を完全に削除します。
- その光の密度が 600 で約 0.5 まで洗浄微生物ペレットに植物成長培地を追加 nm。
- EcoFAB コンセントを介してルート室に微生物溶液 20 μ L を追加します。この文書で使用されている系統は、2-3 日と開始の植民地根面内にある植物の根に旅しました。
- 化学発光に設計さ, のルシフェラーゼ発現を誘導する植物培地に誘導 (1 mM IPTG) を確認します。
6 EcoFABs から根分泌物の代謝物プロファイリング
- LC/MS 用試料に基づくメタボロミクス解析
- 採集された EcoFABs、エアカーテンの根の分泌物と遠心チューブを入れて、チューブからすべての水を削除するエアカーテン入れます。
- 各チューブに LC MS グレードのメタノールの 300 μ L を追加し、30 分間超音波。
注意: は、メタノールを使用するときに PPE を着用します。 - 遠心分離機、内管を置き、5 分間 3000 × g で遠心分離機のこと。
- 新しい遠心チューブに液を移すし、真空濃縮でメタノールを蒸発させます。
- 各チューブに 1 mM LC MS 社内基準でのメタノール 150 μ L を追加し、12 h の 4 ° C の冷却装置で管を孵化させなさい。
- 5 分間 3000 × g でチューブを遠心し、0.22 μ m フィルター チューブに上清を移します。
- フィルター チューブを遠心し、チップ 200 μ L で 2.0 mL LC/MS バイアルにフィルター選択されたソリューションを転送します。
- LC/MS ラックの中瓶を置き、LC/MS の自動サンプラー内ラックします。
- データ分析
- 代謝物アトラスとカスタム Python スクリプト26へのアクセスを取得または他のデータ解析ソフトウェアを使用します。
- M に基づく代謝物を識別するz値、保持時間と化合物の分裂パターンは、代謝物標準のライブラリを使用して/。27
7 EcoFABs (図 7) の植物の根の質量分光イメージング
注: カスタム クランプ (図 7 a) でエージェントの混合物を硬化に 5:1 エラストマー ベース製 EcoFAB デバイスをルートはイニシエータ ・ ナノ構造質量 (NIMS) チップ、28,29,30 にスタンプを使用します。PDMS 層が反対 NIMS チップの表面に接着できますので。
- 1 時間紫外線 NIMS チップ表面を殺菌します。
- インキュベーターから成長が著しい植物と EcoFAB をピックアップし、無菌フード。
- EcoFAB コンテナーを開き、クランプの上部プレートを取り外します。
- 内、工場と共に PDMS 層を持ち上げて、NIMS チップ (図 7 b、D、E) に工場と PDMS 層を慎重に添付します。
注: 一度ルート NIMS チップ表面に触れて、それする必要があります移動できません。これは、「スミア」ルート代謝物を防ぎます。 - 軽く下に押して PDMS 層を介して根の根は完全に NIMS 表面を連絡するまで。20 分間 NIMS 表面に根を残します。
- もう一度ルートを NIMS 表面を横切って移動回避 NIMS チップから工場を含む PDMS 層から持ち上げます。に応じて、クランプに工場を戻します。
- カスタムの MALDI プレート NIMS チップを添付し、(図 7) をイメージング質量の MALDI 装置にプレートを読み込みます。
- OpenMSI プログラムを使用すると、ルート代謝物 (図 7-G)31の物材機構イメージを生成できます。
Representative Results
各 EcoFAB システムには EcoFAB デバイスが含まれています、植物サイズの透明なプラスチック容器。1 つの EcoFAB デバイスは工場の貯水池、ルート成長室、1.6 mm 流入口および標準 EcoFAB デバイス (2 D 図・図 3 H) の 1.6 mm コンセントまたはワイド コンセント EcoFAB デバイス (図 2 階・図 3 i の 10 mm コンセント).工場貯留層は 6 mm トップを開くと 3 mm 下部開口部を持つ台形形状で設計されています、このデザイン液体注入時リークのチャンスを軽減し、植物の成長に十分なスペースができます。ルート成長室は、図 2とEに示すように多くのモデル植物の根系に合わせて深さ 2 mm の楕円形を採用しています。培養液は EcoFAB コンテナーを開くことがなくルート成長室に流れることができるので、標準 EcoFAB デバイスの入口と出口の両方のチャンネルを PTFE チューブで接続できます。ワイド コンセント EcoFAB デバイス大幅にコンセントの流れの抵抗を削減し、複雑な根系が植物から派生した後定期的に収集根分泌物や厚いルート システムと植物を育てるときはできれば使用されます。
EcoFAB デバイスの PDMS 層を製造するため、金型、設計ソフトウェアで作成され、3 D 印刷の硬質不透明なマイクロホロ グラム生産、図 2と図 3に示すように。EcoFABs 中の植物は、無菌環境 (図 8 a、補助ファイル 1) の成長を確保する長い作業距離を使用して顕微鏡で直接観測することができます。植物と EcoFAB デバイスは、(図 8 bの補足ファイル 2) 植物微生物相互作用の高分解能イメージングを可能にする高解像度顕微鏡ステージ上にも合うことができます。不妊はこの環境に保持されません、高分解能イメージングのみエンドポイント測定用に適しています。
EcoFABs は、彼らの異なる生育段階でのライフ サイクルにわたって形態、代謝、微生物などの植物の分類学的研究を有効にするのに設計されています。ここでは、さまざまな植物の種を研究する一般的なプラットフォームとして EcoFABs を調べた。図 8-Eを示し、7 日間の古いシロイヌナズナ、コムギ distachyon、キビ virgatum EcoFABs で成長しています。すべての 3 つの植物は、一ヶ月以上、EcoFAB でよく育つと見つけられました。両方、双子葉植物、シロイヌナズナ単子葉、コムギの distachyonが、EcoFABs での再生の段階に見つかりました。
シーリング システム リバーシブル固体基板の使用が可能 (e.g。、土壌) 内 EcoFABs (ステップ 2.2)。この可逆的なアプローチをシール ルート成長室へ固体基板の読み込みを有効と根の根圏の特定の地域からのサンプルのコレクションができます。図 8 階-Hは、14 日間の古いコムギ distachyonは、養液栽培培地と同様に砂と養液栽培培地 (砂) と水 (土壌) を添加した土壌での成長のグループを表示します。ルート成長室で薄い固体基質の層は、根系の顕微鏡イメージング用貫通して光をことができます。
根の形態、植物の根系の分布と空間構成として定義され、栄養や水の可用性32,33など、多様な生育環境に不可欠な生理応答として成立しています。 34。EcoFABs は、時間の経過や栄養条件下で植物の形態を勉強の便利な方法を提供します。図 9 A-Fは、最初の 3 週間でdistachyon コムギの根の形態を追跡する EcoFABs を使用しての例を示します。コムギ distachyon苗 EcoFAB デバイスに転送され、そのルート構造がバイオ ・ ラッドのゲル撮像素子内にカメラによって記録されました。画像 J、python、matlab などの画像処理プログラムは、時間の経過やさまざまなメディア環境で根の形態の変化を定量化するさらに適用できます。3 週間にわたって総根領域の定量化が初期の段階で徐々 に増加を示した (< 1 週間)図 9で示すように、3 週間の終わりに線形成長傾向が続きます。
EcoFAB を構築するための主な動機は、植物と微生物の相互作用を調査することです。5.4 の手順で説明するよう、微生物は入口チャネルを介して EcoFAB デバイスのルート成長室に転送されます。図 10に示す緑膿菌 simea (以前の fluorescens) WCS417 を含む、EcoFAB (WCS417) の濃度と植物根系に植物成長促進化学発光ラベル付き苗を追加しました個体当たり 10 の6セルです。ゲルのイメージャは、ルート成長室 WCS417 微生物の異なる分布を示したで WCS417 信号が検出されました。両方 MS 液体培地で砂の固体基板の有無にかかわらず、WCS417 微生物は微生物栄養ルート ヒント (図 10 の生産のためのルートの先端領域の周りに集中するいると全体のルート システムの表面を植民地化。
代謝産物の吸収と同様、植物根分泌物の代謝物プロファイリング研究、植物と微生物の相互作用から解放ルート成長室から滲出液ソリューションは EcoFABs で植物のさまざまな成長段階にわたって収集されました。手順 6 で説明した滲出液のサンプルはその後液体クロマトグラフィー質量分析用抽出します。このメソッドを使用すると、植物によってしみ出させるし、微生物によって消費される代謝物の範囲が検出され、根分泌物細菌の植民地化との関連代謝物プロファイリングは現在調査中。
図 1:、EcoFAB ワークフロー 。植物は皿の上に発芽、微生物を追加ことができます滅菌 EcoFAB に転送。非破壊サンプリング: 根の形態を視覚化することができ、根分泌物をサンプリングしのイメージを作成することができます。破壊的なサンプリングは、詳細で微生物、ルート、および撮影パラメーターの解析を許可します。
図 2: 3 D のコンポーネントは EcoFAB デバイス作製のための型を印刷します。(A) 上および傾斜鋳造フレームの表示。(B) 上部と傾斜挿入のビュー。(C) 上下標準モールド ベースのビューを傾斜します。(ワイド コンセント モールド ベースの E) 上および傾斜表示。(D, F)標準・ ワイド コンセントの EcoFAB デバイスをそれぞれ加工組み立て用金型。楕円形の寸法が小型の EcoFAB 型のため 51 mm × 34 mm と 76 mm × 62 mm 大きい EcoFAB 型のためです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: EcoFAB デバイス作製。(A) エラストマー ベースと硬化剤の混合物を金型に注ぐ。(B) 4 h (C) 金型からカバーの取り外しのための 85 ° c の混合物と金型を加熱します。(D) 鋳造のフレームから、PDMS を分離します。(E) 金型鋳造フレームから基本を押します。(F)、PDMS をエッジに沿って金型から分離するナイフを使用しています。(G) 金型ベースから離れてゆっくりと PDMS 層を剥離。(H) 標準の PDMS 層の入口と出口の両方のチャネルの穴を突き。(I) はワイド コンセント PDMS 層の入口チャネルの穴を開けます。(J)、PDMS 膜 (15:1 エラストマーの基本剤混合物を硬化する) および顕微鏡のスライドは、洗浄し、接合用クリーナー プラズマに転送。(K) 使用は、顕微鏡のスライドに (硬化剤混合物を 5:1 エラストマー ベース製) PDMS のレイヤーを保持するクランプします。(L) 顕微鏡のスライドに直接 (エージェントの混合物を硬化に 30: 1 エラストマー ベース製) PDMS 層を押します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: カスタム クランプのデザイン。(上の A) 上および傾斜表示はクランプ プレートです。(B) 上および傾斜表示下のクランプ プレートです。(C) 上下 4 セット hex キャップネジの組み立てられたクランプ ビューを傾斜。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: LED の取り付けはライトを育てる。(A) EcoFAB コンテナーを螺旋状に 9 LED クリップの場所をマーキング。(B) LED クリップ EcoFAB コンテナーに接続されています。(C) これらのクリップを通して LED ストリップのスレッド。(D) LED ストリップを 24 v の電源と有線コント ローラーに接続します。(E) コント ローラーに配線の回路図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: EcoFABs に苗を転送することです。コムギ distachyon植物が 0.5 MS プレート上に 2 日間の成長した (、)。(B) ルート室植物成長培地充填。(C) ピンセットを使用して工場の貯水池にルートを慎重に挿入します。(D) 容器の底に 3 mL の水を追加した後、孔テープで EcoFAB コンテナーをシールします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: EcoFABs にルーツを植物の NIMS イメージングします。(A)コムギ distachyon滅菌 EcoFAB で成長しています。(B) 添付 NIMS チップ 20 分 (C) による銅テープ カスタム MALDI プレート上に NIMS チップを添付するために工場と PDMS 層と MALDI 質量分析計に読み込みます。(D G) 7 日の古い 1 つ 1 つ 20 日間の古いコムギ distachyonイメージング機構用 (D, E) と (F, G) は、対応する NIMS イメージ。優勢なイオンが赤、緑、および青で強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: EcoFABs の一般的なアプリケーションです。(A) 直接コムギ distachyon長い作業距離顕微鏡のセットアップと EcoFAB での根の生長をキャプチャします。(B) 直接高分解能顕微鏡のセットアップをルート ・微生物相互作用を観察すること。(C E) 7 日間の古いシロイヌナズナ(C)、コムギ distachyon (D)、0.5 MS 水耕培地、砂 (G) と (h) で 0.5 MS 水耕 (F) (F ・ H) 14 日の古いコムギ distachyonでキビ virgatum (E)0.5 MS 培地と水、それぞれ付属基板。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 根の形態を研究する EcoFABs を使用しています。(A ~ F)コムギ distachyonは、EcoFABs の成長の根の開発は最初の 3 週間の間に 0.5 MS 培地でいっぱい: (A) 2 日、(B) 4 日、(C) 7 日、(D) 11 日、(E) 14 日、成長の (F) 21 日。(ImageJ ソフトウェアは G) 平均歯根表面積を推定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 根と微生物の相互作用を研究する EcoFABs を使用しています。(A、B、C)15 日間の古いコムギ distachyonをメディア MS 液体のソリューション、砂および土の基板上のさまざまな形で緑膿菌の fluorescens WCS417 と植民地化のグループ。(D、E、F)その根系の明るいフィールド画像。(G、H、私)14 日共同栽培した後これらのルート システムの対応する化学発光イメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
の補足ファイル 1。根の成長をキャプチャする EcoFAB を使用しています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
の補足ファイル 2。ルート微生物の相互作用をキャプチャする EcoFAB を使用しています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
プロトコルは生態系の作製を使用して作成するここで報告 EcoFABs は、高度に制御された実験室で生物学体系的な植物のコミュニティ リソースを提供します。3 D 印刷の進歩は、広くアクセス可能な技術を構築し、EcoFAB のデザインを繰り返し微調整を提供します。紹介ルート室はイメージングと不妊、植物と微生物の相互作用を調査するため微生物の制御に加えを有効に維持することに適していることがわかった。EcoFAB プラットフォームは、様々 な植物種と互換性が。追加実験は自然環境で育つ植物に調査結果を一般化する必要がありますその狭いルート チャンバ内で生育中の生理学的な効果を認識することが重要です。
LED の成長ライト、滅菌チェンバーの使用する波長、強度、期間、植物の成長と並行して関連する生理学的パラメーターなど、さまざまな光の条件の影響を検討できます。可逆的接合ルート室は、空間的生化学的および遺伝的分析のための試料を収集にも固体基板の使用を許可します。土、砂、水晶ビーズなどの固体基板上のアプリケーションより生態学的関連研究所生態系を構築する EcoFABs を使用しての可能性を提供しています。ただし、さらにほとんど土壌の正確な反射である飽和液 (水耕文化) が重要になる使用を紹介すべてのシステムは彼らをよりよく表すような土の内で空気のポケットを維持するためにこれらのデザインを絞り込む自然な土壌。
簡単なカメラや顕微鏡の使用は、携帯電話のレベルに両方のバルクでイメージ根系形態の開発に記載されます。監視の根の形態のイメージングと定量この適性は植物成長の条件に遺伝子型 adaptions によって発生する植物生理・分子シグナルの調節機構を理解するために役立つでしょう。しかし、生理学的な根の発育を研究するため制限は、EcoFAB デバイスの現在の水平方向の配置です。自然環境で根の重力反応は根系の主に垂直方向の開発に します。したがって、自然環境からいくつかの要因で異なる可能性がここに示す水平システムとルート室の垂直方向の配置による EcoFAB システムの作製は将来の EcoFAB バージョンのための望ましい目標です。現在の EcoFAB デバイスが水平に置かれているルート形態パラメーター、微生物に応答したり、さまざまな条件での分析が可能です。高分解能イメージングは、単一の菌株や植物についての部分は各種栄養十分なおよび欠乏条件下で植民地化した情報を提供するコミュニティのルート植民地化ダイナミクスをキャプチャに適用できます。このような研究がどのように工場内細菌叢解析を組み立てているし、これらのダイナ ミックスが時間とともにどのように変化に重要な新しい洞察を提供することが予想される、例えば根として開発。
マイクロ流体デバイスは、非常に若い植物のイメージングを有効にして、通常収集された代謝物の量は LCMS 分析のために十分ではありません。化学発光構造 (グロ ルート) や NMR 手法33,34どちらか植物が変換されると、rhizotrons など、土壌ベースのシステムから歯根形態のイメージングが可能します。これらのシステムからの代謝物抽出が大量のサンプルのため時間がかかるです。EcoFABs は、両方の組み合わせ: 製作、マイクロ流体デバイスに似ています。EcoFABs がシンプルで安価な再現するために設計されていますが、彼らの生殖段階まで、規模の大小の根系を持つ植物を育てるための部屋のサイズを調整できます。根の形態変化とルート滲出物の同時観測が可能です。システムは無菌、特定微生物の制御に加えを有効にすることです。
EcoFABs は、制御の導入、微生物と代謝物のサンプリングを有効にするのに設計されています。具体的には、ルート成長室から採取した試料は質量分光学的代謝物プロファイリングのための十分なことが判明します。質量分析イメージングの統合 (e.g。、NIMS テクニック) 代謝物根系の空間分布の非破壊的なアプローチを提供します。この手法は有用な将来の安定同位体トレース実験および特定の代謝物36マッピング微生物ローカリゼーションでしょう。このプロトコルは、単一の菌株に集中している、確かには同じ設計はより複雑なコミュニティのため使用できます。サンプル ボリュームと、EcoFABs 内のバイオマスは、DNA シーケンシング技術とそれ以上の統合のために十分以上、特性と微生物群集構造と遺伝子発現を監視することが重要されます可能性があります。
結論としては、このプロトコルの詳細を簡単に実装および周りの研究者によって拡張できるシンプルでアクセス方法に重点を置いて、植物と微生物の相互作用の調査のために設計された実験生態系の作製、世界。現在の取り組みは、各 EcoFAB が個別に制御光と温度などの温度制御システムの統合と研究所の再現性をデモンストレーションを目指しています。自動サンプリングの統合、EcoFABs 内にある関連工場内細菌叢解析を確立するための再現可能なプロトコルの開発、EcoFAB ルート チェンバーの補充システムのさらなる進化にあります。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事は契約号の下で米国エネルギー省の科学のオフィスでサポートされているローレンス ・ バークレー国立研究所の研究室監督研究と開発 (LDRD) プログラムによってサポートされて・ デ ・ AC02 05CH11231、カリフォルニア大学バークレー校に米国のエネルギー オフィス科から賞・ デ ・ SC0014079。分子鋳物工場で作業はエネルギー契約号の米国部の下でサポートされていたデ-AC02-05CH11231。我々 はまた彼らの助けのスザンヌ ・ m ・ Kosina、キャサリン ルイ、ベンジャミン ・ p. ボーウェン、ローレンス ・ バークレー国立研究所のベンジャミン ・ J ・ コールをありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
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