この資料では、生態系の植物や高度に制御された実験室で植物微生物相互作用研究を可能にするデバイス (EcoFABs) の作製のための詳しいプロトコルについて説明します。
有益な植物・微生物相互作用は、低入食品とバイオ エネルギー生産を後押しする可能性と持続可能な生物学的ソリューションを提供しています。これらの複雑な植物と微生物の相互作用のより機械論的理解は同様に実行する基本的な生態学的研究調査植物土壌微生物相互作用として工場の生産を改善することが重要になります。ここでは、生態系作製の詳細な説明が表示されが、広く利用可能な 3 D 印刷技術を使用して、環境固有の植物・微生物相互作用の解明のため制御室生息地 (EcoFABs) を作成するには条件。EcoFABs の 2 つのサイズは、シロイヌナズナ、コムギ distachyon、キビ virgatumなど様々 な植物と微生物の相互作用の調査に適しているとおりです。これらの流れによってデバイスは、制御操作とルート内細菌叢解析、ルート化学のサンプリングし同様根の形態および微生物のローカリゼーションのイメージングします。このプロトコルには、EcoFABs 内の無菌状態を維持してマウント EcoFABs に独立した LED ライト システムの詳細が含まれています。砂の土壌を含むメディアの種類を追加するための詳細な手順、およびイメージングを使ったこれらのシステムの評価と結合した液体の成長媒体メタボロミクスは、説明。一緒に、これらのシステムは植物の植物微生物コンソーシア マイクロバイ組成 (含む変異体)、植物の生育、根の形態、滲出液組成の監視操作を含む動的かつ詳細な調査を有効にして制御環境下における微生物のローカライズ。これらの詳細なプロトコルは、理想的には植物と微生物の相互作用を調査するための標準化された実験装置の作成を支援、他の研究者の重要な出発点となることを期待しています。
農業植物有益な微生物の応用は、持続可能な食糧と成長人口1,2,3、4を提供するバイオ燃料の生産を向上させる大きな可能性を提供しています。かなりの作業量は、植物栄養摂取、ストレス、耐性と病気5,6,7,8への抵抗の工場内細菌叢解析の重要性をサポートします。しかし、それは複雑さと関連付けられている irreproducibility とマイクロバイ組成と遺伝学を正確に制御することができないのためのフィールド生態系における植物微生物相互作用のこれらのメカニズムを調査することは困難 (e.gを使用して。微生物突然変異体)4,9,10。
1 つの戦略は有効にする簡易モデル生態系を構築する制御、レプリケートされた実験フィールド10、11、さらにテストすることができます洞察力を生成する植物微生物相互作用の調査 12。この概念は、土入りのポット栽培植物を使用して従来のアプローチまたは温室やインキュベーター13内で寒天平板をビルドします。これらは、おそらくまま最も広く使用されるアプローチが、彼らは正確に監視および植物成長環境を操作する能力を欠いています。これらの端に地下プロセス14,15を勉強する能力の主要な改善を表す rhizoboxes と rhizotrons と、根圏土壌16代謝産物の分析のプロトコルは、最初が掲載されました。最近では、高スループットの解析を有効にするには、高度なマイクロ デバイス13,17工場チップ18,19、RootArray20、RootChip21などをされています。液体の流れの中で小さなモデル植物シロイヌナズナの初期成長段階を監視するマイクロ メートル スケールの空間分解能で植物を表現型解析のための効率的なツールとして開発されました。最近では、2 層のイメージング プラットフォームは、マイクロ流体プラットフォーム22幼苗期におけるシロイヌナズナ根毛イメージングを可能にする記述されていた。
ここでは、詳しいプロトコル制御研究所デバイス (EcoFABs) を構築するため、植物微生物相互作用やショーの多様な研究に使用できる植物シロイヌナズナ、コムギを含む提供distachyon23, 生態学的重要な野生エンバクエンバク barbataとバイオ エネルギー作物キビ virgatum (グラス)。EcoFAB は 2 つの主要なコンポーネントを含む無菌植物成長プラットフォーム: EcoFAB デバイスと滅菌工場サイズの透明容器。3 D 印刷プラスチック金型からレイヤーをデバイス製造プロセス鋳造 PDMS を含むポリジメチルシロキサン (PDMS) から作られています EcoFAB と24,25 報告以前メソッドを使用して顕微鏡スライド上に PDMS レイヤーを結合.EcoFAB ワークフロー、デバイス作製、殺菌、種子の発芽、苗移植、微生物接種/cocultivation、試料の調製、分析などの詳細な手順は、このプロトコル (図 1) のとおりです。基本的なワークフローのさらなる変更は、説明、コンピューターのインストールを含む可能 LED ライトを育てる、固体基板の使用率。イメージング技術の根の形態を調査するための利用、根の微生物植民地化および根分泌物の質量分光イメージングを説明しました。標準化研究所植物マイクロバイ研究紹介、詳細なプロトコルと同様に、すぐに利用できる材料に基づく単純な安価な設計コミュニティ リソースに EcoFAB プラットフォームになることと見込んでください。
プロトコルは生態系の作製を使用して作成するここで報告 EcoFABs は、高度に制御された実験室で生物学体系的な植物のコミュニティ リソースを提供します。3 D 印刷の進歩は、広くアクセス可能な技術を構築し、EcoFAB のデザインを繰り返し微調整を提供します。紹介ルート室はイメージングと不妊、植物と微生物の相互作用を調査するため微生物の制御に加えを有効に維持することに適していることがわかった。EcoFAB プラットフォームは、様々 な植物種と互換性が。追加実験は自然環境で育つ植物に調査結果を一般化する必要がありますその狭いルート チャンバ内で生育中の生理学的な効果を認識することが重要です。
LED の成長ライト、滅菌チェンバーの使用する波長、強度、期間、植物の成長と並行して関連する生理学的パラメーターなど、さまざまな光の条件の影響を検討できます。可逆的接合ルート室は、空間的生化学的および遺伝的分析のための試料を収集にも固体基板の使用を許可します。土、砂、水晶ビーズなどの固体基板上のアプリケーションより生態学的関連研究所生態系を構築する EcoFABs を使用しての可能性を提供しています。ただし、さらにほとんど土壌の正確な反射である飽和液 (水耕文化) が重要になる使用を紹介すべてのシステムは彼らをよりよく表すような土の内で空気のポケットを維持するためにこれらのデザインを絞り込む自然な土壌。
簡単なカメラや顕微鏡の使用は、携帯電話のレベルに両方のバルクでイメージ根系形態の開発に記載されます。監視の根の形態のイメージングと定量この適性は植物成長の条件に遺伝子型 adaptions によって発生する植物生理・分子シグナルの調節機構を理解するために役立つでしょう。しかし、生理学的な根の発育を研究するため制限は、EcoFAB デバイスの現在の水平方向の配置です。自然環境で根の重力反応は根系の主に垂直方向の開発に します。したがって、自然環境からいくつかの要因で異なる可能性がここに示す水平システムとルート室の垂直方向の配置による EcoFAB システムの作製は将来の EcoFAB バージョンのための望ましい目標です。現在の EcoFAB デバイスが水平に置かれているルート形態パラメーター、微生物に応答したり、さまざまな条件での分析が可能です。高分解能イメージングは、単一の菌株や植物についての部分は各種栄養十分なおよび欠乏条件下で植民地化した情報を提供するコミュニティのルート植民地化ダイナミクスをキャプチャに適用できます。このような研究がどのように工場内細菌叢解析を組み立てているし、これらのダイナ ミックスが時間とともにどのように変化に重要な新しい洞察を提供することが予想される、例えば根として開発。
マイクロ流体デバイスは、非常に若い植物のイメージングを有効にして、通常収集された代謝物の量は LCMS 分析のために十分ではありません。化学発光構造 (グロ ルート) や NMR 手法33,34どちらか植物が変換されると、rhizotrons など、土壌ベースのシステムから歯根形態のイメージングが可能します。これらのシステムからの代謝物抽出が大量のサンプルのため時間がかかるです。EcoFABs は、両方の組み合わせ: 製作、マイクロ流体デバイスに似ています。EcoFABs がシンプルで安価な再現するために設計されていますが、彼らの生殖段階まで、規模の大小の根系を持つ植物を育てるための部屋のサイズを調整できます。根の形態変化とルート滲出物の同時観測が可能です。システムは無菌、特定微生物の制御に加えを有効にすることです。
EcoFABs は、制御の導入、微生物と代謝物のサンプリングを有効にするのに設計されています。具体的には、ルート成長室から採取した試料は質量分光学的代謝物プロファイリングのための十分なことが判明します。質量分析イメージングの統合 (e.g。、NIMS テクニック) 代謝物根系の空間分布の非破壊的なアプローチを提供します。この手法は有用な将来の安定同位体トレース実験および特定の代謝物36マッピング微生物ローカリゼーションでしょう。このプロトコルは、単一の菌株に集中している、確かには同じ設計はより複雑なコミュニティのため使用できます。サンプル ボリュームと、EcoFABs 内のバイオマスは、DNA シーケンシング技術とそれ以上の統合のために十分以上、特性と微生物群集構造と遺伝子発現を監視することが重要されます可能性があります。
結論としては、このプロトコルの詳細を簡単に実装および周りの研究者によって拡張できるシンプルでアクセス方法に重点を置いて、植物と微生物の相互作用の調査のために設計された実験生態系の作製、世界。現在の取り組みは、各 EcoFAB が個別に制御光と温度などの温度制御システムの統合と研究所の再現性をデモンストレーションを目指しています。自動サンプリングの統合、EcoFABs 内にある関連工場内細菌叢解析を確立するための再現可能なプロトコルの開発、EcoFAB ルート チェンバーの補充システムのさらなる進化にあります。
The authors have nothing to disclose.
この仕事は契約号の下で米国エネルギー省の科学のオフィスでサポートされているローレンス ・ バークレー国立研究所の研究室監督研究と開発 (LDRD) プログラムによってサポートされて・ デ ・ AC02 05CH11231、カリフォルニア大学バークレー校に米国のエネルギー オフィス科から賞・ デ ・ SC0014079。分子鋳物工場で作業はエネルギー契約号の米国部の下でサポートされていたデ-AC02-05CH11231。我々 はまた彼らの助けのスザンヌ ・ m ・ Kosina、キャサリン ルイ、ベンジャミン ・ p. ボーウェン、ローレンス ・ バークレー国立研究所のベンジャミン ・ J ・ コールをありがちましょう。
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |