本文描述了设备 (EcoFABs) 的生态系统制造的详细协议, 它能够在高控制的实验室条件下对植物和植物微生物相互作用进行研究。
有益的植物-微生物相互作用提供了可持续的生物解决方案, 有潜力促进低投入的食品和生物能源生产。更好的机械理解这些复杂的植物-微生物相互作用将是至关重要的改善植物生产和执行基本生态研究, 调查植物-土壤-微生物相互作用。这里, 利用广泛可用的3D 印刷技术, 提出了生态系统制造的详细描述, 以建立受控实验室生境 (EcoFABs), 用于机械研究特定环境中的植物-微生物相互作用条件。描述了两种尺寸的 EcoFABs, 适合于与各种植物物种的微生物相互作用的调查, 包括拟南芥、 Brachypodium distachyon和柳枝柳枝稷。这些流动设备允许控制操作和抽样的根微生物, 根化学, 以及图像的根形态和微生物的定位。该协议包括在 EcoFABs 内保持无菌条件和将独立的 LED 光系统安装到 EcoFABs 上的详细信息。详细的方法, 以添加不同形式的介质, 包括土壤, 沙子, 和液体生长介质耦合的特点, 这些系统使用成像和新陈代谢描述。这些系统共同对植物和植物微生物联营集团进行动态和详细的调查, 包括对微生物组成 (包括突变体) 的操作、植物生长的监测、根系形态、渗出物组成和受控环境条件下的微生物定位。我们预计, 这些详细的协议将成为其他研究人员的一个重要的出发点, 最好的帮助建立标准化实验系统, 以调查植物微生物相互作用。
有益植物微生物在农业中的应用提供了巨大的潜力, 以增加可持续的食品和生物燃料的生产, 以提供增长的人口1,2,3,4。大量的工作支持植物微生物在植物养分摄取、耐应力和抗病性方面的重要性5,6,7,8。然而, 由于复杂性和相关 irreproducibility, 无法精确控制微生物组成和遗传学 (e. g), 因此很难对田间生态系统中植物-微生物相互作用的机制进行调查。微生物突变体)4,9,10。
一个战略是建立简化的模型生态系统, 使受控制的, 复制的实验室实验, 调查植物-微生物相互作用, 以产生洞察力, 可以进一步测试在领域10,11, 12。这一概念建立在传统的方法上, 使用种植在土壤填充盆或在温室或孵化器内的琼脂板的植物13。虽然这些可能仍然是最广泛使用的方法, 但它们缺乏精确监测和操作植物生长环境的能力。为了达到这些目的, rhizoboxes 和 rhizotrons 代表了研究以下地面进程的能力的重大改进14,15, 并发布了第一个协议来分析土壤中的根际代谢产物16。最近, 为了启用高通量分析, 高级微流控设备13,17 , 如工厂芯片18,19, RootArray20和 RootChip21, 已开发为植物分型的有效工具, 用微米尺度空间分辨率来监测小模型植物拟南芥在液体流动培养基中的早期生长阶段。最近, 介绍了一种双层成像平台, 它能使拟南芥在幼苗阶段的根发成像具有微流控平台22。
这里提供了构建受控实验室设备 (EcoFABs) 的详细协议, 用于研究植物微生物相互作用, 并表明它们可用于研究各种植物, 包括拟南芥、 Brachypodiumdistachyon23, 生态上重要的野生燕麦阿韦纳莲、和生物能源作物柳枝柳枝稷 (柳枝稷)。EcoFAB 是一种不育植物生长平台, 包括两个主要成分: EcoFAB 装置和无菌植物大小透明容器。该 EcoFAB 设备是由一个烷的制造过程, 包括从3D 印刷塑料模具铸造和结合在显微镜幻灯片上, 使用以前报告的方法2425.本协议 (图 1) 描述了 EcoFAB 工作流的详细程序, 如设备制造、杀菌、种子萌发、苗移植、微生物接种/cocultivation、样品制备和分析。对基本工作流的进一步修改进行了描述, 包括安装计算机控制的 LED 生长灯和固体基板的使用。介绍了影像学技术在研究根系形态变化、根系微生物定植、根系分泌物质谱成像等方面的应用。我们预计, 基于现成材料的简单、廉价的设计, 以及此处提出的详细协议, 将使 EcoFAB 平台成为社区资源, 规范实验室植物微生物学研究。
在这里报告的使用生态系统制造创建 EcoFABs 提供社区资源的系统植物生物学研究在高度控制的实验室条件。3D 印刷技术的进步为构建和迭代精炼 EcoFAB 设计提供了广泛的方便。这里提出的根室是非常适合的成像显微镜和维持不育, 使受控添加微生物, 以调查植物微生物相互作用。EcoFAB 平台与各种植物品种相容。重要的是要认识到生长在狭窄的根腔内的植物的生理效应, 这样就需要额外的实验来将发现推广到在自然环境中生长的植物。
使用无菌室和 LED 生长灯, 可以调查各种光照条件的影响, 包括波长, 强度和持续时间, 对植物生长和相关的生理参数的平行。可逆的粘合根室允许使用固体基底以及空间收集固体样品进行生化和遗传分析。固体基质 (如土壤、沙子和石英珠) 的应用提供了利用 EcoFABs 构建更具生态学意义的实验室生态系统的可能性。然而, 这里提出的所有系统都使用饱和液体 (水培栽培), 这是不准确的反映大多数土壤, 这将是重要的是进一步细化这些设计, 以保持空气袋在土壤中, 使他们更好地代表天然土壤。
简单的照相机和显微镜的使用被描述对映像根系统形态学发展在大到细胞水平。这种适合的监测根形态学成像和定量将有助于了解植物生理和分子信号触发的植物基因型 adaptions 的生长条件的调控机制。然而, 研究生理根发育的一个局限是 EcoFAB 装置的当前水平位置。在自然环境中, 根 gravitropic 反应导致根系统的主要垂直发展。因此, 这里所呈现的水平系统在某些因素中可能不同于自然环境, 而 EcoFAB 系统的制作, 垂直放置的根腔是未来 EcoFAB 版本的理想目标。虽然目前的 EcoFAB 设备是水平放置, 分析的根形态参数在不同的条件, 或对微生物的反应, 是可能的。高分辨率成像可用于捕获单个孤立物或群落的根殖民化动力学, 提供有关哪些植物部分在各种养分充足和不足条件下被殖民的信息。预计这类研究将为植物微生物的组装提供重要的新见解, 以及这些动态如何随着时间的推移而变化, 例如根系的发展。
微流控装置使非常年轻的植物成像, 通常收集的代谢物的数量是不够的 LCMS 分析。土壤为基础的系统, 如 rhizotrons, 允许在植物转化为化学发光结构 (格洛根) 或以核磁共振为基础的方法33,34时, 根形态学的成像。由于大量的样品, 从这些系统中提取代谢物是费时费力的。EcoFABs 是两者的结合: 制造类似于微流控设备。EcoFABs 的设计是简单和廉价的繁殖, 但房间的大小可以调整, 以种植小的或大的根系系统, 直至其生殖阶段。同时观察根形态学改变和根渗出是可能的。该系统是无菌的, 能够控制特定微生物的添加。
EcoFABs 的设计是为了控制微生物和代谢物的导入和取样。具体地说, 从根生长室收集的样本被发现足以用于质谱代谢物的分析。质谱成像的集成 (随着 nims) 提供了一种非破坏性的方法来研究根系系统的代谢物空间分布.该技术可能有助于今后稳定同位素追踪实验, 并将微生物定位映射到特定代谢物36。虽然本议定书侧重于单一隔离, 但同样的设计也可以用于更复杂的社区。EcoFABs 中的样本量和生物量很可能足以与 DNA 测序技术进一步融合, 这对于表征和监测微生物群落结构和基因表达具有重要意义。
最后, 本议定书详述了为调查植物-微生物相互作用而设计的实验室生态系统的制作, 重点放在简单和容易接近的方法上, 研究人员可以很容易地实施和扩展世界。目前的努力旨在证明实验室之间的重复性和温度控制系统的集成, 使每个 EcoFAB 将有独立控制的光和温度。该系统的进一步发展将是整合 EcoFAB 根室的自动取样和再灌装, 并为在 EcoFABs 内建立相关的植物微生物制定可重现的协议。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了劳伦斯伯克利国家实验室的实验室指导研究和开发 (LDRD) 计划的支持, 由美国能源部根据合同编号支持。DE-AC02-05CH11231 和 DE-SC0014079 由美国能源部科学办公室授予加州大学伯克利分校。在美国能源部的合同号下, 分子铸造厂的工作得到了支持。DE-AC02-05CH11231。我们还感谢苏珊娜 m. Kosina, 凯瑟琳路易, 本杰明 p. 伯恩, 以及在劳伦斯伯克利国家实验室的本杰明 j. 科尔的所有帮助。
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |