Summary
Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor ecosysteem fabrikatie van apparaten (EcoFABs) waarmee de studies van planten en plant-microbe interacties in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.
Abstract
Heilzame plant-microbe interacties bieden een duurzame biologische oplossing met de potentie om lage-input voedsel en bio-energie productie stimuleren. Een beter mechanistische inzicht in deze complexe plant-microbe interacties zal doorslaggevend zijn voor de verbetering van de plantaardige productie zoals zo goed presterende basic ecologische studies behandelende bodem-plant-microbe interacties. Hier, wordt een gedetailleerde beschrijving voor de fabricage van het ecosysteem gepresenteerd, met behulp van algemeen beschikbare 3D afdrukken technologieën, maken van gecontroleerde laboratorium habitats (EcoFABs) voor mechanistisch onderzoek naar plant-microbe interacties binnen specifieke milieu voorwaarden. Twee maten van EcoFABs worden die voor het onderzoek van microbiële interacties met verschillende soorten van planten geschikt zijn, met inbegrip van Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonen Panicum miliaceumbeschreven. Deze apparaten doorstroomtest toestaan voor gecontroleerde manipulatie en bemonstering van de wortel microbiomes, wortel chemie evenals imaging van wortel morfologie en microbiële lokalisatie. Dit protocol omvat de details voor het handhaven van de steriele omstandigheden binnen EcoFABs en montagesystemen onafhankelijke LED licht op EcoFABs. Gedetailleerde methoden voor toevoeging van verschillende vormen van media, met inbegrip van vuil, zand, en vloeibare groei media gekoppeld aan de karakterisatie van deze systemen met behulp van imaging en metabolomica worden beschreven. Samen, deze systemen inschakelen dynamisch en gedetailleerde onderzoek van de plant en plant-microbial consortia met inbegrip van de manipulatie van microbiome samenstelling (inclusief mutanten), de monitoring van de plantengroei, wortel morfologie, afgescheiden samenstelling, en microbiële lokalisatie onder gecontroleerde milieu omstandigheden. Wij verwachten dat deze gedetailleerde protocollen als een belangrijk uitgangspunt voor andere onderzoekers dienen zal, idealiter helpen maken van gestandaardiseerde experimentele systemen voor het onderzoeken van de plant-microbe interacties.
Introduction
De toepassing van heilzame plant microben in de landbouw biedt grote mogelijkheden om duurzaam voedsel en de productie van biobrandstoffen om te voorzien in een groeiende bevolking1,2,3,4te verhogen. Een aanzienlijke hoeveelheid werk ondersteunt het belang van de plant microbiomes plant opname van voedingsstoffen, tolerantie aan spanningen en weerstand tegen ziekte5,,6,,7,8. Het is echter moeilijk te onderzoeken van deze mechanismen van plant-microbe interacties in veld ecosystemen als gevolg van de complexiteit en de bijbehorende irreproducibility en de onmogelijkheid om te precies regelen microbiome samenstelling en genetica (bv. met behulp microbiële mutanten)4,9,10.
Een strategie is om te bouwen van ecosystemen in het vereenvoudigde model inschakelen gecontroleerd, gerepliceerde laboratoriumexperimenten plant-microbe interacties voor het genereren van inzichten die verder kunnen worden getest in het veld10,11, onderzoeken 12. Dit concept is gebaseerd op traditionele benaderingen met behulp van planten gekweekt in bodem gevulde potten of agar platen in kassen of starterscentra13. Hoewel dit zal waarschijnlijk blijven de meest gebruikte benaderingen, ze missen het vermogen om nauwkeurig te controleren en manipuleren van de plant groei omgevingen. Voor deze doeleinden, rhizoboxes en rhizotrons vertegenwoordigen een grote verbetering in het vermogen om te studeren onder-grond processen14,15, en eerste protocollen werden gepubliceerd voor het analyseren van de rhizosfeer metabolieten in bodem16. Meer recentelijk, opdat hoge doorvoer analyse, geavanceerde microfluidic apparaten13,17 als Plant Chip18,19, RootArray20RootChip21, geweest ontwikkeld als efficiënte tools voor plant fenotypering met de ruimtelijke resolutie micrometer-schaal te controleren van de vroege groeistadia van de kleine model fabriek Arabidopsis thaliana in vloeibare stroom medium. Onlangs, een twee-laag imaging platform werd beschreven waarmee root haar beeldvorming van Arabidopsis thaliana met een microfluidic platform22stadium zaailing.
Gedetailleerde protocollen voor de bouw van gecontroleerde laboratorium apparaten (EcoFABs) hier voorwaarde, voor het bestuderen van de plant-microbe interacties en Toon dat ze kunnen worden gebruikt om te studeren diverse planten met inbegrip van Arabidopsis thaliana, kortsteel distachyon23, het ecologisch belangrijk wild oat Avena Barbata (BG), en het gewas van bio-energie Panicum miliaceum (switchgrass). EcoFAB is een steriele plant groei platform dat twee primaire componenten omvat: de EcoFAB apparaat en steriele plant middelgrote transparante container. Het apparaat uit een Polydimethylsiloxaan (PDMS bestaat) productieproces waarbij gieten PDMS EcoFAB lagen van een 3D gedrukte kunststof mal en verlijmen PDMS lagen in Microscoop dia's met behulp van methoden eerder gemeld24,25 . De gedetailleerde procedures EcoFAB de werkstroom, zoals apparaat-fabricage, sterilisatie, kieming van het zaad, zaailing transplantatie, microbe inoculatie/cocultivation, bereiding van de monsters en analyse, worden beschreven in dit protocol (Figuur 1). Verdere wijzigingen van de Basiswerkstroom zijn beschreven, met inbegrip van de installatie van de computer gecontroleerd groeien ledverlichting en het gebruik van vaste substraten. Het gebruik van beeldvormende technieken om te onderzoeken wortel morfologie verandert, microbiële kolonisatie van de wortels, en massa spectroscopische beeldvorming van exsudaat van de wortel worden beschreven. Wij verwachten dat het ontwerp van het eenvoudige, goedkope gebaseerd op de gemakkelijk beschikbare materialen, evenals de gedetailleerde protocollen gepresenteerde, het EcoFAB platform zal veranderen in een gemeenschap resource, standaardiseren laboratoriumonderzoek plant-microbiome.
Protocol
Let op: Dit protocol omvat het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen, scherpe voorwerpen, elektrische apparaten, hete objecten en andere gevaren die leiden schade tot kunnen. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE, bijv., chemisch bestendige handschoenen, veiligheidsbril, laboratoriumjas, lange kleren, gesloten-toed schoenen, enz.) moeten worden gedragen, en de passende veiligheidsprocedures (veiligheidstraining, gebruik van een zuurkast enz.) moet worden gevolgd.
1. EcoFAB apparaat Fabrication: Casting PDMS lagen (Figuur 2 en Figuur 3)
- Bouw van de mallen van de EcoFAB met behulp van 3D druktechnieken (de ontwerp-bestanden zijn beschikbaar op. Elke schimmel bestaat uit drie delen: een frame gieten, een aanbevolen schimmel base en een invoegen, zoals weergegeven in Figuur 2. Print de schimmel base en invoegen uit stijve ondoorzichtige fotopolymeren delen bevinden met behulp van een 3D-printer van kunststof. Gebruik van een minimum van 100 µm resolutie, en het gieten frame met acrylonitril butadieen styreen (ABS) afdrukken.
- Meng 40 mL siloxaan elastomeer basis met het genezen van de agent in een wegwerp 1 L container. Afhankelijk van de gewenste experiment (stap 2.1 en 2.2), gebruiken verschillende ratio's (v/v) van elastomeer base/genezen agent (5:1, 15:1 uit, of 30: 1). Ga door naar stappen 1.3 tot en met 1.8 voor alle soorten mengsels.
Let op: Draag chemisch bestendige handschoenen, veiligheidsbril en andere beschermingsmiddelen. - Plaats de container in een vacuuemcel voor minstens 30 min aan het verwijderen van luchtbellen uit het mengsel van elastomeer.
- Giet het mengsel in de geassembleerde 3D gedrukte plastic mal (Figuur 3 bis) en houd de mal op een blok van de verwarming bij 85 ° C gedurende 4 h (figuur 3B).
Let op: Draag beschermingsmiddelen die de te vermijden van brandwonden. - Laat de mal cool-down gedurende 5 minuten. Trek dan voorzichtig uit de invoegen uit de mal (Figuur 3 c), en voeg vervolgens langzaam een utility mes tussen de casting frame en PDMS (het mengsel van gestolde elastomeer) te scheiden (figuur 2D).
- Druk op de mal basis met PDMS omhoog uit het gieten frame (de 3E figuur). Gebruik een mes of andere hulpmiddelen te voorzichtig de PDMS laag te scheiden van de base schimmel aan de randen (figuur 3F), en vervolgens langzaam schil af van het oppervlak van de schimmel (Figuur 3 g).
- Maak inlaat en uitlaat kanalen op de PDMS lagen door het maken van ~1.6 mm gaten voor de poorten van het inlaat en uitlaat met een 15 gauge botte naald (Figuur 3 H, ik).
Opmerking: De standaard schimmel heeft een inlaat en uitlaat-poort, terwijl de wide-outlet schimmel alleen de perszijde (Figuur 3 H, ik moet). - Gebruik schaar om trim de randen van het PDMS lagen.
Opmerking: De bijgesneden PDMS lagen moet ≥76 mm x 51 mm rechthoeken voor kleine EcoFAB apparaten en ≥102 mm x 83 mm rechthoeken voor grote EcoFAB apparaten.
2. EcoFAB apparaat Fabrication: chemisch verbonden PDMS lagen in Microscoop dia's (Figuur 3 & Figuur 4)
- Permanent lijmen van de lagen PDMS Microscoop dia 's
- Spoel de kant van de hechting van de PDMS laag (gemaakt van een 15:1-elastomeer basis om te genezen van agent mengsel) en 7.6 × 5 cm Microscoop dia met methanol en vervolgens blaas droog met perslucht of een ultra zuivere stikstof-pistool.
Let op: Methanol is giftig. Werken in een zuurkast en beschermende eye bedekking, handschoenen en andere beschermingsmiddelen dragen. - Plaats de microscoopglaasje en PDMS laag naar een plasma reiniger met hun verlijmen kanten naar boven (figuur 3J). Als een plasma reiniger niet beschikbaar is, gaat u naar stap 2.2.
- Sluit de kamer en het gas vent ventiel van het plasma schoner en zet het vacuüm en de pomp van de kamer voor 1 min.
- Inschakelen van de macht van de generator van de plasma, en het niveau van de radiofrequentie (RF) naar de "HI" voor 1 min.
- Zowel de vacuümpomp en de plasma stroom uitschakelen en luchten van de kamer aan sfeer.
- Neem de microscoopglaasje en PDMS laag uit het plasma kamer en druk snel op alle vier randen van het PDMS laag op de dia met zelfs druk (Figuur 3 L). Zorg ervoor dat de regio centrum ovaal van het PDMS laag (de wortel kamer) raakt de dia niet.
- Plaats de verzegelde EcoFAB-apparaat op een 120 ° C verwarmen blok voor 20 min verder teneinde de permanente hechting tussen de PDMS laag en het microscoopglaasje.
- Laat het apparaat afkoelen voor 5 min. bijsnijden uit de extra randen van de PDMS laag met een mes.
- Spoel de kant van de hechting van de PDMS laag (gemaakt van een 15:1-elastomeer basis om te genezen van agent mengsel) en 7.6 × 5 cm Microscoop dia met methanol en vervolgens blaas droog met perslucht of een ultra zuivere stikstof-pistool.
- Omkeerbare fysieke verzegeling van het PDMS lagen op Microscoop dia 's
- De omkeerbare afdichten techniek maakt gebruik van een set van aangepaste klemmen (ofwel gedrukt door een 3D-printer van kunststof of machinaal in metaal, de tekeningen zijn afgebeeld in Figuur 4).
- Plaats de microscoopglaasje in de uitsparing op de bodemplaat van de klem en vervolgens de PDMS laag (gemaakt van een 5:1 elastomeer base om te genezen van agent mengsel) op de top van de dia uitlijnen.
- Plaats de bovenste klem plaat over de PDMS laag. Beveilig de platen van het boven- en onderkant samen met behulp van vier hex cap-schroeven, kunt u de schroeven zodat de noten zijn threaded op vanaf de bovenkant van de klem.
- Daaraan vastzittende PDMS rechtstreeks naar de Microscoop dia 's
- Plaats de PDMS laag (gemaakt van een 30: 1 uit elastomeer base om te genezen van agent mengsel) op een microscoopglaasje.
- Druk op de PDMS laag naar de dia. De zachte, zeer zelfklevende PDMS laag (30: 1) moet vasthouden aan de dia maken van een waterdichte afdichting zonder het permanente chemische binding of fysieke druk op basis van een klem (Figuur 3 L).
- De omkeerbare afdichten techniek maakt gebruik van een set van aangepaste klemmen (ofwel gedrukt door een 3D-printer van kunststof of machinaal in metaal, de tekeningen zijn afgebeeld in Figuur 4).
3. EcoFABs sterilisatie
- EcoFAB apparaten met ultrazuiver water spoelen.
- Plaats een EcoFAB apparaat in een EcoFAB container, en 70% ethanol toe te voegen totdat het apparaat wordt ondergedompeld. Sluit het deksel van de container en schud voorzichtig NAT alle oppervlakken binnen met ethanol. Zorg ervoor dat de wortel groei kamer van het EcoFAB-apparaat is gevuld met ethanol, met zeer weinig of geen lucht bubbels.
- Na een incubatieperiode van 30 minuten bij kamertemperatuur, giet af 70% ethanol en herhaal de incubatie met 100% ethanol voor 5 min.
- Afvoer uit ethanol en Incubeer de gesteriliseerde EcoFAB voor 16 h in een laminaire flow-kap om het volledig droog. Indien beschikbaar, steriliseren het systeem door te draaien op de UV licht binnen kap voor 1 h.
Let op: Draag geschikte PPE bij het werken met UV licht. - De gesteriliseerde EcoFABs opslaan in een steriele kap of gesteriliseerde met autoclaaf zakken voor toekomstig gebruik.
4. EcoFABs met LED groeien verlichting (Figuur 5)
- Koppelen van de LED strips op EcoFAB containers
- De locaties op de EcoFAB container voor 9 LED clips markeren. Beginnen met de eerste clip 120 mm omhoog vanaf de onderkant van de container langs een rand (figuur 5A), en overgaan tot het mark clip locaties in een spiraal rond de container, met elke volgende clip daalt van 10 mm. Een spiraal van 9 clips waarmee een 1 m LED-strip doorloopt rondom de container tweemaal.
- Hete lijm een clip LED aan elk gemarkeerd positie door het toevoegen van twee wat schar betreft hete lijm op de container, afgestemd op de positie van de clips montagegaten. Druk op de clip gaten in deze twee wat schar betreft van lijm, voeg dan een schar van lijm op de top van de gaten. Herhaal de procedure voor alle clips 9 clips vormen een spiraal (figuur 5B).
Let op: Draag handschoenen en andere PPE bij het werken met hete lijm om brandwonden. - Draad door de clips in een spiraalvorm, de LED-strip met LEDs geconfronteerd in de container. De strip moet cirkel rond tweemaal (figuur 5C).
- Aansluiten van LED strips op de stroomvoorziening met een controller (figuur 5D displays een EcoFAB kamer met verlichte lichten, de programmering van de controller is beschreven in stap 4.3).
Let op: Gevaar voor elektrische schokken: Zorg ervoor dat de voeding wordt losgekoppeld, bij het aansluiten van de draden.- De positieve en negatieve terminals van de voeding verbinden met de "INPUT: V +" en "INPUT: V-" terminals van de controller met behulp van 2-draads kabel (5E cijfer geeft een schematische tekening van de controller-instellingen).
- De negatieve lood uit het blote uiteinde van een vrouw-naar-bare kabel verbinding te maken met één kanaal van de "OUTPUT" op de controller.
Opmerking: Er zijn vijf kanalen op de domeincontroller die wordt gebruikt in dit protocol, zodat op annuleerteken steun tot aan vijf 1 m LED strips. - Alle positieve leads van de kabels verbinden met een compacte splicing connector (als er meerdere kanalen nodig zijn), en vervolgens deze connector link naar de "OUTPUT V +" terminal van de controleur.
- Sluit elke LED-strip op de vrouwelijke uiteinde van de kabels, zodat elke LED heeft een eigen kanaal worden gecontroleerd. Indien gewenst, gebruik vrouw-naar-man kabels uit te breiden het bereik.
- Programma van de controller voor een gewenste lichte cyclus volgens de instructies van de fabrikant,
5. het kweken van planten in EcoFABs
- Zaad sterilisatie en de kiemkracht
Opmerking: De zaad-sterilisatie en alle volgende stappen met zaailingen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Het sterilisatieproces hieronder besproken is geschikt om de zaden van Arabidopsis thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyonen Panicum miliaceum. Panicum miliaceum zaden moeten worden opgeschort in 60% zwavelzuur gedurende 1 uur voordat het sterilisatieproces. Het wordt geadviseerd om te bereiden 1-2 zaden per EcoFAB apparaat, gezien de kieming en de homogeniteit van de kiemkracht.- Geniet van de zaden in 70% ethanol gedurende 2 minuten.
- Verwijderen van ethanol met een pipet, en spoel de zaden met steriel water drie keer.
- Laat de zaden in 10% bleekwater oplossing gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bleekwater oplossing, en de zaden met steriel water drie keer grondig te wassen.
- Steriel water toevoegen aan de zaden en de buis van de microcentrifuge in een koelkast 4 ° C Incubeer gedurende 7 dagen.
- Gelijkmatig verspreid de zaden op 0.5 Murashige & Skoog (MS) medium met 0,6% phytagel en verzegel de platen met schoon tape.
- Groeien de planten tot een lengte van de wortel van ongeveer 5 mm voor de transfer naar EcoFABs (figuur 6A). Voor de experimenten gepresenteerd hier, het toepassen van een 16 h licht/8 h donkere verlichting regime in een kamer van 22 ° C groei en Incubeer de planten 2-7 d voordat de overdracht naar EcoFAB (2 dagen voor Avena barbata en Brachypodium distachyon, 7 dagen voor Arabidopsis thaliana en Panicum miliaceum).
- Overdracht van zaailingen in EcoFABs met vloeistof (Figuur 6)
- Met behulp van een steriele injectiespuit of de micropipet, spoel de root kamer van een EcoFAB-apparaat met steriel water voor drie keer, en vul vervolgens de wortel kamer met het groeimedium van belang, bijvoorbeeld 0.5 MS medium (figuur 6B, stap 5.1.6).
- Steek voorzichtig een enkele zaailing in het reservoir van de plant van het EcoFAB apparaat (Figuur 6 c).
Opmerking: De hoofdmap moet worden volledig ondergedompeld in de root kamer, met de shoot steken uit het reservoir. - Voeg 3 mL steriel water in de container, het vermijden van het EcoFAB-apparaat. Dit zal verhogen van de luchtvochtigheid en vermindering van de verdamping van het medium van de wortel kamer.
- Sluit de container en afdichting van de deksel met schoon tape (figuur 6D).
- Plaats de EcoFAB in een plant incubator, of gebruik maken van de EcoFAB verlichting systeem in een gecontroleerde temperatuur-omgeving geschikt zijn voor de groei van de respectieve plant (stap 4). Voor deze studie stelt de kamer tot 24 ° C.
- Controleert regelmatig de EcoFAB te vullen groei media binnen de wortel groei kamer en voeg water toe tot de container. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden.
Opmerking: Voor de eerste groeifasen van de plant, bijvullen van de wortel groei kamer is nodig elke 5 tot 7 dagen. Voor de latere groeistadia is een navulling nodig om 2 tot 3 dagen. Indien gewenst, gebruik een spuit of Pipetteer wortel afgescheiden oplossing van de wortel groei kamers in een buis van microcentrifuge verzamelen en opslaan in een vriezer-80 ° C; ook het imago van de morfologie van de wortel met een gel imager of Microscoop.
- Overdracht van zaailingen in EcoFABs met vaste substraten
- Gebruik van de kamers van de wortel vervaardigd met een 5:1 mengsel van elastomeer basis te genezen agent als met behulp van een set van aangepaste klemmen te koppelen aan een microscoopglaasje (Figuur 3 K, Figuur 4); of kies dat een PDMS laag gemaakt van 30: 1 uit basis om te genezen van agent mengsel als PDMS lagen op dia's direct (zoals beschreven in stap 2.2) vast te houden.
- Steriliseren de EcoFAB kamers, zoals beschreven in stap 3.
- Zorgvuldig gesteriliseerde grond/zand toevoegen in de root kamer, zet de laag PDMS ondersteboven en het substraat toevoegen aan de wortel kamer. Vermijd alle deeltjes val op het gebied dat in contact met het microscoopglaasje, zijn zal, aangezien dit hechting verminderen zal.
- Plaats de microscoopglaasje bovenop de PDMS laag en druk stevig op alle van de randen. Zorgvuldig spiegelen het EcoFAB apparaat zodat geen grond/zand valt uit het reservoir openen.
Opmerking: Gebruik een aangepaste klem voor EcoFAB apparaten gemaakt van een 5:1 basis om te genezen van agent mengsel, teneinde het zegel. - Stromen vloeistof of water via het kanaal van het inlaat of uitlaat van het EcoFAB-apparaat, en breng een zaailing in het reservoir van de plant, zoals beschreven in stap 3.3.
- Het toevoegen van microben in EcoFABs
- Een microbiële kolonie overbrengen naar een incubatie buis met 8 mL van de pond-Bouillon, en het groeien naar OD 0,5 (ongeveer 12 h).
- Breng de oplossing van de cultuur in een centrifugebuis 15 mL en Centrifugeer het bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 3000 x g tot pellet microben.
- Verwijder het supernatant en voeg 8 mL plant groeimedium gebruikt in het doel EcoFAB. Opschorten van de pellet van microben en de buis bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 3000 x g centrifugeren.
- Herhaal stap 5.4.3. tweemaal volledig elke LB nutriënten om sporen te verwijderen.
- Plant groeimedium toevoegen aan de gewassen microbe pellet totdat de optische dichtheid ongeveer 0,5 op 600 is nm.
- Voeg 20 µL van de microbe-oplossing in de root kamer via het stopcontact van de EcoFAB. De stammen die in deze publicatie gebruikte reisde naar plant wortels binnen 2-3 dagen, en gestarte kolonisatie wortel oppervlakken.
- Voor gemanipuleerde chemiluminescentie, zorg ervoor dat de inductor (1 mM IPTG) in plant groeimedium ertoe luciferase expressie.
6. metaboliet profilering van exsudaat van de wortel van EcoFABs
- Bereiding van de monsters voor LC/MS gebaseerd metabolomica analyse
- Plaats de microcentrifuge buizen met exsudaat van de wortel van EcoFABs in een lyophilizer verzameld, en draai op de lyophilizer om al het water van de buizen.
- Voeg 300 µL van LC-MS rang methanol in elke buis en bewerk ultrasone trillingen ten voor 30 min.
Let op: Draag PPE bij het werken met methanol. - Plaats de buizen in een centrifuge en centrifugeer ze bij 3000 x g gedurende 5 min.
- Breng de bovenstaande oplossingen in nieuwe microcentrifuge buizen en verdampen van methanol in een vacuüm concentrator.
- Voeg 150 µL van methanol met 1 mM LC-MS interne standaarden in elke buis en Incubeer de buizen in een koelkast 4 ° C voor 12 h.
- Centrifugeer de buizen bij 3000 x g gedurende 5 min, en breng het supernatant in 0,22 µm filter buizen.
- Centrifugeer de filter-buizen, en breng de gefilterde oplossingen in 2,0 mL LC/MS flesjes met 200 µL van tussenvoegsels.
- Plaats de flesjes binnen een rack LC/MS, en laden van het rek in de LC/MS auto-sampler.
- Data-analyse
- Krijg een toegang van metaboliet Atlas en aangepaste Python scripts26 of gebruik van de software van de analyse van andere gegevens.
- Identificeren van metabolieten gebaseerd op m /z -waarden, retentietijd en samengestelde fragmentatie patronen met behulp van een bibliotheek van metaboliet normen. 27
7. massa spectroscopische beeldvorming van plantenwortels in EcoFABs (Figuur 7)
NB: EcoFAB apparaten die zijn gemaakt van een 5:1-elastomeer basis om te genezen van agent mengsel met aangepaste klemmen (figuur 7A) worden gebruikt voor root stempelen op nanostructuur-initiator massaspectrometrie (NIMS) chips,28,29,30 sinds PDMS lagen omgekeerd kunnen worden gebonden aan de oppervlakken van NIMS chips.
- Steriliseren een NIMS chip oppervlak met UV-licht gedurende 1 uur.
- Kies een EcoFAB met een groeiende plant uit de incubator, en breng dit in een steriele kap.
- Open de container van de EcoFAB en verwijder de bovenste plaat van de klem.
- Til de PDMS laag samen met de plant binnen, en zorgvuldig hechten de PDMS laag met de plant op een chip van de NIMS (figuur 7BD, E).
Opmerking: Zodra de wortel het oppervlak van de chip NIMS raakt, het moet niet worden verplaatst. Hiermee voorkomt u dat "smeren" van de hoofdmap metabolieten. - Druk zachtjes naar beneden op de wortels door de PDMS laag totdat de wortels volledig contact met het oppervlak van de NIMS. Laat de wortels op het oppervlak van de NIMS voor 20 min.
- Til van de PDMS laag met inbegrip van de plant uit de NIMS chip, weer vermijden de hoofdmap verplaatsen over het oppervlak van de NIMS. Keren de plant naar de klem, indien gewenst.
- Bevestig de NIMS chip op een aangepaste MALDI-bord en laadt de plaat in een MALDI spectrometer voor massa imaging (Figuur 7 c).
- OpenMSI programma voor het genereren van het imago van de NIMS van wortel metabolieten (figuur 7D-G)31gebruiken.
Representative Results
Elke EcoFAB-systeem omvat een EcoFAB-apparaat en een plant transparant plastic container formaat. Een EcoFAB apparaat heeft een reservoir van de plant, een root groei kamer een 1.6 mm stroom inlaat en een uitlaatklep van 1,6 mm voor standaard EcoFAB apparaat (figuur 2D & Figuur 3 H) of een 10 mm uitlaat voor wide-outlet EcoFAB apparaat (figuur 2F & figuur 3I ). Het reservoir van de plant is ontworpen in een trapezium vorm die een top opening van 6 mm en 3 mm onderste opening heeft, en dit ontwerp vermindert de kans op stroom lekken tijdens vloeibare injectie en zorgt er ook voor genoeg ruimte voor de plantengroei. De wortel groei kamer keurt een ovale vorm met 2 mm diepte worden uitgerust met veel model planten wortelsystemen, zoals aangegeven in figuur 2C en E. Zowel inlaat en uitlaat kanalen van een standaard EcoFAB-apparaat kunnen worden aangesloten met PTFE-buis dus nutriënten oplossingen in de wortel groei kamer stromen kunnen zonder het openen van de container EcoFAB. De wide-outlet EcoFAB apparaat sterk vermindert de stromingsweerstand van het stopcontact en wordt bij voorkeur gebruikt bij het kweken van planten met dikke wortel systemen of periodiek verzamelen wortel exsudaat nadat complexe wortel systemen zijn ontleend aan planten.
Het gieten mallen voor het fabriceren van PDMS lagen van EcoFAB apparaten worden gemaakt in een ontwerpsoftware en vervolgens 3D afgedrukt in starre ondoorzichtige fotopolymeren delen bevinden, zoals blijkt uit Figuur 2 en Figuur 3. Planten binnen EcoFABs is direct waarneembaar met een microscoop met behulp van een lange werk afstand, zorgen voor dat de steriele groeien milieu (figuur 8A, Aanvullende bestand 1). EcoFAB apparaten met planten kunnen ook passen op een hoge-resolutie Microscoop podium, waardoor hogere resolutie beeldvorming van plant-microbe interacties (figuur 8B, Aanvullende bestand 2). Steriliteit wordt niet gehandhaafd in deze omgeving, en met een hoge resolutie beeldvorming is dus alleen geschikt voor eindpunt metingen.
EcoFABs zijn ontworpen om systematische bestudering van planten, zoals hun morfologie, stofwisseling en microbiële gemeenschappen op hun verschillende groeifasen over hun levenscyclus mogelijk te maken. Hier, werden EcoFABs onderzocht als een algemene platform te bestuderen van een verscheidenheid van plantensoorten. Figuur 8C -E Toon 7 - dagen oude Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonen Panicum miliaceum groeien in EcoFABs. Alle drie de productievestigingen bleken te groeien in de EcoFAB goed voor meer dan één maand. Zowel de dicot, Arabidopsis thaliana en de monocot, bleken Brachypodium distachyon te leven tot aan de etappes van hun voortplanting in de EcoFABs.
De omkeerbare afdichtingssysteem maakt het gebruik van vaste substraten (bv., bodem) binnen de EcoFABs (stap 2.2). Deze omkeerbare afdichten benadering kunt laden van vaste substraten in wortel groei kamers en ook kunt sample collectie van bepaalde regio's van de wortel rhizospheres. Figuur 8F -H is een groep van 14 - dagen oude Brachypodium distachyon groeien in hydrocultuur medium, evenals zand en grond aangevuld met hydrocultuur medium (zand) en water (bodem) weergeven. De dunne solide substraat laag in wortel groei kamers kunt licht door te dringen via voor microscopische beeldvorming van het wortelstelsel.
Root morfologie is gedefinieerd als ruimtelijke configuratie en distributie van een wortelgestel van de plant en is goedgekeurd als een essentiële fysiologie reactie op uiteenlopende groei omgevingen, zoals een nutriënt of water beschikbaarheid32,33, 34. EcoFABs biedt een handige aanpak van het bestuderen van de morfologie van de plant na verloop van tijd of onder verschillende omstandigheden van de nutriënten. Figuur 9A-F weergeven een voorbeeld van het gebruik van EcoFABs voor het bijhouden van de wortel morphologies van Brachypodium distachyon in de eerste drie weken. Een zaailing Brachypodium distachyon overgeplaatst in het EcoFAB-apparaat, en de root-structuur werd opgenomen door een camera in een BIO-RAD gel imager. Beeld processing programma, zoals afbeelding J, python en matlab, kan verder worden toegepast om te kwantificeren van de veranderingen van de wortel morphologies na verloop van tijd of in verschillende middellange omgevingen. De kwantificering van totale wortel gebied in de loop van drie weken toonde een geleidelijke verhoging van het vroege stadium (< 1 week) gevolgd door een lineaire groeitrend volgen tot het einde van drie weken, zoals weergegeven in figuur 9G.
Een primaire motivatie voor de bouw van de EcoFAB is te onderzoeken plant-microbe interacties. Zoals beschreven in stap 5.4, worden micro-organismen overgebracht naar de wortel groei kamers van EcoFAB apparaten via het inlaat kanaal. Figuur 10 laat zien, een EcoFAB met Pseudomonas simea (voorheenfluorescens) WCS417 (WCS417), een groei van de planten bevordering van rhizobacteria met chemiluminescentie etiketten, werd toegevoegd in het wortelstelsel van de planten met een concentratie van 106 cellen per plant. Het signaal van de WCS417 werd ontdekt met een gel imager, die een verschillende ruimtelijke verdeling van WCS417 microben in wortel groei chambers aangegeven. In beide MS opgietvloeistof die met en zonder het zand solide substraat, WCS417 microben de oppervlakken van het hele wortelstelsel gekoloniseerd met microben geconcentreerd rond de wortel tip gebieden, mogelijk als gevolg van de actieve nutriënt productie van wortel tips (figuur 10G & H)35. Aan de andere kant, de microben van WCS417 in bodem substraat opgebouwd rond de plant reservoir regio in plaats van wortel tips (Figuur 10ik). Zoals de microben zijn toegevoegd via het stopcontact-kanaal, de microben waren ook in staat om te bewegen in het substraat van de bodem, maar deed niet ophopen in de hoofdmap, zoals waargenomen in vloeistof met of zonder zand. Dit kan erop wijzen dat de bodem een voldoende voedingsstoffen bron is, en de microben gemigreerd naar het reservoir van de plant voor optimale ademhaling voorwaarden.
Om te studeren metaboliet profilering van exsudaat van de wortel van de plant als metaboliet opname en vrijwaart van plant-microbe interacties, de oplossingen van de afgescheiden van de wortel groei kamers was verzameld over de verschillende groeistadia van planten in de EcoFABs. Zoals beschreven in stap 6, worden afgescheiden monsters vervolgens uitgepakt voor LC-MS-analyse. Met deze methode een scala van metabolieten uitstralen door de plant en verbruikt door de microben werd gedetecteerd en de verwante metaboliet profilering van exsudaat met en zonder microben kolonisatie van de wortel wordt momenteel onderzocht.
Figuur 1: het EcoFAB werkstroom. Planten zijn ontkiemd op plaat, en overgedragen aan de gesteriliseerde EcoFAB, microben kunnen worden toegevoegd. Niet-destructieve bemonstering: exsudaat van de wortel kunnen worden bemonsterd beeld en morfologie van de wortel kan worden gevisualiseerd. Destructieve bemonstering kunt analyse van microbe, wortel en schieten parameters in detail.
Figuur 2: de onderdelen van 3D afgedrukt mallen voor EcoFAB apparaat fabrikatie. (A) boven- en schuin uitzicht op een casting-frame. (B) boven- en schuin uitzicht op een invoegen. (C) boven en schuin uitzicht op basis van de standaard schimmel. (E) boven- en gekanteld weergaven voor een wide-outlet schimmel base. (D, F) Geassembleerde mallen voor het fabriceren van standaard en wide-outlet EcoFAB apparaten, respectievelijk. De ovale afmetingen zijn 51 x 34 mm voor kleine EcoFAB schimmel en 76 x 62 mm voor grote EcoFAB schimmel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: EcoFAB apparaat fabricage. (A) gieten het mengsel van elastomeer basis en genezen agent in de mal. (B) Verwarming de mal met mengsel bij 85 ° C gedurende 4 h. (C) het inzetstuk verwijderen van de schimmel. (D) het scheiden van het PDMS van het gieten frame. (E) duwen de mal base uit het frame gieten. (F) het gebruikmaken van een mes te scheiden van het PDMS van de mal langs de randen. (G) peeling de PDMS laag langzaam uit de mal base. (H) Poking gaten voor zowel de inlaat en de uitlaat kanalen van de standaard PDMS laag. (I) prikken een gat voor het inlaat kanaal van de wide-outlet PDMS laag. (J) de PDMS laag (gemaakt van een 15:1-elastomeer basis om te genezen van agent mengsel) een microscoopglaasje gespoeld en overgebracht naar een plasma reiniger voor hechting. De klemmen van de (K) gebruiken om de PDMS laag (gemaakt van een 5:1 elastomeer base om te genezen van agent mengsel) op een microscoopglaasje. (L) op te drukken de PDMS laag (gemaakt van een 30: 1 uit elastomeer base om te genezen van agent mengsel) direct op een microscoopglaasje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: het ontwerp van aangepaste klemmen. (A) boven- en schuin uitzicht op een top Klemplaat. (B) boven- en schuin uitzicht op een bodem Klemplaat. (C) boven en schuin uitzicht op geassembleerde klem met vier sets van hex cap schroeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: installeren van LED verlichting groeien. (A) markering uit de locaties voor 9 LED clips in een spiraal rond de container EcoFAB. (B) LED clips toegevoegd aan de container EcoFAB. (C) threading een LED-strip via deze clips. (D) verbinden met de LED-strip een controller wired met een 24V-voeding. (E) het schema van draad verbindingen naar de domeincontroller. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: zaailingen overgeplaatst naar EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon planten gekweekt voor 2 dagen op een 0.5 MS plaat. (B) de wortel kamer te vullen met plant groeimedium. (C) met behulp van een pincet schuif voorzichtig de hoofdmap in het reservoir van de plant. (D) het afdichten van de EcoFAB container met schoon tape, na toevoeging van 3 mL water aan de onderkant van de container. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: NIMS beeldvorming van plant wortels in EcoFABs. (A) een Brachypodium distachyon groeien in een steriele EcoFAB. (B) bevestigen de PDMS laag met de plant op een chip van de NIMS voor 20 min. (C) werken met koperen tape te koppelen van de NIMS chip op een aangepaste MALDI-bord, en het laden in een massaspectrometer MALDI. (D-G) een 7 - dagen oude en een 20 - dagen oude Brachypodium distachyon plant gebruikt voor NIMS imaging (D, E) en de bijbehorende beelden van de NIMS (F, G). De overheersende ionen waren gemarkeerd in rood, groen en blauw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: de algemene toepassingen van EcoFABs. (A) direct vastleggen wortelgroei van Brachypodium distachyon in een EcoFAB met een lange werk afstand Microscoop setup. (B) direct observeren wortel-microbe interacties met een hoge resolutie Microscoop setup. Panicum miliaceum (E) op 0.5 MS hydrocultuur medium (F-H) 14 - dagen oude Brachypodium distachyon gegroeid in 0.5 MS hydrocultuur (F), in zand (G) en de bodem (H), (C-E) 7 - dagen oude Arabidopsis thaliana (C) en Brachypodium distachyon (D) het substraat wordt geleverd met 0.5 MS medium en water, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: met behulp van EcoFABs te bestuderen van de morfologie van de root. (A-F) Root ontwikkeling van Brachypodium distachyon groeien in EcoFABs gevuld met 0.5 MS medium tijdens de eerste drie weken: (A) 2 dagen, (B) 4 dagen, (C) 7 dagen, (D) 11 dagen, (E) 14 dagen, (F) 21 dagen van de groei. (G) de gemiddelde wortel oppervlakten werden geraamd door ImageJ software. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: met behulp van EcoFABs te bestuderen van wortel-microbe interacties. (A, B, C) Een groep van 15 - dagen oude Brachypodium distachyon koloniseren met Pseudomonas fluorescens WCS417 in verschillende vormen van media-MS vloeibare oplossing, zand en grond substraten. (D, E, F) Helder veld foto's van hun wortelstelsel. (G, H, I) De overeenkomstige chemiluminescentie beelden van deze wortelstelsel na 14 dagen co teelt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1. Met behulp van EcoFAB te vangen wortelgroei. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestand 2. Met behulp van EcoFAB te vangen wortel-microben interacties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De protocollen gemeld hier voor het gebruik van ecosysteem fabricage maken dat ecofabs voorziet in communautaire middelen systematische plant biologie studies in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Voorschotten in 3D printen bieden breed toegankelijke technologieën voor bouw en iteratief verfijnen EcoFAB ontwerpen. De wortel kamer hier gepresenteerd blijkt te zijn geschikt voor imaging microscopie en onderhouden van steriliteit, gecontroleerde toevoeging van microben te onderzoeken plant-microbe interacties inschakelen. Het platform van EcoFAB is compatibel met verschillende plantensoorten. Het is belangrijk om te erkennen van de fysiologische effecten van het kweken van de planten binnen de smalle root kamer zodanig zijn dat bijkomende experimenten dient te generaliseren van bevindingen aan planten die groeien in een natuurlijke omgeving.
Het gebruik van steriele kamers en LED licht van groeien in staat stelt het onderzoek van de effecten van verschillende licht omstandigheden, met inbegrip van golflengte, intensiteit en duur, op plantengroei en bijbehorende fysiologische parameters in parallel. Omkeerbare hechting wortel kamers staan het gebruik van vaste substraten evenals te verzamelen ruimtelijk solide monsters voor biochemische en genetische analyse. De toepassingen van solide substraten, zoals bodem, zand en kwarts kralen, bieden de mogelijkheid van het gebruik van EcoFABs voor de bouw van meer ecologisch relevante laboratorium ecosystemen. Echter verfijnen alle systemen hier gepresenteerde gebruik verzadigde vloeistof (hydrocultuur culturen) die niet een accurate weerspiegeling zijn van de meeste bodems en het is belangrijk om te verder deze ontwerpen om luchtzakken binnen de bodem zodat zij beter vertegenwoordigen natuurlijke bodems.
Het gebruik van zowel eenvoudige camera's en microscopen wordt beschreven aan de ontwikkeling van de morfologie van images wortelsysteem op beide bulk op cellulair niveau. Deze geschiktheid voor toezicht wortel morfologie beeldvorming en kwantificering zal wellicht nuttig voor het begrijpen van de regelgevende mechanismen van plant-fysiologische en moleculaire signalen veroorzaakt door plant genotypische aanpassingen aan voorwaarden van de groei. Een beperking voor de studie van fysiologische wortel ontwikkeling is echter de huidige horizontale plaatsing van het EcoFAB-apparaat. In een natuurlijke omgeving leidt de wortels gravitropic reactie tot een overwegend verticale ontwikkeling van het wortelsysteem. Dus, het horizontale systeem gepresenteerd hier waarschijnlijk verschilt in sommige factoren van een natuurlijke omgeving, en de fabricage van EcoFAB systemen met verticale plaatsing van de wortel kamer is een wenselijk doel voor toekomstige versies van de EcoFAB. Hoewel de huidige EcoFAB apparaten horizontaal geplaatst worden, is de analyse van root morfologie parameters in verschillende omstandigheden, of in antwoord op de microben, mogelijk. Hoge resolutie beeldvorming kan worden toegepast om vast te leggen van de wortel kolonisatie dynamiek van één isolaten of gemeenschappen, het verstrekken van informatie over welke plant delen in verschillende voedingsstoffen voldoende en gebrekkige omstandigheden zijn gekoloniseerd. Verwacht wordt dat dergelijke studies belangrijke nieuwe inzichten in hoe plant microbiomes worden geassembleerd, en hoe deze dynamiek veranderen na verloop van tijd zal opleveren, bijvoorbeeld als de wortels te ontwikkelen.
Microfluidic apparaten inschakelen beeldvorming van zeer jonge planten, en meestal de hoeveelheid metabolieten verzameld is niet voldoende voor LCMS analyse. Bodem-gebaseerde systemen, zoals rhizotrons, geven de beeldvorming van de morfologie van de wortel of de planten worden omgezet met chemiluminescentie construct (Glo-root) of met NMR gebaseerde methoden33,34. Metaboliet extracties uit deze systemen zijn tijdrovend vanwege grote omvang van de monsters. EcoFABs zijn een combinatie van beide: de fabricage is vergelijkbaar met de microfluidic apparaten. EcoFABs werden ontworpen om eenvoudig en goedkoop te reproduceren, maar de grootte van de kamer kan worden aangepast om te groeien planten met kleine of grote wortelsystemen, tot hun reproductieve fasen. Gelijktijdige opmerkingen van wortel morfologie veranderingen en afscheiding van de hoofdmap zijn mogelijk. Het systeem is steriele, gecontroleerde toevoeging van specifieke microben inschakelen.
EcoFABs zijn ontworpen om gecontroleerde invoering en monsterneming van microben en metabolieten. Specifiek, monsters verzameld uit wortel groei chambers blijken te zijn voldoende voor massa spectroscopische metaboliet profileren. De integratie van massaspectrometrie beeldvorming (bijv., NIMS techniek hier gepresenteerd) zorgt voor een niet-destructieve manier van het bestuderen van de ruimtelijke distributies metaboliet van wortelstelsel. Deze techniek zal wellicht nuttig in de toekomst stabiele isotoop tracering experimenten en toewijzing microbiële localization voor specifieke metabolieten36. Terwijl dit protocol is gericht op één isolaten, kan hetzelfde ontwerp zeker worden gebruikt voor meer complexe Gemeenschappen. De monster volumes en biomassa binnen de EcoFABs zijn waarschijnlijk meer dan voldoende voor verdere integratie met DNA sequencing technologieën, die zal moeten karakterisering en controle van de microbiële Gemeenschap structuur en gen-expressie.
Kortom, dit protocol gegevens de fabricage van laboratorium ecosystemen ontworpen voor het onderzoek van plant-microbe interacties, met nadruk op eenvoudige en toegankelijke methoden die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd en uitgebreid door onderzoekers rond de wereld. Huidige inspanningen zijn gericht op het aantonen van de reproduceerbaarheid tussen labs en de integratie van een temperatuur controlesysteem zodanig dat elke EcoFAB zal apart hebben geregeld, licht en temperatuur. Een verdere verbetering van het systeem zullen de integratie van geautomatiseerde bemonstering en bijvullen van de kamers van de wortel EcoFAB en de ontwikkeling van reproduceerbare protocollen voor de vaststelling van relevante plant microbiomes binnen EcoFABs.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door laboratorium gericht onderzoek en ontwikkeling (LDRD) programma van het Lawrence Berkeley National Laboratory ondersteund door het Office of Science, van het US Department of Energy onder Contract nr. DE-AC02-05CH11231 en een award DE-SC0014079 van het VS departement van energie Office of Science aan UC Berkeley. Werk op de moleculaire lettergieterij steunde onder VS departement van energie Contract nr. DE-AC02-05CH11231. Wij danken ook Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen en Benjamin J. Cole bij het Lawrence Berkeley National Laboratory voor al hun hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
- Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
- Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
- Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
- Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
- Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
- van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
- Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
- Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
- Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
- Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
- Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
- Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
- Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
- Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
- Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
- Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
- Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
- Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
- López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
- Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
- Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
- Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
- Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).
