Este artículo describe protocolos detallados para la fabricación de ecosistema de dispositivos (EcoFABs) que permiten a los estudios de las plantas y las interacciones planta-microorganismo en condiciones muy controladas de laboratorio.
Interacciones Beneficiosas Planta-Microogranismo ofrecen una solución biológica sostenible con potencial para impulsar la producción de alimentos y bioenergía de bajos insumos. Una mejor comprensión mecanicista de estas interacciones planta-microorganismo complejo serán crucial para mejorar la producción de planta como ecológica así como desempeño básico estudia investigar interacciones planta-microorganismo suelo. Aquí, se presenta una descripción detallada para la fabricación de ecosistema, usando tecnologías de impresión 3D ampliamente disponibles, crear hábitats controladas de laboratorio (EcoFABs) para el estudio de mecanismos de interacciones planta-microorganismo en específico ambiental condiciones. Dos tamaños de EcoFABs se describen que son adecuados para la investigación de las interacciones microbianas con varias especies de plantas, como Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyony Panicum virgatum. Estos dispositivos a través de flujo permiten control manipulación y muestreo de raíz microbiomes, química de la raíz así como proyección de imagen de la morfología de la raíz y localización microbiana. Este protocolo incluye los detalles para mantener las condiciones de esterilidad dentro de EcoFABs y montaje independiente sistemas de iluminación LED en EcoFABs. Métodos detallados para la adición de diferentes formas de medios de comunicación, incluyendo suelos, arena y medios de cultivo líquidos junto a la caracterización de estos sistemas usando proyección de imagen y metabolómica se describe. Juntos, estos sistemas permiten la investigación dinámica y detallada de la planta y consorcios microbianos planta incluyendo la manipulación de la composición del microbioma (incluyendo mutantes), el monitoreo del crecimiento de la planta, morfología de la raíz, composición del exudado, y localización microbiana bajo condiciones ambientales controladas. Esperamos que estos protocolos detallados servirá como un importante punto de partida para otros investigadores, idealmente, ayudar a crear sistemas experimentales estandarizados para la investigación de interacciones planta-microorganismo.
La aplicación de microbios beneficiosos de la planta en la agricultura ofrece gran potencial para incrementar la producción de biocombustibles para proporcionar para una creciente población1,2,3,4y sostenible de alimentos. Una cantidad significativa de trabajo apoya la importancia de la planta microbiomes en absorción de nutrientes de la planta, tolerancia a las tensiones y la resistencia a la enfermedad5,6,7,8. Sin embargo, es difícil investigar los mecanismos de las interacciones planta-microorganismo en los ecosistemas de campo debido a la complejidad e irreproductibilidad asociada y la incapacidad para controlar precisamente la composición del microbioma y genética (por ej., usando mutantes microbianos)4,9,10.
Una estrategia es construir ecosistemas modelo simplificado para permitir controlados, experimentos de laboratorio repetidos investigar interacciones planta-microorganismo para generar ideas que pueden analizarse más en el campo10,11, 12. Este concepto se basa en los enfoques tradicionales de uso de las plantas cultivadas en macetas llenas de tierra o en placas de agar dentro de invernaderos o incubadoras13. Aunque estos probablemente serán siendo el más ampliamente utilizado enfoques, carecen de la capacidad para precisamente controlar y manipular entornos de crecimiento de la planta. Para estos fines, rhizoboxes y rhizotrons representan una gran mejora en la capacidad de estudiar procesos subterránea14,15y primeros protocolos fueron publicados para el análisis de metabolitos de la rizosfera en el suelo16. Más recientemente, para permitir el análisis de alto rendimiento, dispositivos microfluídicos avanzado13,17 como Chip de planta18,19, RootArray20RootChip21, han sido desarrollado como herramientas eficaces para el fenotipado de la planta con resolución espacial de la escala del micrómetro para supervisar las primeras etapas de crecimiento de la planta pequeña modelo Arabidopsis thaliana en medio líquido. Una plataforma de proyección de imagen de dos capas fue descrita recientemente, que permite la proyección de imagen de pelo de la raíz de Arabidopsis thaliana en plántula con una plataforma de microfluidos22.
Aquí, protocolos detallados para la construcción de aparatos de laboratorio controlados (EcoFABs) son siempre, para el estudio de las interacciones microbio de planta y mostrar que pueden ser utilizados para el estudio de diversas plantas como Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, la importancia ecológica Avena Silvestre Avena barbata y los cultivos de bioenergía Panicum virgatum (virgatum). EcoFAB es una plataforma de crecimiento de la planta estéril que incluye dos componentes principales: el dispositivo de EcoFAB y envase transparente estéril tamaño de planta. Capas de EcoFAB dispositivo está hecho de un polidimetilsiloxano (PDMS), proceso que implica la fundición PDMS de fabricación de un molde plástico impreso 3D y capas PDMS en portaobjetos usando métodos anteriormente la vinculación registrados24,25 . Los procedimientos detallados de EcoFAB flujo de trabajo, tales como fabricación de dispositivo, esterilización, germinación de la semilla, trasplante de la plántula, microbio inoculación/cocultivation, preparación de muestras y análisis, se describen en el presente Protocolo (figura 1). Otras modificaciones del flujo de trabajo básico se describen, incluyendo la instalación de la computadora controlada llevó las luces grow y la utilización de sustratos sólidos. La utilización de técnicas para investigar la morfología de la raíz de imagen cambia, la colonización microbiana de las raíces, y la proyección de imagen espectroscópica masa de exudados de la raíz se describen. Esperamos que el diseño simple, barato, basado en materiales fácilmente disponibles, así como los protocolos detallados presentados aquí, convertirá la plataforma EcoFAB en un recurso comunitario, estandarizar los estudios de laboratorio planta microbioma.
Los protocolos registrados aquí para que uso de fabricación de ecosistema para crear que ecofabs proporciona recursos comunitarios para planta sistemática estudios de biología en condiciones muy controladas de laboratorio. Avances en la impresión 3D proporcionan tecnologías ampliamente accesibles para construir y refinar iterativamente EcoFAB diseños. La cámara de raíz presentada aquí se encuentra bien adaptada para la microscopia de la proyección de imagen y mantenimiento de esterilidad, permitiendo la adición controlada de microbios para investigar interacciones planta-microorganismo. La plataforma de EcoFAB es compatible con varias especies de plantas. Es importante reconocer los efectos fisiológicos de las plantas dentro de la cámara de raíz estrecha de crecimiento tal que experimentos adicionales se requerirá para generalizar los resultados a plantas que crecen en ambientes naturales.
El uso de cámaras estériles y LED crece la luz permite la investigación de los efectos de diversas condiciones de luz, incluyendo longitud de onda, intensidad y duración, el crecimiento de las plantas y los parámetros fisiológicos relacionados en paralelo. Cámaras de raíz de Unión reversible permiten el uso de sustratos sólidos, así como espacial recoger muestras sólidas para el análisis bioquímico y genético. Las aplicaciones de substratos sólidos, tales como suelos, arena y granos de cuarzo, ofrecen las posibilidades de utilizar EcoFABs para crear ecosistemas de laboratorio más ecológicamente pertinentes. Sin embargo, todos los sistemas presentados aquí uso líquido saturado (cultivos hidropónicos) que no son un reflejo preciso de la mayoría de suelos y será importante seguir perfeccionando estos diseños para mantener bolsas de aire en el suelo que mejor representan suelos naturales.
Se describe el uso de simples cámaras y microscopios para el desarrollo de la morfología del sistema radicular imagen a ambos a granel a niveles celulares. Esta aptitud para la proyección de imagen de morfología raíz monitoreo y cuantificación probablemente será útil para la comprensión de los mecanismos de regulación de señales de planta fisiológica y molecular desencadenadas por adaptaciones genotípicas de planta a las condiciones de crecimiento. Sin embargo, una limitación para el estudio de desarrollo de la raíz fisiológica es la colocación horizontal actual del dispositivo EcoFAB. En ambientes naturales, la respuesta de raíces gravitrópico conduce a un desarrollo predominantemente vertical del sistema radical. Así, el sistema horizontal presentado aquí probablemente difiere en algunos de los factores de un ambiente natural, y la fabricación de sistemas de EcoFAB con colocación vertical de la cámara de la raíz es un objetivo deseable para futuras versiones de EcoFAB. Aunque los dispositivos actuales de EcoFAB se colocan horizontalmente, el análisis de parámetros de morfología de raíz en varias condiciones, o en respuesta a microbios, es posible. Proyección de imagen de alta resolución se puede aplicar para captar la dinámica de colonización de raíces de aislamientos individuales o comunidades, proporcionando información acerca de que las plantas son colonizadas piezas en varias condiciones deficientes y suficientes nutrientes. Se prevé que dichos estudios proporcionen importantes nuevas ideas sobre cómo se construyen planta microbiomes, y cómo estas dinámicas cambian con el tiempo, por ejemplo como las raíces se desarrollan.
Dispositivos microfluídicos permiten proyección de imagen de plantas muy jóvenes, y la cantidad de metabolitos recogidos no es generalmente suficiente para el análisis LCMS. Sistemas basados en tierra, como rhizotrons, permiten la proyección de imagen de la morfología de la raíz cuando las plantas de ambos se transforman con construcción quimioluminiscente (Glo-root) o con métodos de NMR33,34. Extracción de metabolitos de estos sistemas es lentos debido a la gran volumen de muestras. EcoFABs son una combinación de ambas: la fabricación es similar a los dispositivos microfluídicos. EcoFABs fueron diseñados para ser simple y barato de reproducir, pero el tamaño de la cámara puede ajustarse para cultivar plantas con sistema radicular pequeño o grande, hasta sus etapas reproductivas. Observaciones simultáneas de los cambios de morfología de raíz y exudación de la raíz son posibles. El sistema es estéril, lo que permite la adición controlada de microbios específicos.
EcoFABs están diseñados para permitir la introducción controlada y toma de muestras de microbios y metabolitos. En concreto, las muestras recogidas de cámaras de crecimiento de la raíz se encuentran suficiente para perfilar metabolitos masa espectroscópica. La integración de la proyección de imagen de espectrometría de masas (e.g., NIMS técnica presentada aquí) proporciona un enfoque no-destructivo de estudiar la distribución espacial de metabolito de sistemas de la raíz. Esta técnica será útil en el futuro estable isótopo seguimiento experimentos y localización microbiana asignación a metabolitos específicos36. Si bien este protocolo se ha centrado en solo aislados, el mismo diseño puede utilizarse sin duda para comunidades más complejas. Los volúmenes de muestra y la biomasa dentro de la EcoFABs son probablemente más que suficiente para la mayor integración con tecnologías de secuenciación de ADN, que será importante para la caracterización y monitoreo de comunidad microbiana estructura y expresión genética.
En conclusión, este protocolo detalla la fabricación de los ecosistemas de laboratorio diseñado para la investigación de las interacciones planta-microorganismo, con énfasis en los métodos simples y accesibles que puede ser fácilmente implementado y extendido por los investigadores de todo el mundo. Los esfuerzos actuales se dirigen a demostrar la reproducibilidad entre laboratorios y la integración de un sistema de control de temperatura tal que cada EcoFAB independientemente habrá controlado por luz y temperatura. Un avance más del sistema será la integración del muestreo automatizado y llenado de las cámaras de EcoFAB raíz y el desarrollo de protocolos reproducibles para el establecimiento de planta correspondientes microbiomes dentro de EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el programa de laboratorio dirigido investigación y desarrollo (LDRD) del laboratorio nacional de Lawrence Berkeley apoyado por la oficina de ciencia del Departamento de energía estadounidense bajo contrato no. DE-AC02-05CH11231 y un premio DE SC0014079 de los Estados Unidos Departamento de energía oficina de ciencia en Berkeley UC. Trabajo en la fundición Molecular fue financiado en los Estados Unidos Departamento de energía contrato no. DE-AC02-05CH11231. También agradecemos a Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen y Benjamin J. Cole en el laboratorio nacional Lawrence Berkeley por su ayuda.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |