Denna artikel beskriver detaljerat protokoll för ekosystemet tillverkning av enheter (EcoFABs) som möjliggör studier av växter och växt-mikrobinteraktioner i starkt kontrollerad laboratoriemiljö.
Välgörande växt-mikrobinteraktioner erbjuda en hållbar biologiska lösning med potential att öka lågintensivt mat och bioenergi produktionen. En bättre mekanistisk förståelse av dessa komplexa växt-mikrobinteraktioner kommer att vara avgörande för att förbättra växtproduktionen så välpresterande basic ekologiska studier utredande växt-jord-mikrobinteraktioner. Här, presenteras en detaljerad beskrivning för ekosystemet fabrication, med hjälp av allmänt tillgängliga 3D trycktekniker, för att skapa kontrollerad laboratorium livsmiljöer (EcoFABs) för mekanistiska studier av växt-mikrobinteraktioner inom specifika miljö villkor. Två storlekar av EcoFABs beskrivs som är lämpade för utredning av mikrobiell interaktioner med olika växtarter, bland annat Arabidopsis thalianaoch Brachypodium distachyon Panicum virgatum. Enheterna genomflöde medger kontrollerade manipulation och provtagning av roten microbiomes, roten kemi samt imaging av roten morfologi och mikrobiell lokalisering. Detta protokoll innehåller information för att upprätthålla sterila förhållanden inuti EcoFABs och monteringssystem oberoende LED ljus på EcoFABs. Detaljerade metoder för tillägg av olika former av media, inklusive jord, sand, och flytande tillväxtmassmedia kopplat till karakterisering av dessa system som använder imaging och metabolomik beskrivs. Tillsammans, dessa system möjliggör dynamisk och detaljerad utredning av växt och växt-mikrobiella konsortier inklusive manipulering av mikrobiomet sammansättning (inklusive mutanter), övervakning av växternas tillväxt, roten morfologi, exsudat sammansättning, och mikrobiell lokalisering under kontrollerade miljöförhållanden. Vi räknar med att dessa detaljerade protokoll kommer att fungera som en viktig utgångspunkt för andra forskare, idealiskt hjälper att skapa standardiserade experimentella system för att undersöka växt-mikrobinteraktioner.
Tillämpningen av välgörande växt mikrober i jordbruket erbjuder stor potential att öka hållbar mat och biobränsleproduktion att ge för en växande befolkning1,2,3,4. En betydande mängd arbete stöder vikten av växt microbiomes i anläggningen näringsupptag, tolerans mot påfrestningar och motstånd mot sjukdom5,6,7,8. Det är dock svårt att undersöka dessa mekanismer av växt-mikrobinteraktioner i fältet ekosystem på grund av komplexiteten och associerade irreproducibility och oförmåga att kontrollera exakt mikrobiomet sammansättning och genetik (t.ex., med mikrobiell mutanter)4,9,10.
En strategi är att konstruera förenklad modell ekosystem att aktivera kontrollerade, replikerade laborationer undersöker växt-mikrobinteraktioner för att generera insikter som ytterligare kan testas i fält10,11, 12. Detta koncept bygger på traditionella metoder med hjälp av växter som odlas i jord-fyllda krukor eller på agar plattor inom växthus eller inkubatorer13. Även om dessa kommer sannolikt att förbli mest använda metoder, de saknar förmågan att noggrant övervaka och manipulera växt tillväxt miljöer. Att för dessa ändamål, rhizoboxes och rhizotrons representerar en stor förbättring i förmågan att studera under jord processer14,15, och första protokoll publicerades för att analysera odlingsbädden metaboliter i jord16. Mer nyligen, för att aktivera hög genomströmning analys, avancerad mikroflödessystem enheter13,17 som växt Chip18,19och RootArray20RootChip21, har varit utvecklats som effektiva verktyg för växt fenotypning med mikrometer-skala rumslig upplösning att övervaka tillväxten tidigt i liten modell växten Arabidopsis thaliana i vätskeflödet medium. Nyligen beskrevs en två-lagers imaging plattform som möjliggör rotahåret avbildning av Arabidopsis thaliana på fröplanta scenen med en mikroflödessystem plattform22.
Här, tillhandahålls detaljerade protokoll för att konstruera kontrollerade laboratorium enheter (EcoFABs) för att studera växt mikrobinteraktioner och visa att de kan användas för att studera olika växter inklusive Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, den ekologiskt viktiga wild oat Avena barbata, och bioenergi grödan Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB är en steril växt tillväxtplattform som innehåller två huvudsakliga komponenter: EcoFAB enheten och sterila växt-sized genomskinlig behållare. Den EcoFAB enheten är tillverkad av ett Polydimetylsiloxan (PDMS) tillverkning process som involverar gjutning PDMS lager från en 3D tryckta plast mögel och limning PDMS lager på objektglas med metoder tidigare rapporterade24,25 . De detaljerade förfarandena för EcoFAB arbetsflödet, till exempel enhet fabrication, sterilisering, frögroning, fröplanta transplantation, mikrob inympning/cocultivation, provberedning och analys, beskrivs i detta protokoll (figur 1). Ytterligare ändringar av den grundläggande arbetsflöden beskrivs, inklusive installation av dator kontrollerade LED växa lampor och utnyttjandet av fasta substrat. Utnyttjandet av imaging tekniker för att undersöka roten morfologi ändras, mikrobiell kolonisering av rötter, och massa spectroscopic imaging av roten exudat beskrivs. Vi räknar med att den enkla och billiga design baserad på lättillgängliga material, as well as de detaljerade protokoll som presenteras här, blir den EcoFAB plattformen till en gemenskapen resurs, standardisera växt-mikrobiomet laboratoriestudier.
Protokollen redovisas här för att skapa med ekosystemet fabrication EcoFABs innehåller gemenskapens resurser för systematiskt växt systembiologiska studier i starkt kontrollerad laboratoriemiljö. Framsteg inom 3D-printing tillhandahålla lättillgänglig teknik för att konstruera och iterativt raffinering EcoFAB mönster. Roten kammaren presenteras här visar sig vara väl lämpad för imaging mikroskopi och upprätthålla sterilitet, möjliggör kontrollerad tillsats av mikrober att undersöka växt-mikrobinteraktioner. EcoFAB plattformen är kompatibel med olika växtarter. Det är viktigt att känna igen fysiologiska effekter av växande växter inom smala roten kammaren så att ytterligare experiment kommer att behöva generalisera resultaten till växter som växer i naturliga miljöer.
Användning av sterila kamrar och LED ljusna gör undersökningen av effekterna av olika ljusförhållanden, inklusive våglängd, intensitet och varaktighet, om växters tillväxt och relaterade fysiologiska parametrar parallellt. Reversibel limning rot kammare tillåta användning av fasta substrat samt att rumsligt samla fasta prover för biokemisk och genetisk analys. Tillämpningar av fasta substrat, såsom jord, sand och kvarts pärlor, erbjuda möjligheterna att använda EcoFABs för att konstruera mer ekologiskt relevanta laboratorium ekosystem. Men förfina alla de system som presenteras här använder mättad vätska (hydroponiska kulturer) som inte är en korrekt speglar de flesta jordar och det blir viktigt att ytterligare dessa mönster att upprätthålla luftfickor i marken så att de bättre representera naturliga jordar.
Användningen av både enkla kameror och Mikroskop beskrivs till imageutveckling rotsystem morfologi på både bulk till cellulära nivåer. Denna lämplighet för övervakning rot morfologi avbildning och kvantifiering kommer sannolikt bra för att förstå regleringsmekanismer av växten fysiologiska och molekylära signaler utlöses av växten genotypisk anpassningar till tillväxt villkorar. En begränsning för att studera fysiologiska rotutveckling är dock aktuella horisontell placering av EcoFAB enheten. I naturliga miljöer leder rötter gravitropic svar till en övervägande vertikal utveckling av rotsystemet. Således, det horisontella systemet presenteras här sannolikt skiljer sig i vissa faktorer från en naturlig miljö och tillverkning av EcoFAB system med vertikal placering av roten kammaren är ett önskvärt mål för framtida EcoFAB versioner. Även om de nuvarande EcoFAB enheterna placeras horisontellt, är analys av roten morfologi parametrar i olika förhållanden, eller som svar på mikrober, möjligt. Hög upplösning imaging kan användas för att fånga roten kolonisation dynamiken i enstaka isolat eller samhällen, som ger information om vilken växt delar är koloniserade i olika näringsämnen tillräcklig och bristfälliga förhållanden. Det förväntas att sådana studier kommer att ge viktiga nya insikter i hur växten microbiomes monteras, och hur dessa dynamics förändras över tid, till exempel som rötterna utvecklas.
Mikroflödessystem enheter aktivera avbildning av mycket unga plantor och mängden metaboliter samlas in räcker oftast inte för LCMS analys. Jord-baserade system, såsom rhizotrons, Tillåt bildtagning av roten morfologi när antingen växterna omvandlas med Kemiluminiscens konstruera (Glo-root) eller med NMR-baserade metoder33,34. Metabolit extraktioner från dessa system är tidskrävande på grund av stor mängd prover. EcoFABs är en kombination av båda: tillverkning är liknar mikroflödessystem enheter. EcoFABs utformades för att vara enkel och billig att återge, men storleken på kammaren kan justeras för att odla växter med små eller stora rotsystem, upp till deras reproduktiva faser. Samtidiga observationer av roten morfologi förändringar och rot exsudation är möjliga. Systemet är steril, möjliggör kontrollerad tillsats av särskilda mikrober.
EcoFABs är utformade för att möjliggöra kontrollerad introduktion och provtagning av mikrober och metaboliter. Specifikt, befunnits prover som tagits från roten tillväxt chambers vara tillräckliga för massa spektroskopiska metabolit profilering. Integrationen av masspektrometri imaging (t.ex., NIMS teknik presenteras här) ger en oförstörande metod att studera metabolit rumsliga distributioner av rotsystem. Denna teknik kommer sannolikt bra i framtiden stabil isotop spårning experiment och mappning mikrobiell lokalisering till specifika metaboliter36. Detta protokoll har fokuserat på enstaka isolat, kan samma design säkert användas för mer komplexa samhällen. De provmängder och biomassa inom EcoFABs är sannolikt mer än tillräcklig för ytterligare integration med DNA-sekvensering teknik, som kommer att vara viktigt att karakterisera och övervaka mikrobiell gemenskapens struktur och gen uttryck.
Avslutningsvis detta protokoll Detaljer tillverkning av laboratoriet ekosystem utformats för utredning av växt-mikrobinteraktioner, med betoning på enkla och tillgängliga metoder som enkelt kan implementeras och utökad av forskare runt den världen. Aktuella insatser syftar till att påvisa reproducerbarhet mellan labs och integrering av ett system för kontroll av temperatur så att varje EcoFAB kommer har reglerbar ljus och temperatur. En ytterligare befordran av systemet kommer att integrationen av automatiserad provtagning och påfyllning av EcoFAB rot kamrarna och utvecklingen av reproducerbara protokoll för att fastställa relevanta växt microbiomes inom EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av laboratorium riktad forskning och utveckling (LDRD) program av Lawrence Berkeley National Laboratory stöds av i Office of Science, av US Department of Energy under Kontraktsnr DE-AC02-05CH11231 och en utmärkelse DE-SC0014079 från US Department of Energy Office av Science till UC Berkeley. Arbete molekylär Gjuteriet fick stöd enligt US Department av energi Kontraktsnr. DE-AC02-05CH11231. Vi tackar också Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen och Benjamin J. Cole vid Lawrence Berkeley National Laboratory för all deras hjälp.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |