Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor ecosysteem fabrikatie van apparaten (EcoFABs) waarmee de studies van planten en plant-microbe interacties in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.
Heilzame plant-microbe interacties bieden een duurzame biologische oplossing met de potentie om lage-input voedsel en bio-energie productie stimuleren. Een beter mechanistische inzicht in deze complexe plant-microbe interacties zal doorslaggevend zijn voor de verbetering van de plantaardige productie zoals zo goed presterende basic ecologische studies behandelende bodem-plant-microbe interacties. Hier, wordt een gedetailleerde beschrijving voor de fabricage van het ecosysteem gepresenteerd, met behulp van algemeen beschikbare 3D afdrukken technologieën, maken van gecontroleerde laboratorium habitats (EcoFABs) voor mechanistisch onderzoek naar plant-microbe interacties binnen specifieke milieu voorwaarden. Twee maten van EcoFABs worden die voor het onderzoek van microbiële interacties met verschillende soorten van planten geschikt zijn, met inbegrip van Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonen Panicum miliaceumbeschreven. Deze apparaten doorstroomtest toestaan voor gecontroleerde manipulatie en bemonstering van de wortel microbiomes, wortel chemie evenals imaging van wortel morfologie en microbiële lokalisatie. Dit protocol omvat de details voor het handhaven van de steriele omstandigheden binnen EcoFABs en montagesystemen onafhankelijke LED licht op EcoFABs. Gedetailleerde methoden voor toevoeging van verschillende vormen van media, met inbegrip van vuil, zand, en vloeibare groei media gekoppeld aan de karakterisatie van deze systemen met behulp van imaging en metabolomica worden beschreven. Samen, deze systemen inschakelen dynamisch en gedetailleerde onderzoek van de plant en plant-microbial consortia met inbegrip van de manipulatie van microbiome samenstelling (inclusief mutanten), de monitoring van de plantengroei, wortel morfologie, afgescheiden samenstelling, en microbiële lokalisatie onder gecontroleerde milieu omstandigheden. Wij verwachten dat deze gedetailleerde protocollen als een belangrijk uitgangspunt voor andere onderzoekers dienen zal, idealiter helpen maken van gestandaardiseerde experimentele systemen voor het onderzoeken van de plant-microbe interacties.
De toepassing van heilzame plant microben in de landbouw biedt grote mogelijkheden om duurzaam voedsel en de productie van biobrandstoffen om te voorzien in een groeiende bevolking1,2,3,4te verhogen. Een aanzienlijke hoeveelheid werk ondersteunt het belang van de plant microbiomes plant opname van voedingsstoffen, tolerantie aan spanningen en weerstand tegen ziekte5,,6,,7,8. Het is echter moeilijk te onderzoeken van deze mechanismen van plant-microbe interacties in veld ecosystemen als gevolg van de complexiteit en de bijbehorende irreproducibility en de onmogelijkheid om te precies regelen microbiome samenstelling en genetica (bv. met behulp microbiële mutanten)4,9,10.
Een strategie is om te bouwen van ecosystemen in het vereenvoudigde model inschakelen gecontroleerd, gerepliceerde laboratoriumexperimenten plant-microbe interacties voor het genereren van inzichten die verder kunnen worden getest in het veld10,11, onderzoeken 12. Dit concept is gebaseerd op traditionele benaderingen met behulp van planten gekweekt in bodem gevulde potten of agar platen in kassen of starterscentra13. Hoewel dit zal waarschijnlijk blijven de meest gebruikte benaderingen, ze missen het vermogen om nauwkeurig te controleren en manipuleren van de plant groei omgevingen. Voor deze doeleinden, rhizoboxes en rhizotrons vertegenwoordigen een grote verbetering in het vermogen om te studeren onder-grond processen14,15, en eerste protocollen werden gepubliceerd voor het analyseren van de rhizosfeer metabolieten in bodem16. Meer recentelijk, opdat hoge doorvoer analyse, geavanceerde microfluidic apparaten13,17 als Plant Chip18,19, RootArray20RootChip21, geweest ontwikkeld als efficiënte tools voor plant fenotypering met de ruimtelijke resolutie micrometer-schaal te controleren van de vroege groeistadia van de kleine model fabriek Arabidopsis thaliana in vloeibare stroom medium. Onlangs, een twee-laag imaging platform werd beschreven waarmee root haar beeldvorming van Arabidopsis thaliana met een microfluidic platform22stadium zaailing.
Gedetailleerde protocollen voor de bouw van gecontroleerde laboratorium apparaten (EcoFABs) hier voorwaarde, voor het bestuderen van de plant-microbe interacties en Toon dat ze kunnen worden gebruikt om te studeren diverse planten met inbegrip van Arabidopsis thaliana, kortsteel distachyon23, het ecologisch belangrijk wild oat Avena Barbata (BG), en het gewas van bio-energie Panicum miliaceum (switchgrass). EcoFAB is een steriele plant groei platform dat twee primaire componenten omvat: de EcoFAB apparaat en steriele plant middelgrote transparante container. Het apparaat uit een Polydimethylsiloxaan (PDMS bestaat) productieproces waarbij gieten PDMS EcoFAB lagen van een 3D gedrukte kunststof mal en verlijmen PDMS lagen in Microscoop dia’s met behulp van methoden eerder gemeld24,25 . De gedetailleerde procedures EcoFAB de werkstroom, zoals apparaat-fabricage, sterilisatie, kieming van het zaad, zaailing transplantatie, microbe inoculatie/cocultivation, bereiding van de monsters en analyse, worden beschreven in dit protocol (Figuur 1). Verdere wijzigingen van de Basiswerkstroom zijn beschreven, met inbegrip van de installatie van de computer gecontroleerd groeien ledverlichting en het gebruik van vaste substraten. Het gebruik van beeldvormende technieken om te onderzoeken wortel morfologie verandert, microbiële kolonisatie van de wortels, en massa spectroscopische beeldvorming van exsudaat van de wortel worden beschreven. Wij verwachten dat het ontwerp van het eenvoudige, goedkope gebaseerd op de gemakkelijk beschikbare materialen, evenals de gedetailleerde protocollen gepresenteerde, het EcoFAB platform zal veranderen in een gemeenschap resource, standaardiseren laboratoriumonderzoek plant-microbiome.
De protocollen gemeld hier voor het gebruik van ecosysteem fabricage maken dat ecofabs voorziet in communautaire middelen systematische plant biologie studies in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Voorschotten in 3D printen bieden breed toegankelijke technologieën voor bouw en iteratief verfijnen EcoFAB ontwerpen. De wortel kamer hier gepresenteerd blijkt te zijn geschikt voor imaging microscopie en onderhouden van steriliteit, gecontroleerde toevoeging van microben te onderzoeken plant-microbe interacties inschakelen. Het platform van EcoFAB is compatibel met verschillende plantensoorten. Het is belangrijk om te erkennen van de fysiologische effecten van het kweken van de planten binnen de smalle root kamer zodanig zijn dat bijkomende experimenten dient te generaliseren van bevindingen aan planten die groeien in een natuurlijke omgeving.
Het gebruik van steriele kamers en LED licht van groeien in staat stelt het onderzoek van de effecten van verschillende licht omstandigheden, met inbegrip van golflengte, intensiteit en duur, op plantengroei en bijbehorende fysiologische parameters in parallel. Omkeerbare hechting wortel kamers staan het gebruik van vaste substraten evenals te verzamelen ruimtelijk solide monsters voor biochemische en genetische analyse. De toepassingen van solide substraten, zoals bodem, zand en kwarts kralen, bieden de mogelijkheid van het gebruik van EcoFABs voor de bouw van meer ecologisch relevante laboratorium ecosystemen. Echter verfijnen alle systemen hier gepresenteerde gebruik verzadigde vloeistof (hydrocultuur culturen) die niet een accurate weerspiegeling zijn van de meeste bodems en het is belangrijk om te verder deze ontwerpen om luchtzakken binnen de bodem zodat zij beter vertegenwoordigen natuurlijke bodems.
Het gebruik van zowel eenvoudige camera’s en microscopen wordt beschreven aan de ontwikkeling van de morfologie van images wortelsysteem op beide bulk op cellulair niveau. Deze geschiktheid voor toezicht wortel morfologie beeldvorming en kwantificering zal wellicht nuttig voor het begrijpen van de regelgevende mechanismen van plant-fysiologische en moleculaire signalen veroorzaakt door plant genotypische aanpassingen aan voorwaarden van de groei. Een beperking voor de studie van fysiologische wortel ontwikkeling is echter de huidige horizontale plaatsing van het EcoFAB-apparaat. In een natuurlijke omgeving leidt de wortels gravitropic reactie tot een overwegend verticale ontwikkeling van het wortelsysteem. Dus, het horizontale systeem gepresenteerd hier waarschijnlijk verschilt in sommige factoren van een natuurlijke omgeving, en de fabricage van EcoFAB systemen met verticale plaatsing van de wortel kamer is een wenselijk doel voor toekomstige versies van de EcoFAB. Hoewel de huidige EcoFAB apparaten horizontaal geplaatst worden, is de analyse van root morfologie parameters in verschillende omstandigheden, of in antwoord op de microben, mogelijk. Hoge resolutie beeldvorming kan worden toegepast om vast te leggen van de wortel kolonisatie dynamiek van één isolaten of gemeenschappen, het verstrekken van informatie over welke plant delen in verschillende voedingsstoffen voldoende en gebrekkige omstandigheden zijn gekoloniseerd. Verwacht wordt dat dergelijke studies belangrijke nieuwe inzichten in hoe plant microbiomes worden geassembleerd, en hoe deze dynamiek veranderen na verloop van tijd zal opleveren, bijvoorbeeld als de wortels te ontwikkelen.
Microfluidic apparaten inschakelen beeldvorming van zeer jonge planten, en meestal de hoeveelheid metabolieten verzameld is niet voldoende voor LCMS analyse. Bodem-gebaseerde systemen, zoals rhizotrons, geven de beeldvorming van de morfologie van de wortel of de planten worden omgezet met chemiluminescentie construct (Glo-root) of met NMR gebaseerde methoden33,34. Metaboliet extracties uit deze systemen zijn tijdrovend vanwege grote omvang van de monsters. EcoFABs zijn een combinatie van beide: de fabricage is vergelijkbaar met de microfluidic apparaten. EcoFABs werden ontworpen om eenvoudig en goedkoop te reproduceren, maar de grootte van de kamer kan worden aangepast om te groeien planten met kleine of grote wortelsystemen, tot hun reproductieve fasen. Gelijktijdige opmerkingen van wortel morfologie veranderingen en afscheiding van de hoofdmap zijn mogelijk. Het systeem is steriele, gecontroleerde toevoeging van specifieke microben inschakelen.
EcoFABs zijn ontworpen om gecontroleerde invoering en monsterneming van microben en metabolieten. Specifiek, monsters verzameld uit wortel groei chambers blijken te zijn voldoende voor massa spectroscopische metaboliet profileren. De integratie van massaspectrometrie beeldvorming (bijv., NIMS techniek hier gepresenteerd) zorgt voor een niet-destructieve manier van het bestuderen van de ruimtelijke distributies metaboliet van wortelstelsel. Deze techniek zal wellicht nuttig in de toekomst stabiele isotoop tracering experimenten en toewijzing microbiële localization voor specifieke metabolieten36. Terwijl dit protocol is gericht op één isolaten, kan hetzelfde ontwerp zeker worden gebruikt voor meer complexe Gemeenschappen. De monster volumes en biomassa binnen de EcoFABs zijn waarschijnlijk meer dan voldoende voor verdere integratie met DNA sequencing technologieën, die zal moeten karakterisering en controle van de microbiële Gemeenschap structuur en gen-expressie.
Kortom, dit protocol gegevens de fabricage van laboratorium ecosystemen ontworpen voor het onderzoek van plant-microbe interacties, met nadruk op eenvoudige en toegankelijke methoden die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd en uitgebreid door onderzoekers rond de wereld. Huidige inspanningen zijn gericht op het aantonen van de reproduceerbaarheid tussen labs en de integratie van een temperatuur controlesysteem zodanig dat elke EcoFAB zal apart hebben geregeld, licht en temperatuur. Een verdere verbetering van het systeem zullen de integratie van geautomatiseerde bemonstering en bijvullen van de kamers van de wortel EcoFAB en de ontwikkeling van reproduceerbare protocollen voor de vaststelling van relevante plant microbiomes binnen EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door laboratorium gericht onderzoek en ontwikkeling (LDRD) programma van het Lawrence Berkeley National Laboratory ondersteund door het Office of Science, van het US Department of Energy onder Contract nr. DE-AC02-05CH11231 en een award DE-SC0014079 van het VS departement van energie Office of Science aan UC Berkeley. Werk op de moleculaire lettergieterij steunde onder VS departement van energie Contract nr. DE-AC02-05CH11231. Wij danken ook Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen en Benjamin J. Cole bij het Lawrence Berkeley National Laboratory voor al hun hulp.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |