Dieser Artikel beschreibt ausführliche Protokolle für die Ökosystem-Herstellung von Geräten (EcoFABs), die das Studium der Pflanzen und Pflanzen-Mikroben-Interaktionen in hohem Grade kontrollierten Laborbedingungen ermöglichen.
Wohltuende Pflanze-Mikroben-Interaktionen bieten eine nachhaltige biologische Lösung mit dem Potenzial, Low-Input-Essen und Bioenergie-Produktion zu steigern. Ein besseres mechanistisches Verständnis dieser komplexen Pflanze-Mikroben-Interaktionen werden entscheidend für die Pflanzenproduktion zu verbessern, wie auch leistungsstarke grundlegende ökologische untersuchende Pflanze-Boden-Mikroben-Interaktionen Studien. Hier ist eine ausführliche Beschreibung zum Ökosystem Herstellung präsentiert mit allgemein verfügbaren 3D Drucktechnologien, um kontrollierten Labor Lebensräume (EcoFABs) für mechanistische Studien der Pflanze-Mikroben-Interaktionen innerhalb der spezifischen Umwelt zu schaffen, Bedingungen. Zwei Größen der EcoFABs werden beschrieben, die für die Untersuchung der mikrobielle Wechselwirkungen mit verschiedenen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis Thaliana, Brachypodium Distachyonund Panicum Virgatumgeeignet sind. Diese durchströmten Geräte zulassen für kontrollierte Manipulation und Beprobung von Stamm mikrobiome, Stamm Chemie sowie Bildgebung des Wurzel-Morphologie und mikrobielle Lokalisierung. Dieses Protokoll enthält die Details für die Aufrechterhaltung der steriler Bedingungen in EcoFABs und Montage unabhängige LED-Lichtsysteme auf EcoFABs. Detaillierte Methoden zur Ergänzung der verschiedenen Formen von Medien, einschließlich Böden, sand, und flüssige Wachstumsmedien gekoppelt bis hin zur Charakterisierung dieser Systeme mittels Bildgebung und Metabolomics werden beschrieben. Diese Systeme ermöglichen dynamische und detaillierte Untersuchung der Pflanze und Pflanze-mikrobielle Konsortien einschließlich der Manipulation des Mikrobiom Komposition (einschließlich Mutanten), die Überwachung von Pflanzenwachstum, Wurzel Morphologie, Exsudat Zusammensetzung, und mikrobielle Lokalisierung unter kontrollierten Umweltbedingungen. Wir erwarten, dass diese detaillierte Protokolle für andere Forscher, im Idealfall hilft standardisierte experimentelle Systeme für die Untersuchung von Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu erstellen als ein wichtiger Ausgangspunkt dienen soll.
Die Anwendung der positiven Pflanze-Mikroben in der Landwirtschaft bietet großes Potenzial für nachhaltige Ernährung und Biokraftstoff-Produktion für eine wachsende Bevölkerung1,2,3,4zu erhöhen. Eine erhebliche Menge an Arbeit unterstützt die Bedeutung der Pflanze-mikrobiome Pflanze Nährstoffaufnahme, Toleranz zu Spannungen und Widerstand gegen Krankheit5,6,7,8. Es ist jedoch schwierig, diese Mechanismen der Pflanze-Mikroben-Interaktionen im Bereich Ökosysteme aufgrund der Komplexität und damit verbundenen Unreproduzierbarkeit und Unfähigkeit zur Kontrolle genau Microbiome Zusammensetzung und Genetik zu untersuchen (zB. mit mikrobielle Mutanten)4,9,10.
Eine Strategie besteht darin, vereinfachtes Modell Ökosysteme ermöglichen konstruieren gesteuert, replizierte Laborversuchen untersucht Pflanze-Mikroben-Interaktionen um Erkenntnisse zu generieren, die weiter in den Bereich10,11getestet werden können, 12. Dieses Konzept baut auf traditionellen Ansätzen, die Verwendung von Pflanzen in Erde gefüllten Töpfe oder auf Agar-Platten in Gewächshäusern oder Inkubatoren13. Obwohl diese wahrscheinlich bleibt die am weitesten verbreitete Ansätze, ihnen fehlt die Fähigkeit, genau zu überwachen und manipulieren Pflanze Wachstum Umgebungen. Zu diesem Zweck Rhizoboxes und Rhizotrons stellen eine wesentliche Verbesserung in der Fähigkeit, unterirdische Prozesse14,15studieren und erste Protokolle wurden für die Analyse der Rhizosphäre Metaboliten im Boden16veröffentlicht. In jüngerer Zeit, um Hochdurchsatz-Analyse zu ermöglichen, wurden erweiterte mikrofluidischen Geräten13,17 wie Pflanze Chip18,19, RootArray20und RootChip21, entwickelt als effiziente Werkzeuge für die Pflanze Phänotypisierung mit Mikrometer-Skala räumliche Auflösung die frühen Entwicklungsstadien von der kleinen Modellpflanze Arabidopsis Thaliana in flüssigem Fördermedium zu überwachen. Vor kurzem wurde eine Zweischicht-Image Plattform beschrieben, die Wurzelhaare Bildgebung von Arabidopsis Thaliana im Keimlingsstadium mit einem mikrofluidischen Plattform22ermöglicht.
Hier sind detaillierte Protokolle für den Bau von kontrollierten Laborgeräte (EcoFABs) zur Verfügung gestellt, für das Studium der Pflanze-Mikroben-Interaktionen und zeigen, dass sie verwendet werden können, um diverse studieren Pflanzen einschließlich Arabidopsis Thaliana, Brachypodium Distachyon23, die ökologisch wichtigen Wildhafer Avena Barbata und die Bioenergie-Ernte Panicum Virgatum (Rutenhirse). EcoFAB ist eine sterile Pflanzen-Wachstum-Plattform, die zwei Hauptkomponenten umfasst: das EcoFAB Gerät und sterile Pflanze Mittlere durchsichtigen Behälter. Das EcoFAB, das Gerät ist aus einer Fertigung Prozess, bei dem Casting PDMS, Polydimethylsiloxan (PDMS) Schichten aus einem 3D bedruckte Kunststoff-Formenbau und Verklebung PDMS Schichten auf Objektträger mit Methoden zuvor berichtet,24,25 . Die Modalitäten der EcoFAB-Workflow, wie Gerät Fertigung, Sterilisation, Samenkeimung, Sämling Transplantation, Mikrobe Impfung/Cocultivation, Probenvorbereitung und Analyse, werden in diesem Protokoll (Abbildung 1) beschrieben. Weitere Modifikationen des grundlegenden Workflows werden beschrieben, einschließlich der Installation von Computer gesteuerten LED Grow Lights und die Nutzung von festen Substraten. Die Nutzung der bildgebenden Verfahren untersuchen Wurzel Morphologie ändert, mikrobielle Besiedlung der Wurzeln, und Masse spectroscopic Imaging Wurzelausscheidungen werden beschrieben. Wir erwarten, dass das einfache, kostengünstige Design basierend auf leicht verfügbaren Materialien, sowie die detaillierte Protokolle hier vorgestellte Gemeinschaft Ressource, die EcoFAB-Plattform wird Standardisierung Pflanze Microbiome Laborstudien.
Die Protokolle erzielte hier mit Ökosystem Fertigung um zu schaffen EcoFABs bietet Community-Ressourcen für systematische Anlage Studium der Biologie in hohem Grade kontrollierten Laborbedingungen. Fortschritte in der 3D-Druck bieten allgemein zugängliche Technologien für den Bau und iterativ verfeinern EcoFAB Entwürfe. Die Wurzel Kammer hier vorgestellten festgestellt wird, gut geeignet für imaging-Mikroskopie und Aufrechterhaltung der Sterilität, ermöglicht kontrollierte Zugabe von Mikroben, Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Die EcoFAB-Plattform ist kompatibel mit verschiedenen Pflanzenarten. Es ist wichtig zu erkennen, physiologische Wirkungen von Pflanzen innerhalb der schmalen Wurzel Kammer, so dass zusätzliche Experimente benötigt werden, um Erkenntnisse zu Pflanzen, die in natürlichen Umgebungen zu verallgemeinern.
Die Verwendung von sterilen Kammern und LED Grow Licht ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Lichtverhältnissen, einschließlich Wellenlänge, Intensität und Dauer auf Pflanzenwachstum und physiologische Parameter parallel. Reversible Bindung Wurzel Kammern ermöglichen die Verwendung von festen Substraten als auch räumlich feste Proben für Biochemische und genetische Analyse sammeln. Die Anwendungen von festen Substraten, wie Böden, Sand und Quarz Perlen, bieten die Möglichkeiten der Verwendung von EcoFABs, um ökologisch relevanten Labor Ökosysteme zu konstruieren. Jedoch verfeinern alle Systeme, die hier vorgestellten Verwendung werden gesättigte Flüssigkeit (hydroponischen Kulturen), die kein genaues Bild von den meisten Böden und es sind wichtig, weiter diese Entwürfe Lufteinschlüsse im Boden zu halten, so dass sie besser vertreten Naturböden.
Die Verwendung von einfachen Kameras und Mikroskope ist auf Bild Wurzelsystem Morphologie Entwicklung auf beide Massen auf zellulärer Ebene beschrieben. Diese Eignung für Überwachung Wurzel Morphologie Bildgebung und Quantifizierung werden wahrscheinlich hilfreich für das Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Pflanze physiologischen und molekularen Signale ausgelöst durch Anlage genotypischen Anpassungen an Wachstumsbedingungen. Eine Einschränkung für das Studium der physiologischen WURZELENTWICKLUNG ist jedoch die aktuelle horizontale Platzierung des EcoFAB Gerätes. In natürlichen Umgebungen führt die Wurzeln gravitropischer Antwort auf eine überwiegend vertikale Entwicklung des Wurzelsystems. So, das horizontale System wahrscheinlich hier vorgestellten unterscheidet sich in einigen Faktoren aus einer natürlichen Umgebung, und die Herstellung von EcoFAB Systemen mit vertikalen Positionierung der Wurzel Kammer ist ein erstrebenswertes Ziel für zukünftige Versionen der EcoFAB. Obwohl die aktuelle EcoFAB Geräte horizontal platziert werden, ist die Analyse der Root-Morphologie-Parameter unter verschiedenen Bedingungen oder als Reaktion auf Mikroben, möglich. Hochauflösende Bildgebung kann angewendet werden, um Wurzel Kolonisation Dynamik der einzelnen Isolate oder Gemeinschaften, Bereitstellung von Informationen über die Pflanze Teile in verschiedenen ausreichend und mangelhaft Nährstoffverhältnisse kolonisiert sind zu erfassen. Es wird davon ausgegangen, dass solche Studien liefern wichtige neue Erkenntnisse wie Pflanze mikrobiome montiert und wie diese Dynamik im Laufe der Zeit ändern, zum Beispiel als die Wurzeln entwickeln.
Mikrofluidische Geräte ermöglichen Bildgebung von sehr jungen Pflanzen, und die Menge an Metaboliten gesammelt reicht in der Regel nicht für LCMS Analyse. Boden-basierten Systemen, wie z. B. Rhizotrons, ermöglichen die Darstellung der Morphologie der Wurzel, wenn entweder die Pflanzen mit Chemilumineszenz Konstrukt (Glo-Wurzel) oder NMR-basierte Methoden33,34umgewandelt werden. Metabolit Extraktionen aus diesen Systemen sind zeitaufwendig durch großvolumige Proben. EcoFABs sind eine Kombination aus beidem: die Herstellung ist vergleichbar mit mikrofluidischen Geräten. EcoFABs wurden entwickelt, um einfach und kostengünstig zu reproduzieren, sondern die Größe der Kammer kann angepasst werden, um Pflanzen mit kleinen oder großen Wurzelsysteme, bis zu der reproduktiven Phase wachsen. Gleichzeitigen Beobachtungen der Wurzel Morphologie Änderungen und Wurzel Exsudation sind möglich. Das System ist steril, ermöglicht kontrollierte Zugabe von bestimmten Mikroben.
EcoFABs sollen kontrollierte Einführung und Probenahme von Mikroben und Metaboliten zu ermöglichen. Insbesondere finden Sie Proben von Wurzel Klimakammern für Masse spektroskopische Metabolit Profilierung ausreichend. Die Integration der Massenspektrometrie Bildgebung (zB., NIMS Technik hier vorgestellten) bietet einen nicht-destruktive Ansatz Metabolit räumliche Verteilungen des Wurzelsystems zu studieren. Diese Technik wird wahrscheinlich hilfreich in Zukunft stabiler Isotope Ablaufverfolgung Experimente und mikrobielle Lokalisierung Zuordnung zu bestimmten Metaboliten36sein. Während dieses Protokoll auf einzelne Isolate konzentriert hat, kann das gleiche Design sicherlich für komplexere Gemeinden verwendet werden. Das Probenvolumen und Biomasse innerhalb der EcoFABs sind wahrscheinlich mehr als ausreichend für eine weitere Integration mit DNA-Sequenzierung Technologien, die zur Charakterisierung und Überwachung von mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Gen Ausdruck wichtig sein wird.
Zusammenfassend, dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Labor Ökosysteme entwickelt, für die Untersuchung der Pflanze-Mikroben-Interaktionen, mit Schwerpunkt auf einfachen und verständlichen Methoden, die leicht umgesetzt und von den Forschern um erweitert werden kann die Welt. Aktuelle Bemühungen richten sich an die Reproduzierbarkeit von Labors und die Integration einer Temperatur-Steuerung demonstrieren, so dass jeder EcoFAB unabhängig Licht und Temperatur gesteuert haben. Eine Weiterentwicklung des Systems werden die Integration von automatisierten Probenahme und Nachfüllen der EcoFAB Wurzel Kammern und die Entwicklung der reproduzierbaren Protokolle für die Festlegung der entsprechenden Pflanze mikrobiome in EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt Labor leitete Forschung und Entwicklung (LDRD) Programm des Lawrence Berkeley National Laboratory unterstützt durch das Office of Science des US Department of Energy unter Vertragsnr. DE-AC02-05CH11231 und eine Auszeichnung DE-SC0014079 die US Abteilung von Energie Office of Science an der UC Berkeley. Arbeit in der molekularen Gießerei wurde unter US Abteilung von Energie Vertragsnr. unterstützt. DE-AC02-05CH11231. Wir danken auch Katherine Louie, Suzanne M. Kosina, Benjamin P. Bowen und Benjamin J. Cole am Lawrence Berkeley National Laboratory für all ihre Hilfe.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |