Bu makalede ekosistem bitkiler ve son derece kontrollü laboratuvar koşullarında bitki-mikrop etkileşimleri sağlayan aygıtlar (EcoFABs) imalatı için detaylı iletişim kurallarını açıklar.
Faydalı bitki-mikrop etkileşimleri düşük-girdili gıda ve biyoenerji üretimi artırmak için potansiyeli ile sürdürülebilir bir biyolojik çözüm sunuyoruz. Bu karmaşık bitki-mikrop etkileşimler bir daha iyi mekanik anlayış soruşturma bitki-toprak-mikrop etkileşimler de performans temel ekolojik çalışmalar gibi bitki üretim geliştirmek için çok önemli olacak. Burada, ekosistem imalat için ayrıntılı bir açıklama, kontrollü laboratuvar yaşam alanları (EcoFABs) içinde özel bitki-mikrop etkileşimlerin mekanik Etütler çevre oluşturmak için yaygın olarak kullanılan 3D baskı teknolojilerini kullanarak sunulur koşullar. EcoFABs iki boyutları Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonve Panicum virgatumdahil olmak üzere çeşitli bitki türleri ile mikrobiyal etkileşim incelenmesi için uygun açıklanmıştır. Bu akış yoluyla cihazlar manipülasyon kontrollü ve kök microbiomes, kök kimya örnekleme yanı sıra için kök morfoloji ve mikrobiyal yerelleştirme görüntüleme izin. Bu iletişim kuralı steril koşullar içinde EcoFABs Bakımı ve EcoFABs üzerine bağımsız LED ışık sistemleri montaj ayrıntıları içerir. Medya, toprak, dahil olmak üzere farklı formları eklenmesi için detaylı yöntemleri kum ve sıvı büyüme medya Imaging’i kullanma bu sistemler karakterizasyonu birleştiğinde ve metabolomics açıklanmıştır. Birlikte, bu sistemlerin bitki ve bitki-mikrobiyal konsorsiyumlar izleme bitki büyüme, kök Morfoloji, çıktı kompozisyon, microbiome kompozisyon (dahil mutantlar), manipülasyon dahil olmak üzere dinamik ve detaylı incelenmesi etkinleştirmek ve mikrobiyal yerelleştirme kontrollü çevresel şartlar altında. Biz bu ayrıntılı iletişim kuralları ideal bitki-mikrop etkileşimleri soruşturma için deneysel standartlaştırılmış sistemleri oluşturmak yardımcı diğer araştırmacılar için önemli bir başlangıç noktası olarak hizmet verecek tahmin.
Uygulama yararlı bitki mikroplar tarımda sürdürülebilir gıda ve büyüyen nüfus1,2,3,4için sağlamak için biyoyakıt üretimi artırmak için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Önemli miktarda iş bitki microbiomes önemini bitki besin alımı, tolerans vurguluyor ve direnç hastalık5,6,7,8destekler. Ancak, bu mekanizmalar karmaşıklığı ve ilişkili irreproducibility ve tam microbiome kompozisyon ve genetik kontrolü için yetersizlik nedeniyle alan ekosistemlerinin bitki-mikrop etkileşimlerin araştırmak zordur (örn., kullanma mikrobiyal mutantlar)4,9,10.
Bir strateji tarafından kontrol, daha fazla alan10‘,11test edilebilir anlayışlar oluşturmak için bitki-mikrop etkileşimleri soruşturma çoğaltılmış laboratuvar deneyleri etkinleştirmek için Basitleştirilmiş model ekosistemler oluşturmaktır, 12. Bu kavram geleneksel yaklaşımlar toprak dolu kaplarda yetiştirilen bitkiler kullanarak veya agar plaka seralar veya KULUÇKA13içinde oluşturur. Bunlar büyük olasılıkla kalacak olmasına rağmen en yaygın kullanılan yaklaşımlar, onlar tam olarak izlemek ve bitki büyüme ortamlarda işlemek için yetenek eksikliği. Bu biter, rhizoboxes ve rhizotrons önemli bir gelişme zemin altındaki işlemler14,15çalışma yeteneğini gösterir ve ilk protokolleri rizosferde metabolitleri toprak16analiz etmek için yayınlandı. Daha yakın zamanlarda, yüksek üretilen iş analizi etkinleştirmek için gelişmiş mikrosıvısal aygıtları13,17 gibi bitki çip18,19, RootArray20ve RootChip21,-si olmak be bitki fenotipleme ile sıvı akışı orta küçük model bitki Arabidopsis thaliana erken büyüme dönemlerinde izlenecek mikrometre ölçekli Uzaysal çözünürlük için verimli araçlar olarak geliştirilmiştir. Son zamanlarda, bir iki katlı görüntüleme platformu sağlayan Arabidopsis thaliana kök saç görüntüleme fide aşamasında bir mikrosıvısal platformu22ile tanımlanmıştır.
Bitki mikrop etkileşimleri ve gösteri eğitimi için onlar çeşitli eğitim için kullanılabilir Arabidopsis thaliana, Brachypodium da dahil olmak üzere bitkiler, burada, kontrollü laboratuvar aygıtları (EcoFABs) oluşturmak için ayrıntılı iletişim kuralları sağlanır distachyon23, ekolojik önemli yabani yulaf Avena barbata ve biyoenerji kırpma Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB iki birincil bileşenleri içeren bir platformdur steril bitki büyüme: EcoFAB aygıt ve bitki ölçekli steril şeffaf kapsayıcı. Bir 3D Baskılı Plastik kalıp üretim süreci döküm PDMS içerir bir polydimethylsiloxane (PDMS) yapılmış aygıt EcoFAB katmanlar ve PDMS katmanları daha önce yöntemlerle mikroskop slayta bağ24,25 bildirdi . Cihaz imalat, sterilizasyon, tohum çimlenmesi, fide nakli, mikrop aşı/cocultivation, numune hazırlama ve analiz, gibi EcoFAB iş akışı ayrıntılı yordamlar bu Protokolü (şekil 1) açıklanmıştır. Daha fazla değişiklikler temel iş akışı açıklanmıştır, bilgisayar kurulumu dahil olmak üzere LED grow ışıklar ve düz yüzeylerde kullanımı kontrollü. Teknikleri kök Morfoloji araştırmak için Imaging kullanımı, kökleri, mikrobiyal kolonizasyon değiştirir ve kök exudates kitle spektroskopik görüntüleme açıklanmıştır. Biz laboratuvar bitki-microbiome çalışmalar standartlaştırılması hazır malzeme yanı sıra burada anlatılan ayrıntılı protokolleri göre basit, ucuz tasarım EcoFAB platformu bir topluluk kaynak dönecek tahmin.
İletişim kuralları oluşturmak için ekosistem imalat kullanmak için EcoFABs topluluk kaynakları için sistematik bitki Biyoloji çalışmalar son derece kontrollü laboratuvar koşullarında sağlar rapor burada. 3D baskı gelişmeler oluşturmak ve yinelemeli olarak rafine EcoFAB tasarımları yaygın olarak erişilebilen teknolojiler sağlar. Burada sunulan kök odası mikroskobu görüntüleme ve kısırlık, bitki-mikrop etkileşimleri araştırmak için mikroplar kontrollü yanı sıra etkinleştirme bakımı için de uygun olduğu bulunmuştur. EcoFAB, çeşitli bitki türleri ile uyumlu bir platformdur. Öyle ki ek deneyler doğal ortamlarda büyüyen bitkiler için bulgular genelleştirmek için gerekli dar kök odası içinde bitki yetiştirme fizyolojik etkileri tanımak önemlidir.
Dalga boyu, şiddeti ve süresi, bitki büyüme ve paralel ilgili fizyolojik parametreler de dahil olmak üzere çeşitli ışık koşullarında etkilerinin incelenmesi steril Odalar ve LED grow ışık kullanımı sağlar. Tersine çevrilebilir Bono kök odaları düz yüzeylerde de dağınık şekilde biyokimyasal ve genetik analizi için sağlam örnekler toplamak olarak kullanılmasına izin. Katı yüzeyler, toprak, kum ve kuvars boncuk, gibi uygulamaları daha ekolojik ilgili laboratuvar ekosistem oluşturmak için EcoFABs kullanarak olanaklar sunmaktadır. Ancak, burada daha fazla kullanım çoğu toprak ve doğru bir yansıması değildir doymuş sıvı (hydroponic kültürleri) için önemli olacaktır sunulan tüm sistemleri daha iyi temsil ettikleri öyle ki hava cepleri toprak içinde korumak için bu tasarımları rafine doğal toprak.
Kullanımı basit kameralar ve mikroskoplar hücresel düzeyleri için her iki toplu görüntü kök sistemi Morfoloji geliştirme için tanımlanır. Bu uygunluk izleme kök Morfoloji görüntüleme ve miktar için büyük olasılıkla bitki fizyolojik ve moleküler sinyaller bitki büyüme koşullarına genotypic adaptasyonlar tarafından tetiklenen düzenleyici mekanizmaları anlamak için yardımcı olabilir. Ancak, fizyolojik kök geliştirme eğitim için bir EcoFAB aygıt geçerli yatay yerleşimini kısıtlamadır. Doğal ortamlarda, kökleri gravitropic yanıt ağırlıklı olarak dikey bir kök sistemi gelişimine yol açar. Böylece, yatay sistem büyük olasılıkla burada sunulan bazı faktörler doğal ortamından farklıdır ve EcoFAB sistemleri imalatı, kök odasının dikey yerleşim ile gelecekteki EcoFAB sürümleri için arzu edilen bir hedeftir. Geçerli EcoFAB cihazlar yatay olarak yerleştirilir, kök Morfoloji parametreleri çeşitli koşullar veya yanıt olarak mikroplar, analizi mümkündür. Yüksek kararlılık düşsel kök kolonizasyon dinamikleri tek yalıtır veya topluluklar, hangi bitki hakkında parçalar çeşitli besin yeterli ve eksik koşullarda kolonize bilgilerinizi yakalamak için uygulanabilir. Bu tür çalışmalar nasıl bitki microbiomes monte edilir ve nasıl bu dinamikler zaman içinde değişim önemli yeni görüşler sağlayacaktır tahmin edilmektedir, örneğin kökleri olarak geliştirmek.
Görüntüleme çok genç bitkilerin mikrosıvısal aygıtları etkinleştirmek ve genellikle toplanan metabolit miktarı LCMS analiz için yeterli değildir. Rhizotrons gibi toprak tabanlı sistemler kök Morfoloji görüntüleme izin ya da bitkiler chemiluminescent yapı (Glo-kök) veya NMR tabanlı yöntemleri33,34ile dönüştürülür. Metaboliti çekimi bu sistemlerden örnekleri büyük miktarda nedeniyle zaman alıcı vardır. EcoFABs her ikisinin kombinasyonu vardır: fabrikasyon mikrosıvısal cihazlara benzerdir. EcoFABs basit ve ucuz çoğaltmak için tasarlanmıştır ancak büyüklük odası ile küçük veya büyük kök sistemleri, onların üreme aşamaları kadar bitkiler büyümek için ayarlanabilir. Kök Morfoloji değişiklikleri ve kök reaksiyon eş zamanlı gözlemler mümkündür. Belirli mikroplar kontrollü yanı sıra etkinleştirme sistem sterildir.
EcoFABs kontrollü giriş ve örnekleme mikroplar ve metabolitleri etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Özellikle, kök büyüme odaları toplanan örnekleri kitle spektroskopik metaboliti profil oluşturma için yeterli görülmüştür. Kütle spektrometresi görüntüleme entegrasyonu (örn., burada sunulan Lodd tekniği) metaboliti kayma dağıtımları kök sistemleri eğitimi non-yıkıcı bir yaklaşım sağlar. Bu teknik-ecek beğenmek var olmak yararlı gelecekte kararlı izotop izleme deneyleri ve eşleme mikrobiyal yerelleştirme belirli metabolitleri36. Bu iletişim kuralı tek yalıtır üzerinde odaklanmıştır, aynı tasarım kesinlikle daha karmaşık toplulukları için kullanılabilir. Örnek birimleri ve biyokütle EcoFABs içinde DNA sıralama teknolojileri ile daha fazla entegrasyon için daha–dan yeterli, karakterize ve mikrobiyal toplum yapısı ve gen ifade izleme ile önemli olacağı aşikardır.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralını bitki-mikrop etkileşimleri, kolay uygulanan ve araştırmacılar tarafından genişletilmiş basit ve erişilebilir yöntemleri üzerinde durularak incelenmesi için tasarlanmış laboratuvar ekosistemler imalatı detayları Dünya. Öyle ki her EcoFAB bağımsız olarak ışık ve sıcaklık kontrollü tekrarlanabilirlik labs ve sıcaklık kontrol sistemi entegrasyonu arasında gösteren şimdiki çabalar hedefleniyor. Sistemin daha fazla bir ilerleme otomatik örnekleme bütünleştirilmesi ve EcoFAB kök Odalar ve ilgili bitki microbiomes EcoFABs içinde kurmak için tekrarlanabilir protokolleri gelişimi dolumu olacak.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı ABD Enerji Bakanlığı Sözleşme No altında Office, bilimi tarafından desteklenen laboratuvar yönelik araştırma ve geliştirme (LDRD) programı tarafından desteklenen DE-AC02-05CH11231 ve UC Berkeley ABD enerji Office, Bilimi Bölümü bir ödülü DE-SC0014079. İş yerinde moleküler dökümhane ABD bölümü, enerji Sözleşme No altında desteklenmiştir DE-AC02-05CH11231. Biz de Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen ve Benjamin J. Cole Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı yardımları için teşekkür ederim.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |