Den polysackarid kapseln är primära virulens faktorn i Cryptococcus neoformans, och dess storlek korrelerar med stam virulens. Kapselns diameter mätningar används i fenotypiska test och att mäta terapeutisk effekt. En standardmetod för kapsel induktion presenteras här, och två metoder för färgning och mäta diameter jämförs.
Den polysackarid kapseln av Cryptococcus neoformans är primära virulens faktor och en av mest studerade vanligaste aspekter av denna patogena jäst. Kapselns storlek kan variera kraftigt mellan stammar, har förmågan att växa snabbt när introducerade stressande eller låg näringsrika förhållanden och har varit positivt korrelerad med stam virulens. Av dessa skäl är storleken på kapseln av stort intresse för C. neoformans forskare. Tillväxten av C. neoformans kapseln induceras under fenotypiska test för att förstå effekterna av olika behandlingar på jäst eller storlek skillnader mellan stammar. Här beskriver vi en av standardmetoderna för kapsel induktion och jämför två godkända metoder för färgning och mäta kapsel diameter: (i) Indien bläck, en negativ fläcken, används i samband med konventionella ljusmikroskopi och (ii) Co färgning med fluorescerande färgerna av både cellväggen och kapsel följt av konfokalmikroskopi. Slutligen visar vi hur mätning av kapsel diameter från Indien färgfläckade prover kan vara automatiserad använder computational bildanalys.
Som drabbar en kvarts miljon människor varje år och leder till mer än 180 000 dödsfall årligen, är Cryptococcus neoformans en patogen, intracellulära jäst och vilka smittämnen av kryptokockos1,2, 3. hårdast är HIV-positiva patienter i fattiga länder som inte har tillgång till antiretroviral behandling, vilket gör dem mycket mottagliga för den sjukdom4,5,6. Data från CDC visar att i subsahariska Afrika, C. neoformans dödar fler människor än tuberkulos årligen och mer varje månad än någon ebolautbrottet på posten1. Vanligaste exponeringsvägen uppstår från att andas in desiccated sporer som är vardagsmat i den miljö7. Ovanför inlåtande lungorna, finns det flera virulensfaktorer som bidrar till framgång för C. neoformans inom infekterade individer. Polysackarid kapseln anses mikrobs primära virulens faktor, som acapsular stammar inte är virulent8.
Cryptococcal kapseln består av tre principen komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), och mannoproteins (MPs)9. MPs är en relativt liten cellväggen-associerade komponent i kapseln, de är immunogena och kan främja en mestadels pro-inflammatoriska svar9,10. Däremot GXM och GalXM utgör huvuddelen av kapseln (> 90% av vikten) och har immunsuppressiva effekter11. Förutom dess immunmodulerande effekter skapar den snabba utvidgningen av kapsel i vivo en mekanisk barriär ingestion av värd Fagocytos celler (dvs, neutrofiler och makrofager)12. C. neoformans kapseln och dess syntes är komplexa, men sammantaget ökade kapsel diameter är korrelerad med ökad virulens6,13,14. Mot denna bakgrund är det viktigt för C. neoformans forskare att kunna snabbt och exakt kvantifiera kapsel mätningar.
Både C. neoformans cellen och dess polysackarid kapsel är dynamiska strukturer och visa förändringar över tid15. Kapseln kan ändra i densitet, storlek och montering som svar på förändringar i den mottagande miljö16,17,18. Lågt järn eller näringsnivå, exponering för serum, människans fysiologiska pH och ökade CO2 är kända för att initiera kapsel tillväxt16,18,19,20. Dessutom har forskarna visat strukturförändringar som resulterar i betydande skillnader i immunoreaktivitet under en infektion, utlåning en fördel till C. neoformans över dess värd21,22. Detta är känt eftersom arkitekturen av C. neoformans kapseln har analyserats i en mängd olika sätt. Elektronmikroskopi, exempelvis har avslöjat att kapseln har en heterogen matris med ett inre elektron-täta lager under en yttre, mer genomsläppliga lager23. Ljusspridning och användning av optisk pincett låtit forskare att ytterligare klarlägga dess makromolekylära boenden24. Analysera resultaten från både statiska och dynamiska ljusspridning mätningar, vet vi att den polysackarid kapseln har en komplex förgrenade struktur23. Optisk pincett har använts för att testa styvhet struktur samt utvärdera dess antikropp reaktivitet24. Särklass mest ofta sysselsatta analys av C. neoformans kapseln är dock mätningen av dess storlek.
För att kvantifiera kapsel storlek, forskare använder vad som borde vara en enkel mätning: linjär diametern på kapseln. Digitala Mikroskop används för att fånga bilder av flera C. neoformans celler (allmänt hundratals) färgas med tusch eller fluorescerande färgämnen. Varje cell kropp och omgivande kapsel storlek mäts. Uppgifterna sammanställs, och den genomsnittliga diametern av kapseln beräknas genom att subtrahera cellkroppen diameter från hela cellen diameter (cell kropp + kapsel). Fram till denna punkt, har dessa mätningar gjorts manuellt. Medan generellt korrekt, har denna metod nackdelar för forskare. Stora datamängder kan ta dagar eller veckor att analysera för hand. Och eftersom dessa mätningar sker manuellt, subjektivitet och mänskliga misstag kan påverka resultatet.
Automatiserad computational bildanalys har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare inom många områden i molekylär cellbiologi, möjliggör snabbare och mer tillförlitlig analys av biologiska bilder 25,26,27. Exakt bild analystekniker är nödvändiga att gruvan kvantitativ information från vad är ofta komplexa och enorma datamängder. Vissa mätningar, särskilt mätning av C. neoformans kapsel, har dock svårt att automatisera. Att korrekt identifiera gränssnittet mellan cellväggen och kapsel, som allmänt visas som en mörk ring när fotograferad av faskontrast mikroskopi, kan vara besvärligt att lösa med hjälp av ett enkelt tröskelvärde. Ytterligare, C. neoformans celler i kultur tenderar att klumpa ihop och korrekt segmentering av cellerna är nödvändigt för noggranna mätningar.
Syftet med detta projekt var att a illustrera en av standardprotokollen för kapsel induktion i C. neoformans, (ii) jämför och kontrast India färgpulver och fluorescens färgning som de tillhör för att kapsel diameter mätningar, (iii) utveckla enkla, kalkylmässiga metoder att mäta kapsel diameter använder bilder av India färgpulver färgade celler med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys, och, (iv) bedöma fördelar och begränsningar för att mäta kapsel diameter manuellt och använda programvara automation. Vi finner att av de två färgning metoderna, fluorescerande märkning av cellväggen och kapsel, medan mer tidskrävande, gav de mest konsekventa resultat mellan experiment. Men båda metoderna aktiverat oss att framgångsrikt skilja mellan lab och kliniska C. neoformans kapsel stammar uppvisar olika storlekar. Vidare kunde vi automatisera mätning av kapsel diameter från India färgpulver målat bilder och fann att detta var ett lönsamt alternativ till manuell mätning av kapsel.
Decennier, har kapseln varit ett stort fokus på forskning för både mykologer och kliniker intresserad C. neoformans och kryptokockos beror på dess roll som en större virulens faktor för patogen. Med mikroskopi att mäta skillnader i storlek mellan stammar och under olika tillväxt villkor kan ge viktig information om patogenen och dess svar på olika stimuli (dvs, det olika miljöförhållanden, potentiella läkemedelsbehandlingar, etc.) här har vi sammanställt en metod för att framkal…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Doktorsprogrammet molekylära biovetenskaper (MOBI) och avdelningen för biologi vid Middle Tennessee State University (MTSU) för att tillhandahålla finansiering för denna studie. Projektet var också delvis finansierad av ett specialprojekt bidrag till D.E.N. av stiftelsen MTSU.
Capsule Induction | |||
C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
Staining | |||
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
Image Acquisition | |||
Immersion oil | Cargille | 16484 | |
Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
Capsule Measurement | |||
Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |