Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

إجراء شامل تقييم أداء نيوفاسكولاريزيشن هيمانجيوبلاستوما المفترضة استخدام كروي تنتشر في التحليل في المختبر

doi: 10.3791/57183 Published: April 12, 2018

Summary

وتعرض هذه الورقة إجراء شامل لتقييم في المختبر ما إذا كان يوجد ورم الكلاسيكية تولد الأوعية في هيمانجيوبلاستوماس (HBs) ودورها في ميزانيات. وتسليط الضوء على الطابع المعقد لغبطة-نيوفاسكولاريزيشن النتائج توحي بأن هذا النموذج الموحد لتولد الأوعية فقط إليه تكميلية في غبطة-نيوفاسكولاريزيشن.

Abstract

المنظمة الجينات القامع الورم فون هيبل-لينداو (VHL) يلعب دوراً حاسما في تطوير هيمانجيوبلاستوماس (HBs) داخل النظام العصبي المركزي (CNS) البشرية. ومع ذلك، أصل الخلوية وعملية تطورية من ميزانيات (بما في ذلك نيوفاسكولاريزيشن) تظل مثيرة للجدل، والأوعية المناهضة ل VHL-HBs، استناداً إلى الكلاسيكية غبطة الأوعية، أسفرت عن نتائج مخيبة للآمال في التجارب السريرية. هو إحدى العقبات الرئيسية للترجمة السريرية الناجحة لعلاج الأوعية الدموية المناهضة الافتقار إلى فهم دقيق نيوفاسكولاريزيشن في هذا الورم والأوعية الدموية. في هذه المقالة، نقدم إجراء شامل لتقييم في المختبر ما إذا كان يوجد ورم الكلاسيكية تولد الأوعية في ميزانيات، فضلا عن دورها في ميزانيات. مع هذا الإجراء، يمكن أن دقة فهم تعقيد neovascularization غبطة الباحثين وتحديد وظيفة هذا النموذج الموحد للأوعية في ميزانيات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتقييم العلاج المضادة الأوعية الدموية الواعدة للأورام، التي لديها إمكانات متعدية الجنسيات عالية لعلاج الأورام أو للمعاونة في الاستغلال الأمثل لعلاج الأوعية المضادة HBs في المستقبل الترجمات. وتسليط الضوء على الطابع المعقد لغبطة neovascularization النتائج توحي بأن هذه الأوعية النموذج الموحد فقط إليه تكميلية في neovascularization غبطة.

Introduction

Hemangioblastomas (HBs) هي أورام حميدة في الأوعية الدموية التي تم العثور عليها حصرا داخل الإنسان الجهاز العصبي المركزي (CNS). أنها تتطور في المرضى الذين يعانون من مرض فون هيبل-لينداو (VHL) أو الآفات متفرقة. VHL-هكسابايت يصعب علاج من خلال العلاج الجراحي بسبب تكرار المتكرر والآفات المتعددة التي تنجم عن هذا الوراثية واضطراب1. على الرغم من أن المنظمة الجينات القامع الورم VHL اعتبرت السبب الجذري tumorigenesis VHL-هكسابايت، منشأ الخلوية (بما في ذلك نيوفاسكولاريزيشن) والعملية التطورية لميزانيات تظل مثيرة للجدل إلى حد كبير2. ولذلك، فهم أفضل للآليات البيولوجية غبطة-نيوفاسكولار قد توفر أفكاراً مفيدة في الأوعية الدموية المناهضة الاستراتيجيات الواعدة ل VHL-هكسابايت.

واقترحت البحوث التي أجريت مؤخرا أن غبطة-neovascularization مشابه لل4،فاسكولوجينيسيس امبريولوجيك3،5. الكلاسيكية والأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)-أدى إلى وساطة الأوعية التي نشأت من البطانة الوعائية والتي تحركها VHL فقدان الوظيفة في انتشار وتشكيل نيوفاسكولار، الذي كان تحدي6. في عام 1965، كانسيلا وزيمرمان وجدت، باستخدام المجهر الإلكتروني، التي نشأت من البطانة7. وتبين في وقت لاحق أن الخلايا اللحمية مستمدة من عنصر فاسوفورماتيفي8. في عام 1982، وجد ياركو et al. أن الخلايا اللحمية من أصل غشائي9. ولذلك، افترضنا أن الخلايا البطانية الوعائية البشرية هي الخلايا الأصلية لغبطة-نيوفاسكولاريزيشن10. على الرغم من أنه من الأفضل استخدام الثقافات الأولية من الخلايا HB المستمدة من VHL المرضى العمليات الجراحية، ابحاثنا السابقة وأشار إلى أن الثقافات الأولية من خضاب الدم ليست مستقرة، وخطوط الخلية لا يمكن أن تكون ثابتة3. وعلاوة على ذلك، ثقافات الأولية في بيئة 3D لم يتمكن من تحديد أصل غبطة-neovascularization الخلوية لأنها تشمل موروث من خضاب الدم والأوعية الدموية المكونات10،11. ولذلك كنموذج البدائية والكلاسيكية من خلايا بطانية، يمكن أن تخدم البشرية خلايا بطانية والأوعية الدموية (هوفيك) كنموذج بديل خلوية لميزانيات.

والرزن تبرعم كروي نموذج جديد في الأنسجة الهندسة12،13. في هذه الورقة، 3D على أساس الكولاجين كوكولتوري نظام في المختبر استخدام كروي تنتشر مقايسة وضعت، مع أحد الأهداف شاملة لتقييم ما إذا كان يوجد ورم الكلاسيكية تولد الأوعية في ميزانيات، فضلا عن دورها في ميزانيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكان تنفيذ هذا الأسلوب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة وأنظمة البحث أخلاقيات اللجنة من هواشان مستشفى جامعة فودان. وتلت تدابير السلامة القياسية المناظرة في كل خطوة. لعرض تقديمي تخطيطي، يرجى الرجوع إلى الشكل 1.

1-الخلية الثقافة وبناء بلازميد

  1. الاحتفاظ بشكل روتيني تعديل الخلية البشرية الوريد السري غشائي (هوفيك) في دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 100 وحدة/مل من البنسلين و 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين في هوميديفيد 5% CO2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. هضم بلازميد PLKO.1 مع أبي واكوري لتوليف بلغة شرنا. تأكد من تسلسل اليغنوكليوتيد ناقل شرنا VHL تتججتجتكتككاجاتكتتتتج ككججاتكتجاجاككاكككااتكتكجاجا14.
  3. ثم، مزيج 20 µΜ النظام مع الأمام ميليلتر 5 اليغو، 5 ميليلتر لعكس اليغو، 5 ميليلتر من 10 × NEB المخزن المؤقت و 35 ميليلتر من ddH2س معا (الحجم الإجمالي هو 50 ميليلتر). حرارة الخليط عند 98 درجة مئوية 4 دقيقة، وبطء باردة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة في بضع ساعات.
  4. سد أوليجوس ملدن وبلازميد PLKO.1 جنبا إلى جنب مع ليجاسى T4 عند 4 درجة مئوية لبين عشية وضحاها. في وقت لاحق، إضافة 16 ح 5 ميليلتر من المزيج ربط إلى 25 ميليلتر الخلايا DH5α المختصة. ثم شاشة والبلازميدات الواصلة بنجاح، والتحقق من بلغة المدرج بالتسلسل.

2-لينتيفيروس حزمة والعدوى

  1. وفي المجموع، مزيج 10 ميكروغرام ناقل PLKO.1-شفهل أو PLKO.1-شسكرامبلي و 7.5 ميكروغرام للتعبئة psPAX2 بلازميد 2.5 ميكروغرام من pMD2.G بلازميد المغلف في 500 ميليلتر دميم وسائل الإعلام دون الجنين المصل البقري (FBS) لمدة 25 دقيقة.
  2. إضافة ملدميم 7 دون FBS إلى الحل أعد أعلاه.
  3. ثقافة الخلايا 293 مترا في دميم دون FBS في أطباق زراعة الأنسجة قطرها 10 سم. تأكد من أن عدد الخلايا 293 مترا 1 × 107 باستخدام عداد خلية.
  4. أضف 1 مل من محلول إعداد أعلاه إلى متوسط الخلايا 293 مترا تعداء.
    ملاحظة: خط الخلية 293 مترا مشتق من خط خلية 293F وستابلي التعبير عن مستضد تي كبيرة SV40. ولذلك، فمن مضيف مناسب لإنتاج لينتيفيرال.
  5. استبدال المتوسطة الثقافة مع دميم التي تحتوي على 10% FBS بعد ح 6.
  6. جمع وسائل الإعلام باستخدام ماصة في ح 48 بعد تعداء.
    ملاحظة: الفيروس موجود في دميم التي تحتوي على 10% FBS. الخلايا الميتة تطفو على المتوسط. استخدم الغشاء معقم 0.45 ميكرومتر لتصفية الخلايا الميتة والشوائب. عموما، ليس هناك حاجة للتحقق من تعدد العدوى (وزارة الداخلية). وهذا لإنشاء خط خلايا مستقرة. في الخطوة الأخيرة، سوف يموت جميع الخلايا الحية دون الإصابة بنجاح قبل بوروميسين. مجموعة شسكرامبلي وخلايا هوفيك هي السيطرة على المجموعة. تأكد من أن كافة الخلايا هوفيك يموتون مع تركيز بوروميسين المستخدمة قبل ح 72. وقد كل بئر على نفس العدد من الخلايا.
  7. ثقافة الخلايا هوفيك في وسائل الإعلام لينتيفيرال لح 72. ثم إضافة بوروميسين لوسائل إعلام الخلايا هوفيك بتركيز 2 ميكروغرام/مل حاء 24 "هوفيك استخدام" الخلايا دون أي علاج كمجموعة المراقبة. ضمان جميع التحكم تموت الخلايا في هذا الوقت.
    ملاحظة: وتمثل الخلايا الحية خط خلية مستقرة VHL ضربة قاضية الخلايا والخلايا شسرامبلي. وتبلغ الكثافة الطلاء 5,000/بئر في لوحات 96-جيدا.

3-جيل الماغنيسيوم خلية غشائي

  1. تريبسينيزي الخلايا هوفيكس وريسوسبيند في المتوسط دميم مع 10% FBS. عدد معتدل من الخلايا في صحن ثقافة 10 سم، مع إضافة 1 مل من تيبسين-يدتا.
  2. بذور الخلايا في صفيحة 96-بئر القاع المستديرة 3D، في كثافة خلية3 1 × 10 خلايا/جيدا. استخدام جيدا التي يمكن أن تستوعب كروي من 0.50 ميليلتر بتعليق كروي. حساب عدد الخلايا باستخدام نظام عداد خلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 مستمر ح 72. في ظل هذه الظروف، كفالة أن تشكل الخلايا علقت الماغنيسيوم الخلية تلقائياً. استبدال نصف المتوسط الثقافة بعد 36 ساعة.

4. في المختبر فحص الأوعية

  1. ذوبان الجليد حل جل في 4 درجات مئوية، وتمييع مع المتوسطة المصل انخفاض بنسبة 1:5 إضعاف.
  2. مص الماغنيسيوم من المتوسط الثقافة دميم مع ميكروبيبيتي. بعد الغسيل الماغنيسيوم مع 5 مل من المصل انخفاض المتوسط، تعليق الماغنيسيوم بلطف وحذر في الهلام المخفف. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء.
  3. تضمين 300 ميليلتر من سائل مختلطة في صفيحة 15-جيدا. بعد حضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 1، إضافة 400 ميليلتر المصل انخفاض المتوسط لكل بئر. ملء الماء المعقم حول الآبار لتوليد بيئة هوميديفيد تعوق التبخر.
  4. وبعد ذلك، ثقافة لوحة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 في الرطوبة 100% ح 1.
  5. عناية نضح المتوسطة القديمة، واستبدله ب 600 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط مع ملاحق نمو الخلايا البطانية 1% في كل بئر.
  6. بعد ح 12 أو 24 ساعة، التقاط صور تحت مجهر خفيفة مقلوب (40 *).

5-بيانات التحليل

  1. تحميل الصور إلى منصة تحليل صور على شبكة إنترنت للحصول على بيانات الطول تنبت (جدول المواد).
  2. على صفحة ويب، قم بإنشاء حساب عن طريق البريد الإلكتروني.
  3. ثم تحميل الصور عن طريق النقر على زر التحميل.
  4. تحميل النتيجة بواسطة النقر فوق الزر تنزيل.
    ملاحظة: البرنامج سيولد صورة المجهزة والبيانات. تحتوي البيانات على خمسة أجزاء: طول تنبت التراكمي، تنبت متوسط الطول، الانحراف المعياري لطول تنبت وتنبت منطقة ومنطقة كروي. يرد في الصورة المجهزة، وكل معلمة بلون مختلف لتسهيل تحديد في الصورة المجهزة: براعم الأحمر يمثل الهيكل العظمى، وأصفر عدد براعم، الأزرق هيكل تنبت وتنبت بيضاء نهاية، وكروي برتقالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتؤخذ الصور الأصلية بالمجهر المقلوب الخفيفة. الصور النمطية للسيطرة على المجموعة والمجموعة VHL مبينة في الشكل 2-A1 و الشكل 2-A2. طول تبرعم من السيطرة على المجموعة أقصر من مجموعة VHL.

بعد تحميل الصور، يوفر منصة على الإنترنت تحليل النتائج مباشرة. الناتج يتكون من جزئين: الصورة المجهزة ونتائج التحليل المطابق. صور المجهزة من السيطرة على المجموعة ومجموعة الصمت الجينات VHL تتسم بألوان مختلفة (الشكل 2-A3 و الشكل 2-A4). طول تنبت يعني هو مكم 65 و 125 ميكرومتر في السيطرة على المجموعة والمجموعة VHL الصمت، على التوالي، وطول متوسط تنبت التراكمي هو مكم 680 و 1250 ميكرومتر في السيطرة على المجموعة والمجموعة VHL الصمت، على التوالي، مشيراً إلى أن تنبت يزيد الطول طيات حوالي اثنين في المجموعة الصمت VHL، مقارنة مع مجموعة التحكم (الشكل 2ب). تشير هذه النتائج إلى أن نقص VHL تعزز قدرة الخلايا البطانية البشرية المكونة للسفينة.

Figure 1
الشكل 1 . مخطط كروي تنتشر المقايسة. ويبين الخطوات 1 الخلايا هوفيك مثقف طبق. يتم نقل الخلايا هوفيك في الخطوات 2، الجولة-أسفل 96-جيدا لوحات ثلاثية الأبعاد ل 72 h. 3 خطوات يظهر شكل الخلايا هوفيك الماغنيسيوم غشائي الخلايا تلقائياً في لوحة ثلاثية الأبعاد. في 4 خطوات، إضافة خلية كروي لجل المخفف. في 5 خطوات، إضافة الخليط أعلاه على استعداد لصفيحة 15-جيدا. ويبين الخطوات 6 كروي تنتشر في لوحة 15-جيدا. تظهر الخطوات 7 تبرعم الصورة المتخذة تحت مجهر خفيفة مقلوب. الخطوات 8 يبين الصورة المحملة والخطوة 9 هو إخراج الصورة من المنصة (بار = 100 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . أثر VHL إسكات الجينات على قدرة الأوعية خلايا هوفيك في كروي تنتشر المقايسة. (أ) الصور التمثيلية من ثمرة صنبور بعد ح 12 في عنصر التحكم (A1) وإسكات VHL هوفيك الماغنيسيوم (A2) (بار = 100 ميكرومتر). A4 و A3 الأرقام تظهر الصور تحليلها من قبل النظام الأساسي للأرقام A1 و A2، على التوالي. يمثل الأحمر براعم هيكل عظمى، الأصفر عدد براعم، الأزرق هيكل تنبت وتنبت بيضاء نهاية، وكروي برتقالي. (ب) طول براعم. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t مزاوج الطالب. * تمثل ف < 0.05. يخدع، والمراقبة؛ هوفيك، الخلايا البطانية البشرية الوريد السري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الآونة الأخيرة، كانت تحفزها حقول متعددة من بحوث البيولوجيا الأوعية الدموية دراسة بطانة الأوعية15. في هذه المقالة، قمنا بتطوير كروي غشائي تنتشر تقنية كنموذج تجريبي لدراسة تشكيل السفينة التي تنبع من مورث VHL فقدان وظيفة في خلايا بطانية التلاعب بها لتحديد الجزيئات رواية مرشحة تتالي الأوعية. على حد علمنا، هذا هو أول تقرير لدراسة آثار الأوعية خلايا بطانية معدلة الفلزية.

نيوفاسكولاريزيشن الأنسجة (بما في ذلك ورم الأنسجة) هو عملية معقدة يحدث عن طريق الأوعية فاسكولوجينيك وآليات خلال التنمية، وكذلك في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية12،15 , 16-كروي تنتشر المقايسة تتميز بسلسلة معقدة من الأحداث17،18، بما في ذلك التجميع الذاتي من خلايا بطانية المضمنة في نظام ثقافة مصفوفة 3D خلية، الذي ينتج تنتشر واستنساخ 3D شبكة الشعيرات الدموية19. وأصبح هذا النموذج 3D كروي جزءا لا يتجزأ من جل نظام مستخدمة على نطاق واسع في هندسة الأنسجة لدراسة تشكيل الأوعية الدموية وآلياتها بسبب قدرته على توفير بيئة محاكاة أفضل في مصفوفة مناسبة. بيد أن الخطوة الأكثر أهمية من هذه العملية البيولوجية هو تفعيل خلايا بطانية هادئة17،20،،من21إلى22. في هذا الإجراء، تم تنشيط خلايا بطانية بإسكات الفلزية VHL الجينات، جينات منظم نمو نيوفيسيلس،من2324. مختلفة من البطانة الكلاسيكية بدء عبر تحريض خارجية من المصفوفة والبيئة خارج الخلية المقابلة (بما في ذلك الأوعية الدموية نمو عوامل خارجية)، هذا الأسلوب تم التعديل يمكن أن تمتد إلى العديد تطبيقات لكشف الآليات الوراثية الفلزية. المقبل، إلى التقليل من آثار المصفوفة خارجية، كان الأمثل البروتوكول بتمييع الجل، الذي كان خطوة بسيطة في التجربة. وباﻹضافة إلى ذلك، استغرق دقيقة فقط لتحميل الصور إلى منهاج العمل والحصول على نتائج التحليل. المنهاج يوفر خدمة تحليل صورة تسمح المجرب لجعل موضوعي وتحليل الصور قابلة للمقارنة، والآلي لتنتشر في تحليل الصور على الإنترنت. ولذلك، البروتوكول يتغلب على أخطاء القياس والحساب بسبب عوامل من صنع الإنسان.

فهم الخطوات الفردية لتتالي neovascularization الميكانيكية أساسا رشيداً لتطوير العلاج المضادة الأوعية الدموية التي هي حاليا الموافقة على التطبيق السريري في علم الأورام. أنشأت هذه الورقة نموذج تحليل القائم على كروي بسيطة وقوية لدراسة تشكيل السفينة التي تنشأ من خلايا بطانية التلاعب مع فقدان وظيفة الجينات VHL لتحديد الجزيئات رواية مرشحة نيوفاسكولاريزيشن تتالي، التي يمكن أن تستخدم للعديد من التطبيقات المتعلقة بالأوعية وفاسكولوجينيسيس. الكتاب التكهن بأن هذا النموذج في المختبر قد توفر معلومات إضافية للمساعدة في تقييم دور الأوعية في بعض الأورام الصلبة (مثلاً الورم فاسكولوجينيك تقليد) والتحقيق في الأدوار المحتملة للخلايا السلف المحتملة الأخرى لتولد الورم نيوفيسيلس في فيفو، وبخاصة في المرضى الذين يعانون من الأورام التي، كمجموعة، لا تستجيب للعلاج مع وكلاء مكافحة الأوعية فقط.

وقد أصبح الإنزيم تبرعم كروي أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لدراسة الأوعية والآليات ذات الصلة. الإنزيم يتمتع بميزة هامة عن طريق توفير بيئة تحاكي أفضل من ثقافات 2D الكلاسيكية. في الآونة الأخيرة، تم تطوير نماذج 3D الثقافة المشتركة لدراسة الأوعية الورم الذي يحاكي التباين والتعقيد من الأوعية داخل ورم المكروية25. وفي هذا النموذج، تستزرع خلايا بطانية مباشرة مع الخلايا السرطانية، فضلا عن عنصر stromal في بيئة ثلاثية الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت 3D في المختبر نظم الاستزراع تعكس بدقة أكبر في فيفو استجابة للعوامل العلاجية من نظم الثقافة التقليدية الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام هذا الأسلوب للتفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية ونمو الأنسجة والتئام الجروح، الاسكيمية والتهاب. بالمقارنة مع الأسلوب الكلاسيكي، النهج الذي نتبعه فعالة وسهلة التنفيذ. ونحن نعتقد أنها أداة مفيدة لدراسة الأوعية في المختبر، وهو يفتح بطريقة جديدة لفهم هذه العملية أفضل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل منح من لجنة شانغهاي للعلوم والتكنولوجيا (15411951800، 15410723200). الكتاب أود أن أشكر البروفيسور يومي ون والبروفيسور تشاو تشاو جامعة "إدارة فودان الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض" الخاصة بالمساعدة التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human umbilical vein endothelial cell Fudan IBS Cell Center FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium  Gibco 11995040
fetal bovine serum Gibco  26400044
PLKO.1-puro vector Addgene #8453
packing plasmid psPAX2  Addgene #12260
envelope plasmid pMD2.G Addgene #12259
3D round-bottom 96-well plates S-Bio MS-9096M
matrigel BD Biosciences 354234
Opti-MEM medium Gibco 31985-070 reduced serum medium 
15-well plate Ibidi 81501 Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements Sciencell #1052
10-cm culture dish Corning Scipu000813
Puromycin Gibco A1113802
typsin-EDTA Gibco 25200056
Automated Cell Counter System   BioTech
Image Analysis software  Winmasis http://mywim.wimasis.com 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361, (9374), 2059-2067 (2003).
  2. Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88, (5), 311-324 (2007).
  3. Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32, (1), 102-109 (2011).
  4. Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102 (2014).
  5. Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96, (2), 162-167 (2014).
  6. Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55, (6), 1358-1364 (1995).
  7. Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24, (4), 621-628 (1965).
  8. Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31, (6), 1528-1540 (1973).
  9. Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13, (1), 13-18 (1982).
  10. Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12, (8), 727-736 (2011).
  11. Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37, (3), 3765-3774 (2016).
  12. Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
  13. Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36, (3), 318-331 (2017).
  14. Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181, (2), 699-709 (2017).
  15. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, (8), 1202-1215 (2009).
  16. D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).
  17. Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42, (4), 498-505 (2009).
  18. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319, (16), 2409-2417 (2013).
  19. Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9, (5), 97019 (2014).
  20. Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (22), 8699-8704 (2012).
  21. Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5, (16), 1779-1787 (2006).
  22. Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26, (1), 51-60 (2009).
  23. Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56, (10), 2342-2351 (2017).
  24. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56, (11), 1242-1252 (1997).
  25. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7, (2), 30753 (2012).
إجراء شامل تقييم أداء نيوفاسكولاريزيشن هيمانجيوبلاستوما المفترضة استخدام كروي تنتشر في التحليل <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Chen, D., Chen, M., Ji, K., Ma, D., Zhou, L. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (134), e57183, doi:10.3791/57183 (2018).More

Wang, Y., Chen, D., Chen, M., Ji, K., Ma, D., Zhou, L. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (134), e57183, doi:10.3791/57183 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter