Ett omfattande förfarande för att utvärdera In Vitro den förmodade hemangioblastom kärlnybildning använder den sfäroid groning Assay
Summary
Detta dokument presenterar ett omfattande förfarande för att utvärdera i vitro om klassiska tumör angiogenes finns i hemangioblastomas (HBs) och dess roll i HBs. Resultaten belysa komplexiteten i HB-kärlnybildning och tyder på att denna vanliga form av angiogenes är endast en kompletterande mekanism i den HB-kärlnybildning.
Abstract
Inaktivering av von Hippel-Lindau (VHL) tumör suppressor genen spelar en avgörande roll i utvecklingen av hemangioblastomas (HBs) inom människans centrala nervsystem (CNS). Men både cytologiska ursprung och den evolutionära processen av HBs (inklusive kärlnybildning) förblir kontroversiell och anti-angiogenes för VHL-HBs, baserat på klassiska HB angiogenes, givit nedslående resultat i kliniska prövningar. Ett stort hinder för framgångsrik klinisk översättningen av anti vaskulär behandling är bristen på en grundlig förståelse av kärlnybildning i denna vaskulär tumör. I denna artikel presenterar vi ett omfattande förfarande för att utvärdera i vitro om klassiska tumör angiogenes finns i HBs, liksom dess roll i HBs. Med den här proceduren kan forskarna exakt förstå komplexiteten i HB kärlnybildning och identifiera funktionen av denna vanliga form av angiogenes i HBs. Dessa protokoll kan användas för att utvärdera de mest lovande anti vaskulär terapi för tumörer, som har hög translationell potential för tumörer behandling eller för medhjälp i optimering av anti-angiogena behandling för HBs i framtida översättningar. Resultaten belysa komplexiteten i HB kärlnybildning och tyder på att denna vanliga form angiogenes är endast en kompletterande mekanism i HB kärlnybildning.
Introduction
Hemangioblastomas (HBs) är godartade vaskulär tumörer som finns uteslutande inom det mänskliga centrala nervsystemet (CNS). De utvecklas hos patienter med von Hippel-Lindau (VHL) sjukdom eller sporadiska lesioner. VHL-HBs är svåra att bota genom kirurgisk behandling på grund av den täta återfall och multipla lesioner som resulterar från denna genetiska sjukdom1. Även om inaktivering av VHL tumör suppressor genen har ansetts vara grundorsaken till uppkomst av VHL-HBs, fortfarande cytologiska ursprung (inklusive kärlnybildning) och evolutionär process av HBs till stor del kontroversiella2. En bättre förståelse av HB-neovaskulär biologiska mekanismer kan därför innehålla nyttiga insikter i de mest lovande anti vaskulär strategierna VHL-HBs.
Nyare forskning har föreslagit att HB-kärlnybildning är liknande till den embryologiska vasculogenesis3,4,5. Klassiska vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF)-medierad angiogenes som härstammar från den vaskulära endotelet och som drivs av VHL funktionsförlust resulterade i spridning och neovaskulär-formationen, vilken har varit utmanas6. I 1965, Cancilla och Zimmerman hittade, med hjälp av elektronmikroskopi, som HBs härstammar från endotelet7. Det konstaterades senare att stromaceller härleds från vasoformative element8. 1982 fann Jurco et al. att stromaceller är av endothelial ursprung9. Därför hypotesen vi att mänskliga vaskulära endotelceller är de ursprungliga cellerna av HB-kärlnybildning10. Även om det är bättre att använda de primära kulturerna från HB celler från VHL patienten operationer, visade vår tidigare forskning att primära kulturer från HB inte är stabila, och cellinjer kunde inte vara etablerade3. Dessutom kunde de primära kulturerna i 3D-miljö inte identifiera HB-kärlnybildning cytologiska ursprung eftersom de innehåller föräldraparets HB-vaskulär ingredienser10,11. Därför, som en primitiv och klassisk modell av endotelceller, kan mänskliga vaskulära endotelceller (HUVEC) fungera som en alternativ cellular-modell för HBs.
Sfäroid groning analysen är en ny modell i tissue engineering12,13. I detta papper utvecklades en 3D kollagenbaserade coculture system i vitro med den sfäroid groning analys, med ett övergripande mål att utvärdera om klassiska tumör angiogenes finns i HBs, liksom dess roll i HBs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyligen har stimuleras flera fält av vaskulär biologi forskning av studien av angiogena endotel15. I denna artikel, vi utvecklat en endothelial sfäroid groning teknik som en experimentell modell att studera fartyget bildningen som påbörjar från den VHL-genen förlust av funktion i manipulerade endotelceller att identifiera nya kandidat molekyler av den angiogena cascade. Till bäst av vår kunskap är detta den första rapporten att undersöka angiogena effekterna av endogena modifierade end…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från Shanghai kommittén för vetenskap och teknik (15411951800, 15410723200). Författarna vill tacka Prof. YuMei Wen och Prof. Chao Zhao av patogen mikroorganism institutionen Fudan universitetet för sin tekniskt bistånd.
Materials
| human umbilical vein endothelial cell | Fudan IBS Cell Center | FDCC-HXN180 | |
| dulbecco’s modified eagle’s medium | Gibco | 11995040 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 26400044 | |
| PLKO.1-puro vector | Addgene | #8453 | |
| packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 3D round-bottom 96-well plates | S-Bio | MS-9096M | |
| matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985-070 | reduced serum medium |
| 15-well plate | Ibidi | 81501 | Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight |
| endothelial cell growth supplements | Sciencell | #1052 | |
| 10-cm culture dish | Corning | Scipu000813 | |
| Puromycin | Gibco | A1113802 | |
| typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Automated Cell Counter System | BioTech | ||
| Image Analysis software | Winmasis | http://mywim.wimasis.com |
References
- Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
- Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist’s viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
- Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
- Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102 (2014).
- Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
- Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
- Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
- Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
- Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
- Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
- Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
- Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
- Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
- Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- D’Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).
- Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).
- Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
- Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
- Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
- Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
- Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
