Monocyt-afledte DC (MoDC) kan føle mindre mængder af fare-associerede molekyler og er derfor let primet. Vi leverer en detaljeret protokol for dyrkning af MoDC fra blodet og tumorer og deres aktivering med immunkomplekser samtidig fremhæve vigtige forholdsregler, der bør overvejes for at undgå deres for tidlig aktivering.
Dendritiske celler (DC) er heterogene cellepopulationer, der adskiller sig i deres cellemembran markører, migrationsmønstre og distribution, og i deres antigen præsentation og T-celle aktivering kapacitet. Da de fleste vaccinationer af eksperimentelle tumor modeller kræver millioner af DC, er de meget isoleret fra knoglemarv eller milt. Disse DC varierer dog betydeligt fra blod og tumor DC i deres svar til immunkomplekser (IC), og formentlig til andre Syk-kombineret lektin receptorer. Vigtigere, givet følsomheden af DC til fare-associerede molekyler, tilstedeværelsen af endotoksiner eller antistoffer der bitmapgenkendelse aktivering receptorer i en af de isolere trin kunne resulterer i priming af DC og dermed påvirke parametrene, eller i det mindste dosering, krævede hen til aktivere dem. Derfor, her vi beskrive en detaljeret protokol til at isolere MoDC fra blodet og tumorer samtidig undgå deres for tidlig aktivering. Derudover tilbydes en protokol for MoDC aktivering med tumor IC, og deres efterfølgende analyser.
Siden deres opdagelse, har dendritiske celler (DC) været fokus på omfattende forskning på grund af deres unikke evne til at vride T-celle differentiering1. Over de sidste mange årtier, har en omfattende forskningsindsats forsøgt at definere de forskellige DC delmængder og deres funktion under tumor progression og immunitet 2. DCs er sammensat af heterogene cellepopulationer, der adskiller sig fra hinanden i deres mønstergenkendelse receptorer, væv distribution, og vandrende og antigen præsentation kapaciteter3,4,5. Sammenlignet med andre DC delmængder, monocyt-afledte DC (MoDC) er langt mere rigelige i tumorer og nemt kan genereres fra cirkulerende eller tumor infiltrerer monocytter6,7. Derfor, mange kliniske forsøg søger at drage fordel af deres relative forekomst er baseret på i vivo og ex vivo manipulation af autologe MoDC for at fremkalde T-celle immunitet 8,9.
På samme måde, DC-baserede vaccination af eksperimentelle tumor modeller kræver 2-3 serie injektioner, 5-7 dages mellemrum, 1-2 x 106 aktiveret DC pulserende med tumor antigener. Derfor, for at opnå dette store antal DC, de fleste mus undersøgelser har primært brugt MoDC kulturperler fra knoglemarv (BM) prækursorer i GM-CSF for 7-9 dage (IL-4 ikke er påkrævet i indstillingen mus)10,11. Ikke desto mindre, givet at GM-CSF knockout mus er samlet normal DC rum 12,13, og givet de blandede befolkninger fremstillet af denne kultur,14 fysiologiske relevansen af disse DC har blevet draget i tvivl.
Alternativt kan DC være rutinemæssigt isoleret fra milt celler. Men DC omfatter kun omkring 0,3-0,8% af samlede milt celler (resulterer i ca 7 x 105 DC/milten), og af disse celler, kun CD103+ DC og MoDC kan vandre tilbage til lymfoid organer. Da MoDCs omfatter ca. 10-15% af milt DC populationer15,16, give de fleste isolation protokoller ca 1 x 105 MoDC pr. milt. Udvidelse af MoDC kan opnås ved at indsprøjte transfekteret B16 celler, der udskiller GM-CSF, hvilket resulterer i en 100-fold stigning i milt MoDC17. Men brug af MoDC til at udvikle DC vacciner er begrænset, da denne procedure ikke kan gøres i mennesker og de opnåede MoDC er allerede stærkt aktiveret.
Ud over at opnå tilstrækkelig antal DC, indebærer en anden udfordring for at udvikle effektive DC vacciner mod autolog kræftceller manglen på tilstrækkelige faresignaler i indstillingen tumor fuldt aktivere DC. Induktion af co-stimulatory signaler er normalt opnås gennem aktivering af mønstergenkendelse receptorer (PRR), eller c-type lektin signaling veje18,19,20,21. En yderligere tilgang for aktivering DC udnytter deres evne til at tage op antigener gennem interaktioner med overflade Fcγ receptorer (FcγR). En række vigtige håndskrifter har vist, at injektion af MoDC fra BM prækursorer aktiveret hos tumor-IgG IC kan forhindre tumorvækst i profylaktisk indstillinger, og kan føre til udryddelse af etablerede tumorer22,23 .
I to nylige papirer opdagede Carmi et al. , at i modsætning til BMDC og milt DC, MoDC fra blodet og tumorer ikke kan reagere på IgG IC uden yderligere stimuli. Dette blev anset for at være på grund af tilstedeværelsen af høje intracellulære niveauer af tyrosin fosfataser regulerer FcγR signalering24,25. Ved at definere et kritisk kontrolpunkt i DC, gav dette arbejde et vigtigt indblik i kravene til vellykket DC-baserede vaccination. Kravet om for ekstra stimuli for at aktiverer FcγR signalering, og formentlig signalering fra andre lektin receptorer udnytter en lignende fosforylering kaskade, understreger således behovet for at undgå priming af DC under deres isolation.
Derfor, denne protokol beskriver isolation af MoDC fra blodet og tumorer, som afviger markant fra BM og milt DC, og fremhæver forholdsregler værd at overveje i løbet af processen.
Betragtning af det store antal DC kræves for vaccinering mus (ca 2-4 x 106 DC pr. en mus), de fleste af vaccination strategier i mus er baseret på dyrkning af DC fra BM og milt efterfulgt af deres ex vivo -aktivering. Men forsøg at aktivere tumor DC i vivo, ved hjælp af de samme betingelser for aktivering af milt og BM DC, ofte har været mislykket i at fremstille effektive immunitet. I de to efterfølgende publikationer, Carmi mfl. har fundet, at blod og tumor MoDC afviger betyd…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |