Summary
Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.
Abstract
Sepsis organ yetmezliği ve doku neden olabilir şiddetli enfeksiyon türüdür hasar. Mortalite ve morbidite oranları sepsis ile ilişkili, ancak son derece yüksek, hayır doğrudan tedavi vardır veya mekanizma organ ile ilgili ayrıntılı gerçek zamanlı olarak inceledi. Karaciğer toksinleri ve enfeksiyonlar insan vücudunda yönetir anahtar organdır. Burada, nötrofil ve karaciğer kapsüler makrofajlar (LCMs) gibi bağışıklık hücreleri hareket izlemek için fare karaciğer intravital görüntüleme sonra endotoksemi indüksiyon gerçekleştirmek amaçladık. Buna göre bir roman cerrahi yöntemi pozlama minimal invaziv cerrahi ile karaciğer için tasarlanmış. Fareler intraperitoneally ile lipopolysaccharide (LPS), bir ortak endotoksin enjekte edildi. Pozlama ve LPS tedavi LysM-yeşil flüoresan protein (GFP) fare karaciğer, o nötrofil bulduk alımı intravital görüntüleme için bizim yeni cerrahi yaklaşım kullanarak fare karaciğer bununla fosfat tamponlu göre artış serum fizyolojik tedavi karaciğer. LPS tedaviden sonra nötrofil sayısı önemli ölçüde zamanla arttı. Ayrıca, CX3Cr1-GFP fare kullanarak, biz başarıyla karaciğer ikamet makrofajlar LCMs adı görüntülenir. Bu nedenle, bağışıklık hareketlilik vivo içindekontrol etmek için yeni reaktifler etkinliğini araştırmak için hareketliliği ve nötrofil ve LCMs morfolojisi karaciğerde belirleme organ yetmezliği ve doku hasarı nedeniyle tedavi edici etkisi tanımamıza izin verebilir Sepsis lökosit etkinleştirme.
Introduction
Karaciğer önemli metabolik organ memelilerde olduğunu; enerji, hormonlar ve detoksifikasyon1için bir kontrol kulesi olarak görür. Onun önemi nedeniyle, araştırmacılar değişiklikleri karaciğerde iltihap sırasında aydınlatmak için birçok vitro ve in vivo deneyler yaptık. İntravital mikroskobu karaciğer2 canlı görüntüleri yakalamak için kullanılır. Gerçekten de,2,3,4,5,6çeşitli karaciğer görüntüleme yöntemleri olmuştur tanıttı. Ancak, daha basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşım geliştirmek ve sabitleme hedef organ ve bağışıklık hücreleri elde etmek için biz kendi çaba intravital görüntüleme için en aza indirmek araştırmacılar rehberlik eder basit bir protokol tasarlanmıştır.
Bu çalışmada, istikrarlı ve yeni görüntüleme odası ve kanama ve olası enfeksiyon en aza indirmek için kullanılabilir cerrahi tekniği tanıttı. Karaciğer daha 2 h için sağlam kaldı doğruladı. Bu yöntemle başarıyla türleri Morfoloji LCMs7 ve nötrofil septik koşul altında tanımlanan. Bu yöntem titreyen ve beklenmedik iltihabı gibi fiziksel ve biyolojik karıştırıcı faktörlerin cerrahi işlem sırasında en aza indirir bu yana, biz bu yöntemi yanıt olarak karaciğerde bağışıklık hücrelerinin akut reaksiyonlar gözlemlemek için kullanılan olabilir tahmin reaktifler LPS severim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kore kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. LysM-yeşil flüoresan protein (GFP; gfp / +) fareler8 ve CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 fare 8-12 hafta-in yaş, intravital görüntüleme için kullanılmıştır. Tüm cerrahi alet autoclaved ve % 70 alkol ile dezenfekte edildi.
1. özel tasarlanmış fare araçları destekleyici odası Imaging karaciğer
- Fare karaciğer odası tasarım görüntüleme
- Fare karaciğer (şekil 1) görüntüleme için aşağıdaki boyut TMMOB olun: iç Odası (120 mm Uzunluk × 160 mm genişlik × 30 mm yükseklik), dış Kamara (100 mm Uzunluk × 100 mm genişlik × 24 mm yükseklik), cıvata (Ф 3 mm × 30 mm yükseklik), fındık (Ф 4 mm) ve kanat şeklindeki fındık (Ф 4 mm).
- Kür Ajan ve elastomer 1:9 oranı temel silikon 120 g toplam yapmak için ölçmek.
- Sıvı silikon karışımı bir 250 mL Erlenmeyer şişeye koyun ve iyice karıştırın. Sonra bir desiccator şişeye koy ve hava kabarcıkları vakum altında yaklaşık 1 h için pompa ile kaldırın.
- 10 mm yükseklik gibi yüksek bir özel tasarlanmış fare odasına sıvı silikon karışımı dökün ve izin için bir kaç gün (şekil 1A) tedavi.
- Kapak slaytlar ve yatak sabitleme karaciğer hazırlanması
- Metal çerçeve üzerinde kapak cam silikon yapıştırıcı kullanarak ekleyin. 1 gündür (şekil 1B) kurumasını bekleyin.
- Etkili bir şekilde su daldırma lens için distile su tutmak için semipermanent su engelleme yapısı çok önemlidir. 1 mm silikon yapıştırıcı yuvarlama yapmak ve gecede sertleşmesine.
- Mix kür Ajan ve elastomer temel ve sonra içine 6-şey plaka bir yükseklikte, yaklaşık 8-10 mm. gerçekleştir sertleştirme işlemi 1.1.2-1.1.4 içinde açıklandığı gibi dökün.
2. LPS hazırlanması
- Steril 1 × fosfat tamponlu tuz (PBS) üzerinden Salmonella enterica serotip enteritidis LPS toz sulandırmak için hazırlayın. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4).
- PBS su banyosu 37 ° C'de ön ısı ve LPS toz şişe (25 mg) dikkatlice açın.
- Damlalıklı yardımların kullanılması, steril PBS (5 mL) LPS toz şişe içine dökün ve hafifçe karıştırın veya hisse senedi çözüm hazırlamak için çözüm askıya alabiliriz.
Not: LPS toz sıvılaşmış sonra sert vortexing kabarcıklar neden olabilir. Aliquots 1.5 mL tüplerde yaparken kaybı en aza indirgemek için baloncuklar yapmaktan kaçının. - −20 ° C de hisse senedi LPS çözüm depolamak ve enjeksiyon için 1 mg/mL LPS çözüm içine oranında seyreltin.
- 1 mg/mL LPS çözüm (20 mg/kg) 1-mL şırınga kullanarak bir sigara anestezi fare Periton enjekte. Denetim hayvan için PBS aynı hacmi enjekte.
- 2s için yeterli inflamatuar yanıt bekleyin.
3. kan damarları leke hazırlanması Texas-kırmızı Dextran
- İki 15 mL konik boru ve 10 mL steril PBS hazırlayın.
- Texas-kırmızı Dextran toz (25 mg) PBS 3 ml seyreltik ve iyice karıştırın. Karışımı bir boş 15 mL konik tüp aktarın.
- Kalan PBS (7 mL) dextran karışımı (3 mL) içeren 15 mL konik tüp aktarın.
- 0,45 µm şırınga filtre bir 10 mL şırınga ucunu bağlayın. Şırınga filtre iğne değiştirmeniz gerekir.
- Dextran karışımı (10 mL) filtre. Şırınga eşit dökülmesini önlemek için tuşuna basın.
- 2.5 mg/mL dextran çözüm ışık bloke 1.5 mL tüp içinde 500 µL dağıtmak ve −20 ° C. saklayın Bir kez çözdürülen, 4 ° C'de depolayın
4. cerrahi işlem
- Cerrahi tablo ve tüm aletleri ameliyat öncesi % 70 alkol kullanarak dezenfekte edin. Sonra karaciğer ameliyatı için araçları seti ve ısıtma yüzeyi 37 ° C (şekil 2A, B) için ayarlayın.
- Anestezi için 30 mg/kg tiletamine/zolazepam ve 10 mg/kg xylazine ile fareler intraperitoneally enjekte et. Bu çözümler karışık olabilir ve aynı anda enjeksiyon için PBS içinde seyreltilmiş. Anesthetization yavaşça fare ayak basarak onaylayın. Hiçbir refleks olduğunda sonraki adıma geçin.
- Fare'nın retina kuruluğu önlemek için göz merhem küçük miktarda uygulayın.
- Vücut saç saç dökücü krem (şekil 2C) kullanarak karın çevresinde kaldırın.
- Texas-kırmızı Dextran eriyik (2.5 mg/mL konsantrasyonu) kuyruk ven veya bir insülin şırınga (şekil 2B) kullanarak retro-orbital enjeksiyon yolu ile 200 µL enjekte.
- Şu subcostal alan bir marker ile işaretleyin. Çizgi xiphoid işleminden kaburga sonuna kadar çizilmiş olması. Forseps ve makas (şekil 2E, F) ile epidermis kesti.
- Karın boşluğu mikro-makas ve forseps kullanarak açın ve karaciğer dikkatle bulaşmasına neden. Sol yan lob pamuk temizleme bezi (Şekil 2 g, H) kullanılarak alınması.
- Steril PBS 500 µL kuruluk karaciğer önlemek için karın boşluğuna dökün.
- Özel olarak tasarlanmış odası sağ-decubitus konumda fareyi getirin ve doku yapıştırıcı az miktarda silikon yatağa uygulayın. Pamuk temizleme bezi (şekil 2I) kullanarak karaciğer yapıştırmanız dikkatle.
Not: karaciğer dokusu son derece kırılgan olduğundan, mekanik karaciğerinden çekmeyin. Yavaşça pamuk temizleme bezi ile tomar dışarı. - Birkaç saniye sonra Karaciğer karaciğer dışarı kurutma önlemek için steril PBS 500 µL ile tekrar ıslak. Metal çerçeve üzerinde karaciğer yerleştirin ve sıkıca fındık (şekil 2J) ile düzeltmek.
5. İki fotonlu mikroskobu ile karaciğer intravital görüntüleme
- ZEN yazılım (Carl Zeiss) üzerine lazer açmak, dalga boyunu ayarlamak için 880 nm ve set yeşil, çalıştırın ve kırmızı kanalları. Lazer güç floresan yoğunluğu (şekil 3A) göre ayarlayın. Emisyon filtre bilgi ise şöyle: yeşil/Alexa488, 500-550 nm ve kırmızı/Alexa 555, 575-610 nm.
- Odası görüntüleme sahnesinde yerini ve 20 X su-daldırma objektif lens kapağı cam yakın yerleştirin.
- Silikon kauçuk ısıtıcı (şekil 3B), vücut ısısını korumak için fare cesedi altında düzeltmek.
- 500 µL distile su üzerinde metal çerçeve bırakın ve sonra karaciğer (şekil 3 c) yakın objektif lens çekin.
- Derinlik ve saati görüntüleme alanını belirlemek ve odağı ayarlayın.
- Kuralları görüntüleme.
- Uzun vadeli görüntüleme için her saat görüntüleme sırasında yarım doz tiletamine/zolazepam ve xylazine karışımı enjekte et. Vücut ısısı 37 ° C'de farelerin Bakımı sırasında bu sahne çok önemlidir. Her zaman anesthetization zaman her fare farklılık fare için göz kulak ol.
Not: Bu yöntem cerrahi ve görüntüleme sonra kurtarma için uygun değildir. Etik fare hemen ameliyat sonrası kurban ediyoruz. - Kararlı anesthetization için her 30 dakika pedal refleksleri kontrol edin.
6. veri analizi
- Veri analiz yazılımı Volocity açın ve sonra kütüphanede ham veri yazılım alın.
- Gürültü durumu uygun ve bir anlık görüntü almak için görüntüden kaldırın.
Not: düzgün görüntü elde etmek, 'Para' veya 'Orta' filtresini kullanın. Ayrıca, karanlık ya da bulanık görüntülerin daha net yapmak için 'Kontrast geliştirme' özelliğini kullanın. - Anlık görüntüler için JPEG veya TIFF dosyalarını ve AVI dosyalarını filmler için % 100 ve ihracat için düzenlenmiş öğe sığar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basit ve çok kararlı görüntüleme odası geliştirildi. Odası alt fare vücudu ve organları kaymasını engelleyen silikon ile kaplıydı. Ayrıca, silikon elastikiyet doğru miktarda olduğundan, beklenen hasar kapak slayt (şekil 1A, C) basınç tarafından indüklenen engelleyebilir. İkinci, doku-kasa tutkal (veteriner bond)'i ayıklanan karaciğer daire şeklinde silikon yatağa düzeltmek için uygulandı. Bu yöntem kalp atışı ya da respirational hareketi neden titreyen önlemek için bize etkin. Son olarak, bir metal kapak slayt yerleştirilir ve somunlar fareler vücut büyüklüğü ve çıkıntılı karaciğer (şekil 1B-D) konumunu temel alan tarafından sabit. Anestezi düzgün gerçekleştirildiğinde, bu görüntüleme ayarları 6 h daha uzun sürebilir.
Ameliyat başlamadan önce fareler vücut sıcaklığı 37 ° C (şekil 2A) önceden ayarlanmış bir Isıtma odası hayvan yerleştirerek tarafından kontrol ediliyordu. Daha sonra ikincil enfeksiyonu önlemek için fare cerrahi ve görüntüleme için tüm gerekli araçları % 70 alkol ile sterilize edilmiş ve/veya ikincil enfeksiyon (2B rakam) önlemek için autoclaved olduğunu. Ardından, fare vücut saç, özellikle karın bölgesi, bir saç dökücü krem (şekil 2C) ile kaldırılmıştır. Kesi yapmadan önce cilt povidone iyot ile sterilize. Kan akımı Texas-kırmızı Dextran ile ven enjeksiyon yolu ile (şekil 2B) etiketli. De xiphoid süreci başladı ve sona erdi sağ kaburga bir çizgi çizilmiştir. Bu şu subcostal kesik çizgi kanama en aza indirmek yardımcı oldu. Bir neşter veya mikro-makas ile diseksiyon başladı; Karın çok fazla bağırsaklar sınırdışı karın boşluğu (şekil 2E, F) önlemek için açılmamış. Yağ ve doku katmanları forseps ve mikro-diseksiyon makası ile kaldırılmıştır ve kesi alan sterilize PBS ve pamuk temizleme bezi ile (Şekil 2 g) temizlendi. Sol yan lob, dört karaciğer lobları en büyük pamuk temizleme bezi ile çıkartılır ve doku bond (veteriner bond) kullanarak silikon yatağa bağlı. Karaciğer dokusu son derece kırılgan olduğu gibi karaciğer pamuk temizleme bezi (Şekil 2 H, ben) kullanarak taşındı. Metal kapak cam uygulandıktan sonra karaciğer Imaging'e maruz bırakıldı. Kuruluğu önlemek için steril PBS karaciğer ve cam (şekil 2J) arasındaki boşluğu uygulandı. Cam yüksekliği ile gerektiğinde fındık ayarlandı.
İki fotonlu mikroskobu donatılmıştır X, Y, ve Z eksenleri mikrometre denetleyicisi ve siyah perde (şekil 3A) ile korumalı. Lazer stabil Zen yazılım modunda kilitli. İstikrarlı görüntüleme elde etmek için hedef organ sürüklenen olmak önlemek. Bu nedenle, görüntüleme odası ve cerrahi yöntemi ek olarak, görüntüleme sahne uzak güvenli ve iyi organize edilmiş Yapışkan bantlar (şekil 3B) tarafından elektronik Isıtma yastığını teller vardı. Son olarak, distile su yeterli miktarda su daldırma lens (şekil 3 c) için kapak cam üst eklendi.
Kan akımı Texas-kırmızı Dextran intravenöz enjeksiyon sonra ekranda açıkça belirtilmiştir. Kırmızı ve yeşil aynı anda yakalamak için biz bir dalga boyu 880 ile görüntülemede gerçekleştirilen nm. İntravital görüntüleme analizine göre nötrofil uygun sayıda her zaman PBS koşulu kanda dolaşan. LPS nötrofil sayısı farelerde tedavi ise önemli ölçüde arttı. Bir sürü nötrofiller kan içinde dolaşan ama onlar gemi inflamatuar durumu dışında göç değil unutmayın. (Şekil 4A, takıma giren film 1). Nötrofil LPS tedavi edilen farelerde daha sıkıca nötrofil daha sık algılama gemi (4A rakam, takıma giren film 1) yapılan gemi luminal yüzeyine yapıştırılır. Nötrofil hareketliliği dışında LCMs CX3Cr1-GFP farelerde karaciğer dokusunun yerine (4B rakam) doku içinde derin yüzeyinde tespit edildi. LCMs küçük hareket ya da harekete geçirmek karaciğer LPS tedavi edilen farelerde bile gösterdi.
Resim 1 . Karaciğer odası ve yardımcı araçlar tasarımı. (A) silikon karışımı özel tasarlanmış fare odanın içine dökme. (B) boyutlarında metal kapak slayt (1 inç = 25,4 mm, Ф çapı =). (C) görüntü karaciğer odası özel tasarlanmış silikon elastomer ile dolu plastik gösterir. (D) diğer parçaları karaciğer odası araya kullanılmıştır. Sabitleme somunlar demirden yapılmıştır. Oklar belirtilen somunlar, sırasıyla, (C) ve (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Cerrahi adımları karaciğer ameliyatı için. (a) Metal ve kauçuk plakalar 37 ° C ve DC sıcaklık denetleyicisi ameliyattan önce Isıtma. (B) genel cerrahi ve karaciğer ameliyatı (a. pamuk çubukla ve konteyner, b. % 70 alkol, c. kağıt dokusu, ö. ustura, e. saç dökücü krem, f. özel tasarlanmış odası, g. cerrahi bant, h. ev yapımı karaciğer Kaide, ı. kanat fındık ve fındık, j. metal kapak için destek araçları Slayt, k. mikro-diseksiyon makası, l. forseps, m. makas, i. 3 mL şırınga, o. marker, s. 0.3 mL insülin şırınga, s. 1-mL şırınga). Yordam karaciğer ameliyatı (C-J) için. (C) uygulama saç dökücü krem karın sitesinde. (D) retro-orbital enjeksiyon Texas-kırmızı Dextran ile fare. (E) kesi site bir marker ile işaretleme. (F) epidermis forseps ve makas ile kesme. (G) bir kesi karın boşluğuna yapma. (H) sol yan lob hafifçe çekerek. (I) veteriner bond kullanarak karaciğer Kaide LOB ekleme. (J) final görüntüsünü ayarlayın. Fındık metal kapak slayta tespit edildi ve daha sonra kapak slayt Kelebek somun ile tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . İki fotonlu mikroskobu ve görüntüleme sahne ayarlarını. (A) İki fotonlu mikroskobu (LSM 7 MP) ve x ve y yönde taşıyabilirsiniz görüntüleme sahne görünümünü. (B) bir karaciğer görüntüleme odası ile yastık Isıtma bir lastik bant fare kullanacak bağlıydı. (C) bırakarak distile su ile objektif lens ve cam arasında bir pipet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Görselleştirme canlı fare Karaciğer karaciğer kapsüler makrofajlar ve nötrofiller. (A) odak anlık nötrofil LysM-GFP farelerin karaciğer genişletilmiş. Denetim görüntü PBS tedavi fareler oldu. LPS görüntü LPS tedavi fareler yapıldı. Görüntüleri bir 20 X kullanarak elde / 1.0 NA su-daldırma lens (görüş alanı [FOV] 424.3 µm × 424.3 µm, Derinlik = 40 µm, dilim aralığı = 1 µm, zaman aralığı = 60 = s, döngüsü = 31). Ölçek çubuğu 50 µm. (B) = iç ve yüzey alan anlık görüntüsünü LCMs CX3Cr1-GFP farelerin karaciğer. Görüntüleri bir 20 × / 1.0 NA su-daldırma lens ile elde (FOV 424.3 µm × 424.3 µm, Derinlik = 40 µm (iç) = / 10 µm (yüzey), dilim aralığı 1 µm, zaman aralığı = 60 = s (iç) / 20 s (yüzey), döngüsü = 31). Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Takıma giren film 1. PBS karşılaştırılması karşı tedavi LPS Karaciğer karaciğer tedavi. İki farklı koşullarda açık fark de görülmektedir. LPS tedavi karaciğer, nötrofil sayısı önemli ölçüde artırılır ve motilite azalır. Koşulların her ikisi de filmde kararlılığını görülmektedir. Kan akımı Texas kırmızı dextran ile etiketlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer aktif olarak birçok gruplar3,10, onun işlevini önemi nedeniyle tarafından incelenmiştir. Örneğin, Heymann vd. özel kullanarak hassas bir yöntem önerdi. Bu yöntem son derece kesin olarak bulundu rağmen özel ayar sürüyor. Ancak, bizim metodoloji ile tüm yordamları karıştırıcı diğer faktörler minimize 30 dk içinde yürütülen. Kalp atışı video rahatsız edemez çünkü İkincisi, karaciğer sabitleme son derece önemlidir. Bu olgu ortadan kaldırmak için biz fareyi sağ dekübitus pozisyona yeniden konumlandırılmış.
Bu iletişim kuralı bir kritik adım metal kapak çerçeve ve metal çubuk üzerindeki konumu üretim oldu. Friability Karaciğer karaciğer fiksasyon basınç uygun bir miktarda kullanarak uygun olarak üstesinden gelmek nasıl belirlemek için biz karşı en önemli engel oldu. Başlangıçta, sadece Kelebek somun kapak slayt tutun uygulandığı zaman, kan dolaşımını sekteye ve karaciğer kapak slayt ağırlığını tahammül edemedi. Bunun yerine, kapak slayt çubuğu boyunca yerleştirmeden önce cıvata aç için bir yöntem geliştirdi. Kapak slayt cıvata tarafından desteklenen karaciğer kalınlık ve bu vesile ile bazı yer verdi, sert karaciğer bastırın değil ve henüz denge ve fiksasyon yapılmaktadır. LysM-GFP fareler6kullanarak, bu tasarım görselleştirme nötrofil sinusoids ve merkezi damarlar izin verebilir doğruladı. CX3Cr1-GFP fareler5 de kullanılmıştır bu modelde LCMs. LCMs incelemek için sık sık karaciğer yüzeyinde bulundu.
Karaciğer Kaide veya silikon yatak yüksekliği de gerekli. Çok yüksek olsaydı, kan dolaşımını karaciğerde tahrip edilmesini. Karaciğer Kaide yüksekliğini çok düşük iken, karaciğer stabil fiksasyonu korumak zordu. Çünkü farklı vücut boyutları tüm fareler vardı, biz farklı yükseklikleri 6-şey plaka, hücre kültürü için kullanılan benzer kullanarak vardı silikon yatak üretti. Bu şekilde, biz odası her fare boyutuna göre özelleştirmek başardık. Özet olarak, biz bir roman ve basit iletişim kuralı morfolojisi araştırmak için fare karaciğer intravital görüntüleme ve inflamatuar koşullar altında karaciğerde bağışıklık hücreleri hareket için tasarlanmıştır.
Bu yeni iletişim kuralı akut bağışıklık yanıtı karaciğer gözlemlemek isteyen bu alandaki araştırmacılar için çok yararlı olabilir. Ancak, bu yöntemle, araştırmacılar doku yapıştırıcı ile karaciğer fiksasyonu nedeniyle 6 h daha uzun uzun vadeli görüntüleme kuralları olamaz. Bu iletişim kuralı tek seferlik bir tek yöntem ve bu nedenle, fare hemen sonra görüntüleme feda. Karaciğer silikon yatağından kesildi, karaciğer sonunda aşırı kanama ortaya çıkan yatağı çıkardı. Bu nedenle, ekleyen ve karın bölgesinin kalbinde dikiş imkansız gelecek gözlem için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Bu çalışmada bir hibe--dan Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti (MSIP; grant No 2016R1A2B4008199 Y-m tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir H.), Sağlık Bakanlığı ve refah, Güney Kore (sayı vermek: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
