Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Variationer på negativa fläcken elektronmikroskopi metoder: verktyg för att hantera utmanande system

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57199
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Astbury Biostructure Laboratory, University of Leeds

ERRATUM NOTICE

Summary

Negativa fläcken EM är en kraftfull teknik för att visualisera makromolekylära struktur, men olika färgning tekniker kan ge varierande resultat på ett prov sätt. Här beskrivs flera negativa färgning metoder i detalj för att ge en inledande arbetsflöde för att ta itu med visualisering av utmanande system.

Abstract

Negativa fläcken elektronmikroskopi (EM) tillåter relativt enkel och snabb observation av makromolekyler och makromolekylärt komplex med hjälp av kontrast öka fläcken reagens. Även om begränsade i resolution till maximalt ~ 18-20 Å, negativa fläcken EM är användbar för en mängd biologiska problem och ger också en snabb hjälp att bedöma prover för cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Det negativa fläck arbetsflödet är enkel metod; provet är adsorberas på ett substrat, då en fläck är tillämpas, utplånas, och torkas för att producera ett tunt lager av elektron tät fläcken där partiklarna är inbäddade. Enskilda prover kan dock uppträda på markant olika sätt under varierande färgning villkor. Detta har lett till utvecklingen av en stor mängd substrat tekniker för beredning, negativ färgning reagenser och rutnät tvätt och läska tekniker. Att bestämma den mest lämpliga tekniken för varje enskilt prov måste göras på grundval av fall och en botaniker måste ha tillgång till en mängd olika tekniker för att uppnå högsta kvalitet negativt fläcken resultat. Detaljerade protokoll för två olika substrat beredningsmetoder och tre olika blotting tekniker och visas ett exempel av ett prov som visar markant olika resultat beroende på vilken metod som används. Dessutom beskrivs beredning av vissa gemensamma negativa färgning reagenser och två nya Lanthanide-baserade fläckar, med diskussion om användningen av varje.

Introduction

Trots senaste uppmärksamhet till resolutionen fläcken revolutionen som följd av betydande framsteg i cryo-elektron mikroskopi1 (cryo-EM), negativa EM förblir en kraftfull teknik och en avgörande del av elektron microscopists' verktygslåda. Negativ färgning är fortfarande den bästa metoden för snabb bedömning av ett prov innan optimera cryo-grid villkor2. Hög kontrast och hastigheten på rutnätet beredning av negativa färgade prover gör den idealisk för att bedöma provet renhet, koncentration, heterogenitet och konfirmerande flexibilitet3. Många biologiskt informativ strukturer har resulterat från negativa fläcken rekonstruktioner, trots teknikens upplösning begränsas till ~ 18 Å upplösning4,5,6, och några prover ger bättre resultat i fläcken än cryo-EM för en mängd skäl7.

I negativa fläcken EM, är partikeln sevärdheter adsorberas på ytan av ett EM rutnät och omsluten av en amorf matris av elektron tät fläcken förening. En hög relativ kontrast produceras mellan bakgrunden och partikeln av intresse, med partikeln är mindre tät elektron än den omgivande fläck8. Partiklarna visas som ljusa områden på grund av deras låga elektron scattering makt i förhållande till täta omgivande fläcken, som skingrar elektronerna mer och visas mörkare. Substructural funktioner av partiklar kan härledas från en detaljerad granskning av resulterande bilder eftersom fläcken kommer att tränga in i varje skreva och producera oregelbundna kontrast detalj9.

Negativ färgning processen börjar med utarbetandet av ett stöd substrat som provet partiklarna fångas och lagret av torkade fläcken stöds. Vanligaste stöd substratet är ett lager av amorft kol, ibland stöds av ett tunt lager av polyvinylklorid (e.g. Formvar) eller nitrocellulosa (e.g. kollodium) polymer. Dessa substrat kan köpas kommersiellt eller förberett internt med de protokoll som beskrivs nedan.

När stöd substratet bereds, provet kan tillämpas och den överflödig lösningen utplånas. Prover bör upphöra i en lämplig buffert för negativ-färgning. Det är bäst att undvika användning av fosfatbuffert och hög salt koncentrationer, som kan ge upphov till kristallina fällningar som kan skymma preparatet. Reduktionsmedel, rengöringsmedel, sackaros, glycerol och höga koncentrationer av nukleotid bör också undvikas eftersom de påverkar också fläcken kvalitet4. När bufferten sammansättning kan inte ändras, tvätta ytan av rutnätet EM med vatten eller en mer lämplig buffert efter adsorption och före färgning kan minska bildandet av buffert relaterade artefakter och generellt förbättra fläck bakgrunden. Om buffert artefakter misstänks, kan det vara informativt att färga ett buffert-endast rutnät för att avgöra om buffert komponenterna är källan till de observerade artefakterna.

Efter provet adsorberas, och utplånas och tvättas vid behov, används en färgning reagens. En mängd reagens har visat sig vara effektiva negativa fläckar (tabell 1), men fläcken måste väljas för att passa provet. En 'halo' fläck former runt partikeln på grund av både förskjutningen av fläcken molekylerna av hydrofoba regionerna av protein och repulsion av laddade grupper. Fläcken måste därför väljas så att den protonation staten i några potentiella laddade grupper på proteinet är samma som fläcken på arbetande pH. Motsatta laddningar på ytan av proteinet kan bidra till en positiv färgning effekt, som trots en användbar teknik i sin egen rätt10 inte är omfattas av detta papper. De vanligaste negativa färgning reagenserna är uranyl acetat och uranyl formate. Dessa fläckar har en relativt fin kornstorlek (4-5 Å)9 och ge högre upplösning bilder över andra fläckar såsom phospho-wolframater (8-9 Å kornstorlek)9,11, ammonium molybdat11och några lanthanide-baserade fläckar12. Uranyl acetat och formate också fungera som ett fixativ, bevara många protein-protein interaktioner på en millisekund tid skala13, även om fläcken och dess benägenhet att fällningen vid Fysiologiskt pH lågt pH kan vara skadlig för vissa prover14 . Trots deras nytta presentera uranyl saltar också logistiska utmaningar som de är både giftig och milt radioaktivt, vilket kan kräva särskild hantering, lagring, och bortskaffande krav, vilket leder vissa användare att söka icke-radioaktiva alternativ.

Det finns en stor mängd olika metoder beskrivs för substrat förberedelse, exempelprogrammet och färgning av EM rutnät. Den lämpligaste metoden att använda är provet beroende och kan vara svårt att fastställa när du hanterar ett nytt system. Detta manuskript beskriver två metoder för substrat beredning och tre blotting metoder; sida blotting, snärta5och snabb spolning15. Sida-analys är den enklaste av de metoder som beskrivs. Både metoden snärta och snabba bokföringsmetoden är svårare att genomföra men begränsa kontakttiden av provet med stöd filmen innan fixering och har visat sig lindra bildandet av fläcken artefakter för vissa prover5. Målet med detta manuskript är således att ge en inledande arbetsflöde för att ta itu med visualisering av utmanande system av negativ-fläcken EM.

Protocol

1. beredning av EM nät

  1. Balansräkningsmetoden med kol
    1. Förbereda ett nymalet klyvs glimmer blad.
      1. Sätt försiktigt in en precision sprutans nål eller ett rakblad i ena hörnet av bladet glimmer, några mm mellan lagren. Sätt i verktyget som nära vertikala centrum av bladet som möjligt att producera två bitar av ungefär samma tjocklek.
      2. Prise försiktigt isär de två halvorna av bladet glimmer. Göra detta kan genom ögat, eller under en dissekera Mikroskop.
      3. Skär av ett av hörnen av varje av nyligen klyvs glimmer arken. I händelse av att bladet blir i kol förångare under vakuum release, kan den kol belagd baksida identifieras.
    2. Placera klyvs glimmer blad/s i kammaren av en kol förångaren, med den nybakade avspjälkar ytan vänd uppåt.
    3. Kontrollera kol förångaren är upplaggd korrekt med en ordentligt förberedda kol elektroden.
      Obs: Metoden för att förbereda kolstavar varierar beroende på specifikationerna för kol förångaren. Ett protokoll för ett instrument är följande tills steg 1.1.5.
      1. Vässa en carbon spö med en vässare till har en vass spets och sedan polera den med en pappershandduk för att avlägsna eventuella grov grader.
      2. Med fint sandpapper platta i slutet av en andra spö och igen polska det smidigt med en pappershandduk.
      3. Placera de två kolstavar in i förångaren enligt tillverkarens anvisningar. Säkerställa vässade slutet på den första spö gör fast kontakt med tillplattad ansiktet av andra stången.
    4. Placera en liten bit av rent, torrt filterpapper delvis under glimmer om kol tjocklek kommer att mätas visuellt. Alternativt kan du placera en vit frostat objektglas med en liten sandskädda av vakuum fett tillsammans med den glimmer att mäta kol tjocklek.
    5. Deponera koldioxid på glimmer enligt tillverkarens anvisningar.
      1. Pumpa vakuum ner och vänta tills det är vid 10-5 mbar. Ställ in spänningen av elektroden till 4.0 V (upp till 5 V kan krävas beroende på kol spö källan).
      2. Kör flera korta pulser av ungefärligt 3.5 s varaktighet genom elektroden att deponera 1-2 nm tjocka evaporations av kol på glimmer ytan.
        Obs: Som nuvarande appliceras till kol stången kommer att glöda röd och sedan vit. Titta inte på det starka ljuset eftersom detta kan skada dina ögon.
      3. Låt kolet att deponera på glimmer tills önskad tjocklek uppnås, mätt genom kol förångarens tjocklek mätaren eller genom visuell observation av det kol som deponeras på filterpapper eller objektglas. Säkerställa att det slutliga kol lagret är 5-10 nm tjock.
        1. Om kol tjockleken är mätas visuellt jämföra den frostade delen av de objektglas bestruket med vakuum fett att det utsatta området, kommer det att bli mörkare som mer kol är deponerat.
          Obs: Det finns ingen kvantitativ metod att bestämma kol tjocklek när du använder denna metod.
    6. Ventilera vakuumkammare och avlägsna den kol-belagd glimmer från kol förångaren.
      Obs: Den kol-belagd glimmer kan vara kvar att bosätta sig över natten innan du fortsätter med efterföljande steg
    7. Använd någon av de två vattenbehållare för att flyta kol filmen på EM rutnäten: en behållare med en dräneringsventil i botten så vattnet kan tömmas och kol lagret sänkte vidare till väntar på gallren eller en lyftande rigg som rutnäten kan ställas in på under vattnet yta, som kan därefter höja rutnäten upp till kol filmen på vattenytan.
    8. Fyll behållaren med ultrarent destillerat vatten så att ytan av vattnet är ca 5 mm från toppen. Ren ytan med vatten genom att dra ett blad eller två av lins vävnad över ytan för att ta bort någon flytande partiklar.
    9. Placera en bit av ren rostfritt stål mesh (1 tum 2,5 inches är lämplig storlek) under ytan av vattnet.
    10. Med ett par fina pincett, lekmanna-ren, torr EM rutnät ansikte upp (enligt tillverkarens beskrivning) på rostfritt stål mesh. Packa rutnäten tillsammans så tätt som möjligt, men inte tillåter dem att överlappa.
    11. När näten är ordnade, fast grepp kol bestrukna glimmer bladet i ett par pincett eller film utveckla tång.
    12. Införa glimmer bladet i vattnet. Se till att detta görs på ett mycket grunt (~ 10 graders vinkel).
      Obs: Glimmer bör bryta igenom vattenytan och dränka, medan kol filmen bör separat från glimmer och flyta på vattenytan. Detta steg bör inte utföras direkt över gallren, för att undvika skada eller kontaminering.
      1. För att minimera möjligheten av carbon film kommer inte separera från bladet glimmer, Poäng runt kanten på bladet glimmer med ett rakblad eller avskuren ett hörn med liten sax innan införs det i vattnet.
    13. När kol filmen har lossnat, avlägsna glimmer eller låta det falla till botten av behållaren.
    14. Med fina lutad pincett, mycket skonsam tryck och med långsamma rörelser vägleda kol filmen över toppen av rutnäten.
    15. Ta bladet kol i kontakt med ytan av rutnäten antingen genom långsamt dränera vattnet eller höja lyftande ringen, beroende på vilken typ av apparat som används.
    16. Lyft försiktigt rostfritt stål mesh (nu med kol-belagd nät) från apparater och wick bort några av överflödigt vatten med en bit filtrerpapper. Se till att detta görs genom att röra pappersfiltret till kanten av armeringsnät men inte kommer i kontakt med den stödraster eller carbon film.
    17. Placera stödraster maskorna i en petriskål som innehåller en torr bit filtrerpapper och låt den torka helt.
      Obs: Detta är bästa påverkas av torkning över natten i rumstemperatur, men steget kan påskyndas genom att placera gallren i en ugn vid ca 60 ° C.
  2. Float och kappa (direkta kol deposition). Denna metod har beskrivits i detalj tidigare16
    1. Fyll helt rena stora skål till brädden med destillerat vatten så en menisk bildar överst.
    2. Tillämpa en enda droppe kollodium lösning (nitrocellulosa i amyl acetat) på ytan av vattnet med en ren pasteur-pipett, tillåta droplet-programmet att sprida och torka helt. När torr kommer att tunt med kollodium flytande ovanpå vattenytan vara synlig.
    3. Ta försiktigt bort kollodium lagret med en tandpetare för att ta bort damm eller andra föroreningar från ytan av vattnet.
    4. Applicera en andra kollodium droplet till vattnet och låt den sprida och torka i 2-3 minuter.
      Anm: Upprepa steg 1.2.3-1.2.4 tills en platt och rynkor gratis ark kollodium erhålls.
    5. Med ett par fina pincett plats EM rutnät nedåt (enligt tillverkarens beskrivning) på flytande kollodium arket. Packa rutnäten tillsammans tätt i en sexkantig array, men inte tillåter dem att överlappa.
      Obs: Om ett rutnät är felplacerad eller placeras upp och ner är det generellt bäst att lämna den plats i stället för risk skadar kollodium arket när du försöker flytta den.
    6. När alla gallren är placerade, försiktigt lägga ett ark filtrerpapper över dem. Låt papperet bli mättad av kapillärkraften.
      Obs: Valfri storlek eller tjockleken på filterpapper är lämpligt om det helt täcker rutnäten.
    7. Använda en tandpetare för att ta bort någon kollodium film som sträcker sig bortom pappersfiltret.
    8. Grepp filterpappret vid kanten och skala den från vattenytan.
      Obs: Rutnäten bör bo klibbade till papper.
    9. Placera papperet platt och kollodium-ansikte upp i en petriskål och låt det torka helt.
    10. Placera filterpappret med rutnäten i kammaren av en kol förångare med en ordentligt förberedda kol elektroden som beskrivs i 1.1.2.
    11. Följ kol avdunstning proceduren som beskrivs för metoden kol ark i
  3. Tillåt flera sekunder mellan pulser att undvika överhettning och skadar bladet nitrocellulosa.
    Obs: Om så önskas polymerskikt kan tas bort efter rutnäten har kol belagda, men detta är sällan nödvändigt. Placera den stödraster kol Sidan upp på ett färskt filter papper och sätta flera droppar aceton på papperet nära, men inte på, gallren. Tillåta aceton att sprida ut under gallren och upplösa och absorbera polymerskikt.

2. beredning av negativ färgning reagenser

  1. Beredning av Uranyl acetat
    1. Ta en liten volym av ultrarent vatten till en koka och låt det koka i 10 min till grundligt degas. Låt den svalna något och sedan använda den för att upplösa uranyl acetat (UA) på 1-2% (w/v).
      Obs: Utför denna procedur i ett dragskåp och med lämplig personlig skyddsutrustning.
    2. När lösningen har svalnat, filtrera genom ett 0,2 µm spruta filter eller filterpapper.
    3. Lagra på UA skyddas från ljus och på 4 ˚C. Lösningen är stabil i upp till 1 år.
  2. Beredning av Uranyl Formate från pulver. Denna metod har beskrivits i detalj tidigare8
    1. Lös 20 mg uranyl formate (UF) pulver i 2 mL kokt avgasade ultrarena vatten (som i steg 2.1.1) genom omrörning.
    2. Samtidigt som man rör om, tillsätt 8 µL 5 M NaOH, lösningen bör ändra till en mörkare gul färg, men ingen fällning bör bilda.
    3. Filtrera lösningen genom ett 0,2 µm spruta filter.
    4. Store UF fläcken skyddas från ljus. Kassera fläcken bör om någon fällning eller brun missfärgning observeras. Lösningen är bara stabil i 1-2 dagar.
  3. Beredning av Uranyl Formate från Uranyl acetat
    1. Fällningen 1 mL 1% (w/v) UA fläcken genom att lägga till 100 µL av 1 M NaOH.
    2. Centrifugera blandningen i 2 min på högsta hastighet i en bänkmonterade centrifug.
    3. Ignorera alla supernatanten och lös upp utfällningen i 100 µL av 5% (v/v) myrsyra genom kraftig skakning.
    4. Späd till en slutlig volym av 1 mL med 900 µL ultrarent vatten att ge UF fläcken i 0,5% (v/v) myrsyra.
    5. Store UF fläcken skyddas från ljus. Kassera fläcken om någon fällning eller brun missfärgning observeras.
  4. Beredning av andra färgning reagenser
    1. Beredning av Lanthanide acetat fläckar
      1. Lös upp Samarium acetat (SmAc), Gadolinium acetat (GdAc), tulium acetat (TmAc) eller Erbium acetat (ErAc) 1-2% (w/v) i ultrarent vatten.
        Obs: Om prover visar positiv färgning eller dålig följsamhet till elnätet när du använder dessa fläckar, de kan vara surgjorts med upp till 0,5% (v/v) myrsyra. Positiv färgning resulterar i provet som visas som ett mörkt objekt omges av en vit Gloria. Dålig följsamhet till elnätet kommer att resultera i färre molekyler än förväntade observeras på nätet.
    2. Beredning av ammoniummolybdat och natrium Phosphotungstate
      1. Lös upp fläcken på 1-3% (w/v) i ultrarent vatten. Justera pH till 7,0 med 5 M NaOH om så önskas.

3. absorberande prover till kolet substrat och färgning

  1. Beredning av rutnät ytan för exempelprogrammet genom att göra det Hydrophilic
    1. Placera rutnätet uppåt på ett objektglas i en glöd urladdningsenhet.
    2. Behandla rutnätet för minst 30 s vid 10 mA.
      Obs: Den exakta metoden för glöd ansvarsfrihet beror på specifikationerna för en viss typ av utrustning som används.
    3. Alternativt kan detta åstadkommas genom UV-bestrålning i 10 minuter med en bänkmonterade UV lampa4.
  2. Sida Blotting metod. Denna metod har beskrivits i detalj tidigare8
    1. Greppa kanten av rutnätet med ett undertryck pincett, och gälla stödytan 3-5 µL av provet.
    2. Låt provet adsorberas till rutnätet ytan för 10 s till 1 min. optimera adsorption tiden måste för enskilda prover.
    3. Tryck på kanten av rutnätet på ett ark filtrerpapper och tillåta kapillärkraft att dra bort vätskan.
    4. Tillval: Tvätta rutnätet. Plats 50 µL droppar ultrarent vatten eller lämpligt flyktiga buffertlösning på ett laboratorium film. Försiktigt rör kol ytan av rutnätet till droppa och lyft av en liten droppe på ytan av rutnätet. Tryck på kanten av rutnätet på ett ark filtrerpapper och tillåta kapillärkraft att dra bort vätskan.
    5. Upprepa detta tvätta så många gånger som önskas.
    6. Plats två 50 µL droppar färgning reagens på ett laboratorium film.
    7. Försiktigt rör kol ytan av rutnätet till droppa och lyft av en liten droppe på ovansidan av rutnätet.
      Obs: Om fläcken migrerar till baksidan av rutnätet sedan rutnätet ska kasseras.
    8. Tryck på kanten av rutnätet på ett ark filtrerpapper och tillåta kapillärkraft att tappa upp vätskan. Utföra denna färgning steg två gånger.
    9. Tillåta rutnätet till luft torr eller torrt under en glödlampa.
  3. Snärta metod
    1. Greppa kanten av rutnätet med ett undertryck pincett, och gälla stödytan 3-5 µL av provet.
    2. Innehav av pincetten i ena handen, så att nätet är vinklad i ungefär 45° vänd bort, snabbt svepa handleden av handen till 'flick off' majoriteten av droplet-programmet som är på toppen av rutnätet.
    3. Valfritt: Med hjälp av ett glas Pasteur-pipett Applicera en droppe tvättlösning till stödytan och 'svep bort' som i 3.2.2. Upprepa vid behov.
    4. Med ett glas Pasteur-pipett Applicera en droppe färgning reagens till stödytan och 'flick off' som i 3.2.2. Upprepa 1 - 3 gånger beroende på fläcken djup krävs för visualisering av preparatet.
      Obs: Detta är inte den enda faktor som attribut till slutliga fläcken djup (se diskussion).
    5. Ta bort överflödigt fläcken genom att röra vid den rivna kanten av en papperslapp filter till kanten av rutnätet.
    6. Tillåta rutnätet till luft torr eller torrt under en glödlampa.
  4. Snabb Bokföringsmetod
    1. Dra 30-70 µL av fläcken (1% UA vanligtvis används) till toppen av en 200 µL pipett, vrid volym ratten för att utarbeta 5 µL av luft och sedan rita upp tvätt/blandning reagens (5-30 µL), om krävs, följt av en annan liten luftspalt och sedan rita upp 5 µL prov.
    2. Grepp i utkanten av ett rutnät med ett undertryck pincett, höll pincetten så att rutnätet är vinklad i ungefär 45° vänd bort från forskaren, mata ut hela innehållet i pipettspetsen över hela ansiktet av rutnätet kol-belagd EM.
    3. Ta bort överflödigt fläcken genom att röra vid den rivna kanten av en papperslapp filter till kanten av rutnätet.
    4. Tillåta rutnätet till luft torr eller torrt under en glödlampa.
      Obs: För alla metoder är det lämpligt att Skjut rivna kanten av ett ark filtrerpapper längs tången tills det når rutnätet som detta tar bort lösningen fångade mellan de två sidorna av tången, som kan dra torkade rutnätet i käftar tången när de är öppnas. Rutnätet i pincetten kan också placeras på kanten av dragskåp torka. Det konstant luftflödet kan hjälpa till att producera mer även färgning.

Representative Results

Alla färgning reagenser testas producerade negativ färgning till viss del, med UF framställning av prov med den största kontrasten och skarpaste, mest detaljerade partiklar. För djupt inbäddade prover (figur 1) lanthanide baserat fläckar ErAc och TmAc produceras negativ färgning av likvärdig kvalitet till UA som bedöms av uppenbar kontrast och skärpa av färgade partiklar, producerar med TmAc tydligare, mer skarpa bilder än ErAc. TmAc större kornstorlek blir uppenbara med hög förstoring, när tobak Mosaic Virus (TMV) partiklar var fläckade av 1% TmAc den ~ 23 Å upprepa TMV partikelns17 var fortfarande klart synlig genom ögat och som meridional lager linje i den Fouriertransformen av raw-bild. Ingen av de andra lanthanide fläckar testades, ErAc, SmAc eller GdAc, var kunna lösa den här funktionen. Klass medelvärden genererades genom att extrahera överlappande segment från TMV partiklar där den spiralformade upprepa var synlig. Extraherade segmenten anpassades sedan och klassificeras med hjälp av RELION18 bättre visualisera funktionen periodiska (figur 2).

Några prover är särskilt känsliga för metoden för färgning, såsom muskeln härrör C-protein. C-protein, som består av en flexibel sträng av Ig och Fn-liknande domäner, producerar betydligt olika bilder av negativ-fläcken EM beroende på metoden för färgning används (figur 3). När metoden sida-analys, kollapsade observeras ringliknande strukturer, medan när färgas av snabb spolning eller snärta metoder, C-protein observeras som en serie av domäner som liknar pärlor på ett snöre.

Reagens Koncentration pH Typ
Ammoniummolybdat 1 - 2% 5 – 7 Anjon
Erbium acetat (ErAc) 1 – 2% 6 Katjoniska
Gadolinium acetat (GdAc) 1 – 2% 6 Katjoniska
Metylamin volframhaltigt 2% 6 – 7 Anjon
Samarium acetat (SmAC) 1% 6 Katjoniska
Natrium silicotungstate 1 – 5% 5 – 8 Anjon
Natrium phosphotungstate 1 -3% 5 – 8 Anjon
Tulium acetat (TmAc) 1 – 2% 6 Katjoniska
Uranyl acetat (UA) 1 – 3% 3 – 4 Katjoniska
Uranyl Formate (UF) 0,75-1% 3 – 4 Katjoniska

Tabell 1: Några vanliga negativa färgning reagenser.

Figure 1
Figur 1: exempel micrographs av tobak Mosaic Virus färgas med olika negativa fläcken reagenser (A) 1% UF (B) 2,5% TmAc (C) 2,5% ErAc. (D) 1% UA (E) 2,5% GdAc och F 2,5% SmAc. Skala barer är 100 nm. Representativa bilder från flera replikat med flera områden avbildas per replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: färgning tobak Mosaic Virus med tulium Acetat (A) hög förstoring av området från en Mikrograf av TMV färgas med 1% TmAc. Skalstapeln är 20 nm. (B) klass genomsnittet av extraherade TMV segment. (C) fouriertransformen av bilden i panel A visar lager line reflektioner ~ 23 Å. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: effekterna av blotting metod på konformation av C-protein. (A) C-protein färgas med UA med hjälp av sida blot metod och (B) snärta metod. Övre panelen skalstapeln är 50 nm, nedre panelen skalstapeln är 20 nm. Representativa bilder från flera replikat med flera områden avbildas per replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta manuskript beskrivs flera metoder för negativ färgning av prover för elektronmikroskopi med hjälp av olika färgning reagenser, inklusive två roman lanthanide reagens (TmAc och ErAc). Många av stegen i den negativa färgning processen måste optimeras för enskilda prover inklusive valet av fläcken, mängden tvätt krävs om någon och blotting tekniken. Detta manuskript ger därmed en grund för microscopists att utveckla sina egna arbetsflöden för att hantera de negativa-färgningen av utmanande system.

Valet av fläcken är mycket prov beroende. Prover som är särskilt känsliga för lågt pH kan försämras av UA eller UF, trots dessa fläckar19fixativ egenskaper. I dessa fall baserat lanthanide fläckar såsom TmAc eller ErAc kan vara mer lämpligt, även om den övergripande pH av preparatet måste hållas under den isoelektriska punkten av proteinet prov för att förhindra positiv färgning. Detta kan åstadkommas genom försurande fläcken med ättiksyra vid behov. För särskilt lågt pH känsliga prover, kan anjoniska volframhaltigt eller molybdat fläckar vara mer effektiva. Även om dessa fläckar har hittats inducera bildandet av artefakter i vissa fall, såsom bildandet av rouleaux i lipoprotein prover20. Igen, pH-värdet i fläcken kan behöva justeras, denna gång till ovanför den isoelektriska punkten av provet, förhindra positiv färgning.

Tvätt av provet före färgning kan behövas om bufferten där preparatet underhålls har en hög salt- eller fosfathalter komponent. I många fall tvätt kan utföras med ultrarent vatten men för mer känsliga prover, som kan försämra eller genomgår strukturella förändringar när de utsätts för enbart vatten, tvätt kan behöva utföras med flyktiga buffert av låg jonstyrka8. Även under noggrant kontrollerade förhållanden, kan tvätt resultera i vissa strukturella rearrangering på kol yta21.

Metoden som ett rutnät är beredd när det gäller prov adsorption, blotting och färgning kan också påverka vad som observerats. Den lämpligaste metoden är således igen, mycket prov beroende. C-protein, till exempel noteras som en klotformig ringliknande struktur efter sida-blot färgning, men detta verkar vara en artefakt av färgning processen, som avslöjas när galler är beredda av metoden snärta (eller av den snabba bokföringsmetoden) (figur 3 ). I de snabba och snärta bokföringsmetoder, den tid provet att interagera med kolet stödytor före fixering är minimerade15. Provet erfarenheter också färre krafter från den vikande menisken på blotting före fixering. Detta innebär att strukturella förändringar i preparatet som kan uppstå vid långvarig absorption tid på carbon film eller genom kapillärkraften minimeras. Snabb bokföringsmetoden kan också användas för tid-löst analys av prover. Provet kan blandas med en ligand eller tillsats inom en pipettspetsen för en uppsättning under en tid innan ansökan till ett rutnät eller endast tillfälligt på rutnätet ytan före fixering inom millisekunder.

Djupet av fläcken som krävs för att ge optimala bilder av ett särskilt exemplar är igen prov beroende2. Om fläcken är för grunt, molekyler kan skadas av elektronstrålen men om fläcken är för tjock strukturella funktioner kan gå förlorade. Fläcken djup påverkas av flera faktorer såsom hydrophilicitet rutnät ytan, jämnhet av lagrets kol, mängden fläcken tillämpas på rutnätet, tiden fläcken är i kontakt med rutnätet före blotting, omfattningen av blotting och tid det ta KES för rutnätet till helt torra. Ett rutnät kommer aldrig att ha en jämn fördelning av fläcken i sin helhet och områden i rutnätet som är lämplig för avbildning måste därför väljas noggrant. Faktiskt, gridteknik ofta varierar i kvalitet även när tillagas samma dag på samma villkor. Ett bra exempel på hur variation i fläcken djup påverkar uppkomsten av molekyler och lämpliga fläcken djupet för imaging ges av Burgess et al5.

Trots negativ färgning att en mycket mångsidig, snabb och enkel metod, är inte alla biologiska prover mottagliga för visualisering av denna metod. Bräckliga församlingar kan kollapsa eller ta isär vid adsorption, färgning eller torkning på EM rutnät22. Negativ färgning kan också leda till utplaning av molekyler och inducera Rekommenderad riktlinjer av molekyler på kol stöd film7.

Negativa fläcken är ett värdefullt verktyg för bedömning av exemplar i sin egen rätt och även före cryo-EM analys men många av de fysiska krafterna provet uppstår under processen är dåligt känd. Därför, den bästa metoden att använda är mycket prov beroende och måste fastställas genom trial-and-error i stället för lärs ut efter ett fast protokoll.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi är ytterst tacksamma för Peter Knight för bra diskussioner och kritisk granskning av manuskriptet. Vi vill tacka alla ledamöter av Neil Ranson och Stephen Muench labs och Astbury Biostructure laboratorium personal för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats av Europeiska forskningsrådet (FP7/2007-2013) ERC bevilja avtal 322408. C-protein producerades med hjälp av resurser som tillhandahålls av en brittisk hjärtat Foundation grant (BHF PG/13/83/30485). Vi tackar också Wellcome Trust för utrustning finansiering för att stödja elektronmikroskopi i Leeds (090932/Z/09/Z och 094232/Z/10/Z). CS är finansierat av Wellcome Trust ISSF bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh copper EM grids Sigma-Aldrich G4776-1VL Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate Sigma-Aldrich 277908
Carbon evaporator Ted Pella Inc. 9620 Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate Sigma-Aldrich 9817
Dumont #5 negative pressure tweezers World Precision Instruments 501202 Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate Sigma-Aldrich 325570
Gadolinium Acetate Sigma-Aldrich 325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. AGAR Scientific AGG250-1
Microscope slides, white frosted Fisher Scientific 12607976 Or equivalent
Parafilm Fisher Scientific 10018130 Or equivalent
Pasteur pipette (glass) Fisher Scientific 10343663 Or equivalent
Razor blade Fisher Scientific 11904325 Or equivalent
Sandpaper Hardware store Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate Sigma-Aldrich 325872
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462
Sodium Phosphotungstate Sigma-Aldrich P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size). AGAR Scientific AGG252
Thulium Acetate Sigma-Aldrich 367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods Ted Pella Inc. 57-10 Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22450
Vacuum grease Fisher Scientific 12719406 Or equivalent
Whatman #1 Filter paper. Fisher Scientific 1001 090 Or equivalent
Whatman #40 filter paper Fisher Scientific 10674122 Or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  2. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  3. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  4. Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
  5. Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
  6. Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
  7. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  8. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
  9. Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
  10. Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
  11. Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
  12. Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
  13. Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
  14. Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
  15. Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179 (2015).
  16. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  17. Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
  18. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
  19. Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  20. Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
  21. Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
  22. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).

Tags

Biokemi fråga 132 elektronmikroskopi negativa fläcken biologiska TEM Blotting elektronmikroskopi grids kol beläggning

Erratum

Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 01/30/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Matthew G. Iadaza

to:

Matthew G. Iadanza

Variationer på negativa fläcken elektronmikroskopi metoder: verktyg för att hantera utmanande system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G.,… More

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. J. Vis. Exp. (132), e57199, doi:10.3791/57199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter