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Biochemistry

नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों पर रूपांतरों: चुनौतीपूर्ण प्रणालियों से निपटने के लिए उपकरण

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57199
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Astbury Biostructure Laboratory, University of Leeds

ERRATUM NOTICE

Summary

नकारात्मक दाग EM macromolecular संरचना visualizing के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन अलग धुंधला तकनीक एक नमूना निर्भर तरीके से परिणाम अलग उत्पादन कर सकते हैं । यहाँ कई नकारात्मक धुंधला दृष्टिकोण चुनौतीपूर्ण प्रणालियों के दृश्य से निपटने के लिए एक प्रारंभिक कार्यप्रवाह प्रदान करने के लिए विस्तार से वर्णित हैं.

Abstract

नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के विपरीत बढ़ाने के उपयोग के माध्यम से अपेक्षाकृत सरल और अणुओं और macromolecular परिसरों की त्वरित अवलोकन की अनुमति देता है दाग एजेंट । हालांकि संकल्प में सीमित ~ 18-20 Å की एक अधिकतम करने के लिए, नकारात्मक दाग उंहें जैविक समस्याओं की एक किस्म के लिए उपयोगी है और यह भी क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) के लिए नमूनों का आकलन करने का एक तेजी से साधन प्रदान करता है । नकारात्मक दाग कार्यप्रवाह सीधी विधि है; नमूना एक सब्सट्रेट पर adsorbed है, तो एक दाग लागू किया जाता है, blotted, और इलेक्ट्रॉन घने दाग में कणों एम्बेडेड रहे हैं की एक पतली परत का उत्पादन करने के लिए सूखे. व्यक्तिगत नमूनों सकते हैं, तथापि, स्पष्ट रूप से अलग तरह के तहत धुंधला परिस्थितियों में व्यवहार करते हैं । यह सब्सट्रेट तैयारी तकनीक, नकारात्मक धुंधला रिएजेंट, और ग्रिड धोने और सोख्ता तकनीक की एक बड़ी विविधता के विकास के लिए प्रेरित किया है । प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए सबसे उपयुक्त तकनीक का निर्धारण एक मामले पर किया जाना चाहिए-मामले के आधार और एक माइक्रोस्कोपी विभिंन तकनीकों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाना चाहिए उच्चतम गुणवत्ता नकारात्मक दाग परिणाम प्राप्त करने के लिए । दो अलग सब्सट्रेट तैयारी विधियों और तीन अलग सोख्ता तकनीक के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती हैं, और इस्तेमाल किया विधि के आधार पर स्पष्ट रूप से अलग परिणाम से पता चलता है कि एक नमूना का एक उदाहरण दिखाया गया है. इसके अलावा, कुछ आम नकारात्मक धुंधला रिएजेंट की तैयारी, और दो उपंयास Lanthanide आधारित दाग, प्रत्येक के उपयोग के बारे में चर्चा के साथ वर्णित है ।

Introduction

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी1 (क्रायो-em) में महत्वपूर्ण प्रगति से उत्पंन संकल्प क्रांति के लिए हाल ही में ध्यान के बावजूद, नकारात्मक दाग उंहें एक शक्तिशाली तकनीक और इलेक्ट्रॉन ' सूक्ष्मदर्शी उपकरण बॉक्स के एक महत्वपूर्ण घटक रहता है । नकारात्मक धुंधला अभी भी क्रायो-ग्रिड स्थितियों के अनुकूलन से पहले एक नमूने के तेजी से मूल्यांकन के लिए सबसे अच्छा तरीका है2। उच्च विपरीत और नकारात्मक दाग नमूनों की ग्रिड तैयारी की गति यह नमूना शुद्धता, एकाग्रता, विविधता, और गठन के लचीलेपन का आकलन करने के लिए आदर्श बनाता है3. कई जैविक जानकारीपूर्ण संरचनाओं नकारात्मक दाग पुनर्निर्माण से हुई है, तकनीक के संकल्प के बावजूद ~ 18 Å संकल्प4,5,6, और कुछ नमूनों उपज बेहतर परिणाम क्रायो से दाग में7कारणों की एक किस्म के लिए उंहें ।

नकारात्मक में दाग उंहें, ब्याज के कण एक EM ग्रिड की सतह पर adsorbed है और इलेक्ट्रॉन घने दाग यौगिक की एक अमली मैट्रिक्स द्वारा ढंक । एक उच्च सापेक्ष विपरीत पृष्ठभूमि और ब्याज के कण के बीच उत्पादन किया है, कण के साथ जा रहा है कम इलेक्ट्रॉन आसपास के दाग की तुलना में घने8। कणों क्योंकि उनके कम इलेक्ट्रॉन तितर बितर बिजली के सापेक्ष घने दाग है, जो इलेक्ट्रॉनों तितर बितर और अधिक गहरा दिखाई देता है के रूप में प्रकाश क्षेत्रों में दिखाई देते हैं । कणों की उपसंरचनात्मक सुविधाओं को किसी भी दरार में घुसना और अनियमित विपरीत विस्तार9का उत्पादन होगा के रूप में परिणामी छवियों की विस्तृत परीक्षा से मुजे किया जा सकता है ।

नकारात्मक धुंधला प्रक्रिया एक समर्थन सब्सट्रेट जिस पर नमूना कणों पर कब्जा कर रहे हैं की तैयारी के साथ शुरू होता है, और सूखे दाग की परत का समर्थन किया । सबसे अधिक इस्तेमाल किया समर्थन सब्सट्रेट polyvinyl की एक पतली परत (जैसे कि Formvar) या nitrocellulose (उदा Collodion) बहुलक द्वारा समर्थित अमली कार्बन की एक परत है । इन सब्सट्रेट वाणिज्यिक या तैयार घर में नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर खरीदा जा सकता है ।

समर्थन सब्सट्रेट तैयार होने के बाद, नमूना लागू किया जा सकता है, और अतिरिक्त समाधान बंद blotted. नमूने नकारात्मक दाग के लिए एक उपयुक्त बफर में निलंबित कर दिया जाना चाहिए । यह फॉस्फेट बफर और उच्च नमक सांद्रता, जो कि नमूना अस्पष्ट कर सकते हैं क्रिस्टलीय हाला को जन्म दे सकते हैं के उपयोग से बचने के लिए सबसे अच्छा है । एजेंटों, डिटर्जेंट, सुक्रोज, ग्लिसरॉल, और न्यूक्लियोटाइड के उच्च सांद्रता को कम करने से भी बचा जाना चाहिए के रूप में वे भी दाग गुणवत्ता4प्रभावित करते हैं । जब बफर संरचना को बदला नहीं जा सकता है, पानी या सोखना के बाद एक अधिक उपयुक्त बफर के साथ EM ग्रिड की सतह धोने और धुंधला करने से पहले बफर संबंधित कलाकृतियों के गठन को कम करने और आम तौर पर दाग पृष्ठभूमि में सुधार हो सकता है । बफ़र कलाकृतियों संदिग्ध हैं, तो यह बफ़र घटक मनाया कलाकृतियों का स्रोत हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए एक बफ़र-केवल ग्रिड दाग करने के लिए जानकारीपूर्ण किया जा सकता है ।

के बाद नमूना adsorbed है, और blotted और धोया यदि आवश्यक हो, एक धुंधला एजेंट लागू किया जाता है । विभिन्न प्रकार के रिएजेंट के लिए प्रभावी नकारात्मक दाग (तालिका 1) पाया गया है, लेकिन दाग को नमूने के अनुरूप चुना जाना चाहिए । एक ' हेलो ' कण के चारों ओर दाग रूपों के hydrophobic क्षेत्रों द्वारा दाग अणुओं के विस्थापन के कारण चार्ज समूहों द्वारा प्रोटीन और प्रतिकारक । इसलिए, दाग चुना जाना चाहिए ताकि प्रोटीन पर किसी भी संभावित आरोप लगाया समूहों की प्रोटॉन राज्य काम पीएच पर दाग के रूप में ही है । प्रोटीन की सतह पर विपरीत शुल्क एक सकारात्मक दाग प्रभाव है, जो अपने आप सही में एक उपयोगी तकनीक का योगदान कर सकते है10 इस कागज के दायरे में नहीं है । सबसे अधिक इस्तेमाल किया नकारात्मक धुंधला रिएजेंट uranyl एसीटेट और uranyl स्वरूप हैं । ये दाग एक अपेक्षाकृत ठीक अनाज आकार (4-5å) 9 है और ऐसे phospho के रूप में अंय दाग पर उच्च संकल्प छवियों-tungstates (8-9 åअनाजआकार) 9, 11,अमोनियम molybdate 11, और कुछ lanthanide आधारित प्रदान दाग12. Uranyl एसीटेट और प्रारूपण भी एक निर्धारण के रूप में कार्य करते हैं, एक मिलीसेकंड समय स्केल13पर कई प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के संरक्षण, हालांकि दाग के कम पीएच और शारीरिक पीएच में वेग के लिए अपनी प्रवृत्ति कुछ नमूनों के लिए हानिकारक हो सकता है14 . उनकी उपयोगिता के बावजूद, uranyl साल्ट भी सैंय चुनौतियों वर्तमान के रूप में वे दोनों विषाक्त और हल्के रेडियोधर्मी हैं, जो विशेष हैंडलिंग, भंडारण, और निपटान आवश्यकताओं, जो कुछ उपयोगकर्ताओं को गैर रेडियोधर्मी विकल्प प्राप्त करने के लिए सुराग की आवश्यकता कर सकते हैं ।

वहां सब्सट्रेट तैयारी, नमूना आवेदन, और EM ग्रिड के धुंधला के लिए वर्णित तरीकों की एक बड़ी विविधता है । उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि नमूना निर्भर है और जब एक नई प्रणाली से निपटने का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है । इस पांडुलिपि सब्सट्रेट तैयारी और तीन सोख्ता तरीकों के दो तरीकों का वर्णन; साइड सोख्ता,5फ़्लिक कर रहा है, और तेजी से निस्तब्धता15। साइड-सोख्ता बताई गई विधियों का सरलतम है. दोनों झाड़ू विधि और तेजी से निस्तब्धता विधि को लागू करने के लिए और अधिक कठिन हैं, लेकिन निर्धारण से पहले समर्थन फिल्म के साथ नमूना के संपर्क समय सीमा और कुछ नमूनों के लिए दाग कलाकृतियों के गठन में उंनति करने के लिए दिखाया गया है5. इस पांडुलिपि का लक्ष्य इस प्रकार है नकारात्मक-दाग उंहें द्वारा चुनौतीपूर्ण प्रणालियों के दृश्य से निपटने के लिए एक प्रारंभिक कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं ।

Protocol

1. EM ग्रिड की तैयारी

  1. कार्बन शीट विधि
    1. एक हौसले से सट मीका शीट तैयार करें ।
      1. धीरे एक परिशुद्धता सिरिंज सुई या मीका शीट, परतों के बीच में कुछ मिमी के एक कोने में एक उस्तरा ब्लेड डालें । लगभग बराबर मोटाई के दो टुकड़ों का उत्पादन करने के लिए संभव के रूप में चादर के ऊर्ध्वाधर केंद्र के पास के रूप में उपकरण डालें ।
      2. ध्यान से मीका शीट के दो हिस्सों के अलावा prise । इस आंख से, या एक विदारक खुर्दबीन के नीचे कर सकते हैं ।
      3. कट से प्रत्येक के कोनों में से एक नए सट मीका शीट्स । इस घटना में है कि चादर कार्बन वाष्पन में वैक्यूम रिलीज के दौरान बदल जाता है, शीट के कार्बन लेपित पक्ष पहचाना जा सकता है ।
    2. एक कार्बन वाष्पीकरण के चैंबर में सट मीका शीट/एस प्लेस, हौसले से सट सतह के साथ ऊपर का सामना करना पड़ ।
    3. सुनिश्चित करें कि कार्बन वाष्पीकरण सही ढंग से तैयार कार्बन इलेक्ट्रोड के साथ सेट अप है ।
      ध्यान दें: कार्बन छड़ तैयार करने की विधि कार्बन वाष्पन के विनिर्देशों के आधार पर भिंन होगा । एक उपकरण के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में कदम 1.1.5 जब तक निंनानुसार है ।
      1. एक तेज टिप है एक चोखा के साथ एक कार्बन रॉड पैनापन और फिर यह एक कागज तौलिया के साथ पोलिश किसी भी किसी न किसी burrs को दूर करने के लिए ।
      2. का प्रयोग ठीक सैड एक दूसरी छड़ी के अंत समतल और फिर यह एक कागज तौलिया के साथ चिकनी पॉलिश ।
      3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाष्पर में दो कार्बन छड़ प्लेस । पहली रॉड पर तेज अंत सुनिश्चित करें दूसरी रॉड के चपटा चेहरे के साथ फर्म से संपर्क करता है ।
    4. अगर कार्बन मोटाई नेत्रहीन गेज किया जा रहा है, मीका के तहत आंशिक रूप से साफ, सूखे फिल्टर कागज का एक छोटा सा टुकड़ा रखें । वैकल्पिक रूप से, कार्बन मोटाई गेज करने के लिए मीका के साथ वैक्यूम तेल की एक छोटी सी ढाब के साथ एक सफेद फ्रॉस्टेड माइक्रोस्कोप स्लाइड प्लेस ।
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मीका पर जमा कार्बन ।
      1. वैक्यूम नीचे पंप और जब तक यह 10 पर है रुको-5 mbar । ४.० वी करने के लिए इलेक्ट्रोड की वोल्टेज सेट (अप करने के लिए 5 वी कार्बन रॉड स्रोत के आधार पर आवश्यक हो सकता है).
      2. चलाने के लिए इलेक्ट्रोड के माध्यम से अवधि में लगभग ३.५ एस के कई छोटे दालों भागो मीका सतह पर कार्बन के 1-2 एनएम मोटी वाष्पीकरण जमा करने के लिए ।
        नोट: के रूप में वर्तमान कार्बन रॉड यह लाल और फिर सफेद चमक जाएगा करने के लिए लागू किया जाता है । यह तुंहारी आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में चमकदार रोशनी में घूरना मत करो ।
      3. कार्बन वाष्पीकरण मोटाई गेज द्वारा मापा या फिल्टर कागज या माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जमा कार्बन का दृश्य अवलोकन द्वारा, के रूप में वांछित मोटाई तक पहुँच गया है जब तक कि अभ्रक पर जमा करने के लिए अनुमति दें । सुनिश्चित करें कि अंतिम कार्बन परत 5-10 एनएम मोटी है ।
        1. यदि कार्बन मोटाई गेज नेत्रहीन उजागर क्षेत्र के लिए वैक्यूम तेल के साथ लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड के फ्रॉस्टेड हिस्सा तुलना, यह और अधिक कार्बन जमा हो जाता है के रूप में गहरा हो जाएगा ।
          नोट: इस विधि का उपयोग करते समय कार्बन मोटाई निर्धारित करने के लिए कोई मात्रात्मक विधि है ।
    6. वैक्यूम चैंबर वेंट और कार्बन वाष्पन से कार्बन लेपित अभ्रक हटा दें ।
      नोट: कार्बन लेपित अभ्रक बाद कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले रातोंरात बसने के लिए छोड़ दिया जा सकता है
    7. दो पानी कंटेनरों में से एक का प्रयोग करें EM ग्रिड पर कार्बन फिल्म फ्लोट: तल पर एक नाली वाल्व के साथ एक कंटेनर तो पानी बाहर सूखा जा सकता है और कार्बन परत का इंतजार ग्रिड या लिफ्टिंग रिग कि ग्रिड पानी के नीचे पर सेट किया जा सकता है पर कम सतह है, जो बाद में ग्रिड पानी की सतह पर कार्बन फिल्म को बढ़ा सकते हैं ।
    8. ultrapure आसुत जल के साथ कंटेनर भरें ताकि पानी की सतह के ऊपर से लगभग 5 मिमी है । सतह पर एक चादर या लेंस ऊतक के दो खींचकर किसी भी चल कण को हटाने के द्वारा पानी की सतह को साफ ।
    9. साफ स्टेनलेस स्टील जाल का एक टुकड़ा प्लेस (२.५ इंच द्वारा 1 इंच एक उपयुक्त आकार है) पानी की सतह के नीचे ।
    10. ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, साफ करना, सूखी EM ग्रिड चेहरा (निर्माता के वर्णन के अनुसार) स्टेनलेस स्टील मेष पर । ग्रिड एक साथ पैक के रूप में संभव के रूप में कसकर, लेकिन उंहें ओवरलैप करने की अनुमति नहीं है ।
    11. एक बार ग्रिड की व्यवस्था कर रहे हैं, मजबूती से पकड़ चिमटी या फिल्म टोंगों के विकास की एक जोड़ी में कार्बन लेपित अभ्रक शीट ।
    12. पानी में मीका शीट परिचय । सुनिश्चित करें कि यह एक बहुत उथले कोण पर किया जाता है (~ 10 डिग्री) ।
      नोट: मीका पानी की सतह और जलमग्न के माध्यम से तोड़ चाहिए, whilst कार्बन फिल्म मीका से अलग है और पानी की सतह पर नाव चाहिए । इस कदम को ग्रिड पर सीधे नहीं किया जाना चाहिए, क्षति से बचने के लिए/
      1. कार्बन फिल्म की संभावना को कम करने के लिए मीका शीट से अलग नहीं होगा, एक उस्तरा ब्लेड के साथ मीका शीट के किनारे के चारों ओर स्कोर या पानी में शुरू करने से पहले छोटे कैंची से एक कोने में कटौती ।
    13. एक बार कार्बन फिल्म अलग है, मीका चादर हटाने या इसे कंटेनर के नीचे गिर जाते हैं ।
    14. ठीक का उपयोग चिमटी इत्तला दे दी, बहुत कोमल दबाव और धीमी गति से आंदोलनों ग्रिड के शीर्ष पर कार्बन फिल्म गाइड के साथ लागू होते हैं ।
    15. ग्रिड की सतह के साथ संपर्क में कार्बन शीट लाओ या तो धीरे से पानी draining या उठाने की अंगूठी स्थापना, तंत्र के प्रकार पर निर्भर करता है ।
    16. ध्यान से स्टेनलेस स्टील के जाल (अब कार्बन लेपित ग्रिड के साथ) तंत्र से उठा और अतिरिक्त पानी के कुछ दूर बाती फिल्टर कागज का एक टुकड़ा का उपयोग कर । सुनिश्चित करें कि यह इस्पात मेष के बहुत किनारे पर फिल्टर कागज छू द्वारा किया जाता है, लेकिन ग्रिड या कार्बन फिल्म के साथ संपर्क में नहीं आ रहा है ।
    17. एक पेट्री फिल्टर कागज के एक सूखे टुकड़ा युक्त पकवान में ग्रिड के जाल प्लेस और यह पूरी तरह से सूखी अनुमति देते हैं ।
      नोट: यह सबसे अच्छा कमरे के तापमान पर रात भर सुखाने से प्रभावित है, लेकिन कदम लगभग ६० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में ग्रिड रखने के द्वारा शीघ्र किया जा सकता है ।
  2. फ्लोट और कोट (प्रत्यक्ष कार्बन जमाव) । इस विधि विवरण में वर्णित किया गया है पहले16
    1. पूरी तरह से आसुत जल के साथ सीमा के लिए एक साफ बड़े गिलास कटोरा भर तो शीर्ष पर एक meniscus रूपों ।
    2. एक साफ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पानी की सतह के लिए collodion समाधान (nitrocellulose में amyl एसीटेट) की एक बूंद लागू करें, छोटी बूंद को बाहर फैल और पूरी तरह से सूख अनुमति देते हैं । एक बार सूखी पानी की सतह के शीर्ष पर तैर collodion की एक पतली परत दिखाई जाएगी ।
    3. धीरे पानी की सतह से धूल या अंय संक्रमण को दूर करने के लिए एक दंर्तखोदनी का उपयोग कर collodion परत को हटा दें ।
    4. पानी के लिए एक दूसरी collodion छोटी बूंद लागू करें और इसे बाहर फैल और 2-3 मिनट के लिए सूखी अनुमति देते हैं ।
      नोट: दोहराएँ कदम 1.2.3-1.2.4 जब तक एक फ्लैट और शिकन मुक्त collodion की चादर प्राप्त की है.
    5. एक जोड़ी का प्रयोग ठीक चिमटी प्लेस EM ग्रिड नीचे चेहरा (निर्माता के वर्णन के अनुसार) फ्लोटिंग collodion शीट पर । ग्रिड एक साथ कसकर एक षट्कोण सरणी में पैक, लेकिन उंहें ओवरलैप करने की अनुमति नहीं है ।
      नोट: यदि एक ग्रिड या replaceed उल्टा नीचे रखा है यह आम तौर पर सबसे अच्छा है जगह में इसे छोड़ने के बजाय जोखिम collodion जब यह कदम की कोशिश कर पत्रक हानिकारक ।
    6. एक बार ग्रिड के सभी रखा, धीरे उन पर फिल्टर कागज के एक पत्रक रखना । कागज केशिका कार्रवाई से संतृप्त हो जाने की अनुमति दें ।
      नोट: किसी भी आकार या फिल्टर कागज की मोटाई उचित है अगर यह पूरी तरह से ग्रिड को शामिल किया गया है ।
    7. फिल्टर पेपर से परे फैली किसी भी collodion फिल्म को हटाने के लिए किसी दंर्तखोदनी का इस्तेमाल करें ।
    8. किनारे पर फिल्टर कागज पकड़ और पानी की सतह से छील ।
      नोट: ग्रिड पेपर का पालन रहना चाहिए ।
    9. एक पेट्री डिश में कागज फ्लैट और collodion-चेहरा ऊपर रखें और यह पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं ।
    10. एक कार्बन वाष्पीकरण के चैंबर में ग्रिड के साथ फिल्टर कागज एक ठीक से तैयार कार्बन इलेक्ट्रोड के रूप में 1.1.2 में विस्तृत के रूप में रखें ।
    11. में कार्बन शीट विधि के लिए वर्णित के रूप में कार्बन वाष्पीकरण प्रक्रिया का पालन करें
  3. दालों के बीच कई सेकंड की अनुमति दें overheating से बचने और nitrocellulose शीट को नुकसान पहुंचाने के लिए ।
    नोट: यदि वांछित बहुलक परत के बाद ग्रिड किया गया है कार्बन लेपित हटाया जा सकता है, हालांकि यह कदम शायद ही कभी आवश्यक है । फिल्टर कागज के एक ताजा टुकड़ा पर ग्रिड कार्बन साइड प्लेस और पास कागज पर एसीटोन के कई बूंदें डाल, पर नहीं, ग्रिड । एसीटोन ग्रिड के तहत बाहर फैल और भंग और बहुलक परत को अवशोषित करने की अनुमति दें ।

2. नकारात्मक धुंधला रिएजेंट की तैयारी

  1. Uranyl एसीटेट की तैयारी
    1. एक फोड़ा करने के लिए ultrapure पानी की एक छोटी मात्रा लाओ और यह अच्छी तरह से degas के लिए 10 मिनट के लिए फोड़ा करने की अनुमति । इसे थोड़ा ठंडा करने की अनुमति दें, और फिर इसे भंग करने के लिए उपयोग uranyl एसीटेट (UA) पर 1-2% (डब्ल्यू/
      नोट: यह प्रक्रिया एक धुएं अलमारी में और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ प्रदर्शन ।
    2. बाद समाधान ठंडा है, एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर या फिल्टर कागज के माध्यम से फिल्टर ।
    3. प्रकाश से और 4 ˚ सी पर सुरक्षित UA स्टोर । समाधान 1 साल के लिए स्थिर है ।
  2. पाउडर से Uranyl formation की तैयारी । इस विधि में वर्णन किया गया है पहलेसे8
    1. उबला हुआ degassed ultrapure पानी के 2 मिलीलीटर में 20 मिलीग्राम uranyl formate (उफ़) पाउडर भंग (के रूप में 2.1.1 चरण में) द्वारा ।
    2. हलचल जारी रखते हुए, 5 एम NaOH के 8 µ एल जोड़ने के लिए, समाधान एक गहरा पीला रंग के लिए बदलना चाहिए, लेकिन कोई हाला फार्म चाहिए ।
    3. एक ०.२ µm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.
    4. प्रकाश से सुरक्षित उफ़ दाग की दुकान । अगर किसी भी वेग या भूरे रंग फीका पड़ने मनाया जाना चाहिए दाग त्यागें । समाधान 1-2 दिनों के लिए ही स्थिर है ।
  3. Uranyl एसीटेट से Uranyl formation की तैयारी
    1. 1% (w/v) के हाला 1 मिलीलीटर 1 मीटर NaOH के १०० µ l को जोड़कर UA दाग ।
    2. एक benchtop केंद्रापसारक में अधिकतम गति से 2 मिनट के लिए मिश्रण केंद्रापसारक ।
    3. किसी भी supernatant को छोड़ें और १०० µ l में हाला को भंग कर 5% (v/v) जोरदार भंवर द्वारा फार्मल एसिड ।
    4. ९०० µ एल ultrapure पानी के साथ 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को पतला करने के लिए ०.५% में उफ़ दाग उपज (v/
    5. प्रकाश से सुरक्षित उफ़ दाग की दुकान । यदि किसी भी हाला या भूरे रंग फीका होना मनाया दाग त्यागें ।
  4. दूसरे के दाग लगा रहे रिएजेंटों की तैयारी
    1. Lanthanide एसीटेट दाग की तैयारी
      1. भंग समैरियम एसीटेट (SmAc), गैडोलीनियम एसीटेट (GdAc), Thulium एसीटेट (TmAc), या Erbium एसीटेट (ErAc) पर ultrapure जल में 1-2% (डब्ल्यू वी/
        नोट: यदि नमूने के इन दाग का उपयोग करते समय सकारात्मक धुंधला या ग्रिड के लिए गरीब पालन दिखाने के लिए, वे अप करने के लिए ०.५% के साथ acidified जा सकता है (v/ एक सफेद प्रभामंडल से घिरा हुआ एक अंधेरे वस्तु के रूप में प्रदर्शित होने के नमूने में सकारात्मक धुंधला परिणाम. ग्रिड के लिए गरीब पालन कम अणुओं में परिणाम से उंमीद की जा रही ग्रिड पर मनाया जाएगा ।
    2. अमोनियम Molybdate और सोडियम Phosphotungstate की तैयारी
      1. ultrapure पानी में 1-3% (डब्ल्यू/वी) पर दाग भंग । ७.० के लिए पीएच समायोजित 5 मीटर NaOH का उपयोग कर यदि वांछित ।

3. कार्बन सब्सट्रेट और धुंधला करने के लिए Adsorbing नमूने

  1. यह हाइड्रोफिलिक प्रतिपादन द्वारा नमूना आवेदन के लिए ग्रिड सतह की तैयारी
    1. एक चमक निर्वहन इकाई में एक खुर्दबीन स्लाइड पर ऊपर का सामना करना पड़ ग्रिड प्लेस ।
    2. 10 mA में 30 एस की एक ंयूनतम के लिए ग्रिड समझो ।
      नोट: चमक निर्वहन का सटीक तरीका इस्तेमाल किया उपकरणों के विशेष टुकड़ा के विनिर्देशों पर निर्भर करेगा ।
    3. वैकल्पिक रूप से यह 10 मिनट के लिए यूवी विकिरण द्वारा पूरा किया जा सकता है एक benchtop यूवी लैंप का उपयोग कर4।
  2. पक्ष सोख्ता कृती. इस विधि में वर्णन किया गया है पहलेसे8
    1. नकारात्मक दबाव चिमटी की एक जोड़ी के साथ ग्रिड के किनारे पकड़, और समर्थन सतह के लिए नमूना के 3-5 µ एल लागू होते हैं ।
    2. 10 एस के लिए 1 मिनट के लिए ग्रिड सतह के लिए adsorb करने के लिए नमूने की अनुमति दें. अनुकूलित सोखना समय व्यक्तिगत नमूनों के लिए आवश्यक है ।
    3. फिल्टर कागज के एक पत्रक के लिए ग्रिड के किनारे को छूने और केशिका कार्रवाई करने के लिए बंद तरल खींचने की अनुमति ।
    4. वैकल्पिक: ग्रिड को धोएं । ultrapure पानी या प्रयोगशाला फिल्म के एक पत्रक पर उचित अस्थिर बफर समाधान के ५० µ एल बूंदें प्लेस । धीरे ग्रिड की सतह पर एक छोटी सी छोटी बूंद से ड्रॉप करने के लिए और लिफ्ट की कार्बन सतह को छूने । फिल्टर कागज के एक पत्रक के लिए ग्रिड के किनारे को छूने और केशिका कार्रवाई करने के लिए बंद तरल खींचने की अनुमति ।
    5. इस धोने के रूप में कई बार के रूप में वांछित कदम दोहराएं ।
    6. जगह प्रयोगशाला फिल्म के एक पत्रक पर दाग रिएजेंट के २ ५० µ एल बूंदें ।
    7. धीरे से ग्रिड की कार्बन सतह को छूने के लिए ड्रॉप और ग्रिड के शीर्ष सतह पर एक छोटी सी छोटी बूंद से लिफ्ट ।
      नोट: यदि दाग ग्रिड के पीछे की ओर जाता है तो ग्रिड को छोड़ दिया जाना चाहिए ।
    8. फिल्टर कागज के एक पत्रक के लिए ग्रिड के किनारे को छूने और केशिका कार्रवाई बंद तरल आकर्षित करने के लिए अनुमति देते हैं । इस धुंधला कदम दो बार प्रदर्शन करते हैं ।
    9. एक गरमागरम लैंप के तहत शुष्क या शुष्क हवा के लिए ग्रिड की अनुमति दें ।
  3. फ़्लिकिंग विधि
    1. नकारात्मक दबाव चिमटी की एक जोड़ी के साथ ग्रिड के किनारे पकड़, और समर्थन सतह के लिए नमूना के 3-5 µ एल लागू होते हैं ।
    2. एक हाथ में चिमटी पकड़े, ताकि ग्रिड लगभग ४५ ° दूर का सामना करना पड़ रहा पर angled है, तेजी से उस हाथ की कलाई झटका ' बंद ' छोटी बूंद कि ग्रिड के शीर्ष पर है के बहुमत ।
    3. वैकल्पिक: एक गिलास पाश्चर का उपयोग पिपेट समर्थन सतह के लिए धोने समाधान की एक बूंद लागू करते हैं और 3.2.2 में के रूप में ' झटका बंद '. आवश्यकतानुसार दोहराएं ।
    4. एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करने का समर्थन सतह और ' झटका बंद ' के रूप में 3.2.2 में सना हुआ एजेंट की एक बूंद लागू होते हैं । दोहराएं 1-3 बार दाग नमूना के दृश्य के लिए आवश्यक गहराई पर निर्भर है ।
      नोट: यह केवल कारक है कि अंतिम दाग गहराई के लिए विशेषताएं नहीं है (चर्चा देखें) ।
    5. ग्रिड के किनारे करने के लिए फिल्टर कागज के एक टुकड़े की फटी हुई धार को छूने से अतिरिक्त दाग निकालें ।
    6. एक गरमागरम लैंप के तहत शुष्क या शुष्क हवा के लिए ग्रिड की अनुमति दें ।
  4. रैपिड फ्लशिंग विधि
    1. ड्रा 30-70 दाग के µ एल (1% आम तौर पर इस्तेमाल किया UA) एक २०० µ एल पिपेट की नोक में, हवा के 5 µ एल आकर्षित करने के लिए मात्रा डायल बारी है, तो धोने/मिश्रण रिएजेंट (5-30 µ एल), यदि आवश्यक हो, एक और छोटे से हवा के अंतराल के बाद, और फिर नमूना के 5 µ एल आकर्षित करने के लिए ड्रा ।
    2. पकड़ नकारात्मक दबाव चिमटी की एक जोड़ी के साथ एक ग्रिड के किनारे, चिमटी पकड़े इतना है कि ग्रिड लगभग ४५ डिग्री पर angled है शोधकर्ता से दूर का सामना करना पड़ रहा है, कार्बन लेपित EM ग्रिड के चेहरे के पार पिपेट टिप की पूरी सामग्री बाहर निकालें ।
    3. ग्रिड के किनारे करने के लिए फिल्टर कागज के एक टुकड़े की फटी हुई धार को छूने से अतिरिक्त दाग निकालें ।
    4. एक गरमागरम लैंप के तहत शुष्क या शुष्क हवा के लिए ग्रिड की अनुमति दें ।
      नोट: सभी तरीकों के लिए यह संदंश साथ फिल्टर कागज के एक पत्रक के फटे किनारे स्लाइड करने के लिए सलाह दी जाती है जब तक यह ग्रिड तक पहुंचता है संदंश, जो संदंश के जबड़े में सूखे ग्रिड खींच सकते है के दोनों पक्षों के बीच फंस समाधान एक बार वे कर रहे है खोला. चिमटी में ग्रिड भी शुष्क करने के लिए एक धुएं हुड के किनारे पर रखा जा सकता है । लगातार airflow अधिक भी धुंधला उत्पादन में मदद कर सकते हैं ।

Representative Results

धुंधला के सभी एजेंट का उत्पादन कुछ हद तक धुंधला नकारात्मक का परीक्षण किया, के साथ सबसे बड़ा विपरीत और सबसे तेजी से नमूनों की उपज, सर्वाधिक विस्तृत कणों । गहराई से एंबेडेड नमूनों के लिए (चित्रा 1) lanthanide आधारित दाग ErAc और TmAc बराबर गुणवत्ता के नकारात्मक दाग के रूप में स्पष्ट विपरीत और दाग कणों के तेज, TmAc उत्पादक स्पष्ट, और अधिक कुरकुरा छवियों के साथ ंयाय के रूप में UA का उत्पादन किया भन्दा ErAc । हालांकि TmAc का बड़ा अनाज आकार उच्च आवर्धन पर स्पष्ट हो जाता है, जब तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) कणों 1% TmAc TMV कण के ~ 23 Å दोहराने के साथ दाग थे17 अभी भी आंखों से स्पष्ट रूप से दिखाई और एक meridional में परत लाइन के रूप में था कच्ची छवि का रूपान्तर रूपांतरित करता है । कोई भी अंय lanthanide दाग परीक्षण, ErAc, SmAc, या GdAc, इस सुविधा का समाधान करने में सक्षम थे । वर्ग औसत TMV कणों जहां पेचदार दोहराने दिखाई दे रहा था से अतिव्यापी क्षेत्रों को निकालने के द्वारा उत्पंन किया गया । निकाले गए खंडों तो गठबंधन और वर्गीकृत18 का उपयोग करने के लिए बेहतर आवर्ती सुविधा (चित्रा 2) कल्पना कर रहे थे ।

कुछ नमूने विशेष रूप से दाग की विधि के लिए संवेदनशील होते हैं, जैसे मांसपेशी व्युत्पंन सी-प्रोटीन । सी-प्रोटीन, जो आइजी और एफ एन के एक लचीला स्ट्रिंग डोमेन की तरह होते हैं, नकारात्मक द्वारा काफी अलग छवियों का उत्पादन-दाग उंहें इस्तेमाल धुंधला (चित्रा 3) की विधि पर निर्भर है । साइड सोख्ता विधि का उपयोग करते समय, ढह अंगूठी की तरह संरचनाओं, जब तेजी से निस्तब्धता या झाड़ू तरीकों से सना हुआ, मनाया जाता है, सी-प्रोटीन एक स्ट्रिंग पर मोती के समान है कि डोमेन की एक श्रृंखला के रूप में मनाया जाता है ।

अभिकर्मक एकाग्रता पीएच प्रकार
अमोनियम Molybdate 1-2% ५-७ anionic
Erbium एसीटेट (ErAc) 1 – 2% 6 cationic
गैडोलीनियम एसीटेट (GdAc) 1 – 2% 6 cationic
Methylamine tungstate 2% ६-७ anionic
समैरियम एसीटेट (SmAC) 1% 6 cationic
सोडियम silicotungstate 1 – 5% ५-८ anionic
सोडियम phosphotungstate 1 -3% ५-८ anionic
Thulium एसीटेट (TmAc) 1 – 2% 6 cationic
Uranyl एसीटेट (यूए) 1 – 3% ३-४ cationic
Uranyl formation (उफ़) ०.७५ – 1% ३-४ cationic

तालिका 1: कुछ सामांय नकारात्मक धुंधला रिएजेंट ।

Figure 1
चित्रा 1: तंबाकू मोज़ेक वायरस के विभिंन नकारात्मक दाग रिएजेंट के साथ सना हुआ उदाहरण माइक्रोग्राफ (A) 1% उफ़ (B) २.५% TmAc (C) २.५% ErAc. (D) 1% UA (E) २.५% GdAc व (च) २.५% SmAc. स्केल सलाखों १०० एनएम हैं । एकाधिक से प्रतिनिधि छवियां कई दोहराने के प्रति छवि वाले क्षेत्रों के साथ प्रतिकृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Thulium एसीटेट के साथ तंबाकू मोज़ेक वायरस धुंधला (क) TMV के एक micrograph से क्षेत्र का उच्च आवर्धन 1% TmAc के साथ सना हुआ । स्केल बार 20 एनएम है । (ख) निकाले गए TMV खंडों का कक्षा औसत । (ग) रूपान्तर पैनल में छवि के रूपांतरण एक दिखा परत रेखा पर प्रतिबिंब ~ 23 Å. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सी के अनुरूप प्रोटीन पर सोख्ता विधि के प्रभाव । (क) सी प्रोटीन साइड दाग विधि और (ख) झाड़ना विधि का उपयोग कर UA के साथ सना हुआ । ऊपरी पैनल स्केल बार ५० एनएम है, कम पैनल स्केल बार 20 एनएम है । एकाधिक से प्रतिनिधि छवियां कई दोहराने के प्रति छवि वाले क्षेत्रों के साथ प्रतिकृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस पांडुलिपि दो उपंयास lanthanide रिएजेंट (TmAc और ErAc) सहित धुंधला रिएजेंट की एक किस्म का उपयोग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने के नकारात्मक दाग के लिए कई तरीकों का वर्णन करता है । नकारात्मक धुंधला प्रक्रिया के कदम के कई दाग के विकल्प, यदि कोई आवश्यक धोने की राशि, और सोख्ता तकनीक सहित व्यक्तिगत नमूनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस पांडुलिपि इस प्रकार सूक्ष्मदर्शी को नकारात्मक-चुनौतीपूर्ण प्रणालियों के दाग से निपटने के लिए अपने स्वयं के कार्यप्रवाह विकसित करने के लिए एक आधार प्रदान करता है ।

दाग का चुनाव अत्यधिक नमूना निर्भर है । नमूने है कि विशेष रूप से कम पीएच के प्रति संवेदनशील है इन दाग19के निर्धारण गुण के बावजूद, UA और/ इन मामलों में, lanthanide आधारित दाग जैसे TmAc या ErAc अधिक उपयुक्त हो सकता है, हालांकि तैयारी के समग्र पीएच नमूना प्रोटीन के isoelectric बिंदु के नीचे रखा जाना चाहिए सकारात्मक दाग को रोकने में मदद करने के लिए । यदि आवश्यक हो तो यह एसिटिक एसिड के साथ दाग acidifying द्वारा पूरा किया जा सकता है । विशेष रूप से कम पीएच संवेदनशील नमूनों के लिए, anionic tungstate या molybdate दाग अधिक प्रभावी हो सकता है । हालांकि ये दाग कुछ मामलों में कलाकृतियों के गठन को प्रेरित करने के लिए पाए गए हैं, जैसे लिपोप्रोटीन नमूनों में rouleaux का गठन20. फिर, दाग के पीएच को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, नमूने के isoelectric बिंदु के ऊपर इस समय, के लिए सकारात्मक दाग को रोकने के ।

नमूने की धुलाई से पहले धुंधला होना आवश्यक हो सकता है अगर बफर में नमूना रखा है एक उच्च नमक या फॉस्फेट घटक है. कई मामलों में, धोने ultrapure पानी के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन अधिक संवेदनशील नमूनों, जो नीचा या संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरना हो सकता है जब अकेले पानी के संपर्क के लिए, धोने के लिए कम ईओण ताकत की एक अस्थिर बफर के साथ प्रदर्शन की आवश्यकता हो सकती है8। यहां तक कि सावधानी से नियंत्रित शर्तों के तहत, धुलाई कार्बन सतह पर कुछ संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था में परिणाम कर सकते हैं21.

विधि जिसके द्वारा एक ग्रिड नमूना सोखना के संदर्भ में तैयार किया जाता है, सोख्ता और धुंधला भी काफी प्रभावित कर सकते हैं क्या मनाया जाता है. सबसे उपयुक्त विधि इस प्रकार है, फिर से, उच्च नमूना निर्भर है । सी-प्रोटीन, उदाहरण के लिए, पक्ष दाग धुंधला निंनलिखित संरचना की तरह एक गोलाकार अंगूठी के रूप में मनाया जाता है, लेकिन यह धुंधला प्रक्रिया के एक विरूपण साक्ष्य प्रतीत होता है, के रूप में पता चला जब ग्रिड झाड़ना विधि द्वारा तैयार कर रहे है (या तेजी से फ्लश विधि द्वारा) (चित्रा 3 ). फ़्लिकिंग और रैपिड फ्लशिंग विधियों में, नमूना निर्धारण से पहले कार्बन समर्थन सतह के साथ इंटरैक्ट करने के लिए15को छोटा किया गया है । नमूना भी निर्धारण से पहले सोख्ता पर घटता meniscus से कम बलों अनुभव करता है । इसका मतलब यह है कि नमूना है कि कार्बन फिल्म या केशिका कार्रवाई के माध्यम से लंबे समय तक अवशोषण समय पर हो सकता है में संरचनात्मक परिवर्तन कम कर रहे हैं । तेजी से निस्तब्धता विधि भी नमूनों की समय-हल विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नमूना एक ligand या एक ग्रिड के लिए आवेदन से पहले समय की एक निर्धारित अवधि के लिए एक पिपेट टिप के भीतर additive के साथ मिलाया जा सकता है या केवल मिलीसेकंड के भीतर निर्धारण से पहले ग्रिड सतह पर क्षणभर.

एक विशेष नमूना की इष्टतम छवियों को उपलब्ध कराने के लिए आवश्यक दाग की गहराई फिर से2निर्भर नमूना है । यदि दाग भी उथले है, अणु इलेक्ट्रॉन बीम से क्षतिग्रस्त हो सकता है लेकिन अगर दाग बहुत मोटी संरचनात्मक सुविधाओं है खो सकते हैं । दाग गहराई ग्रिड सतह के hydrophilicity के रूप में कई कारकों से प्रभावित है, कार्बन परत की समता, ग्रिड के लिए लागू दाग की मात्रा, समय दाग की लंबाई सोख्ता से पहले ग्रिड के साथ संपर्क में है, सोख्ता की हद तक और समय यह टा ग्रिड के लिए kes पूरी तरह से शुष्क करने के लिए । एक ग्रिड अपनी पूरी तरह से और इसलिए इमेजिंग के लिए उपयुक्त ग्रिड के क्षेत्रों में दाग का एक भी वितरण नहीं होगा ध्यान से चयनित होने की जरूरत है । वास्तव में, ग्रिड अक्सर गुणवत्ता में भिंनता है जब भी एक ही स्थिति के तहत एक ही दिन पर तैयार । कैसे दाग गहराई में भिंनता का एक अच्छा उदाहरण के अणुओं की उपस्थिति और इमेजिंग के लिए उपयुक्त दाग गहराई को प्रभावित करता है बर्गेस एट अल5 द्वारा प्रदान की जाती है ।

नकारात्मक धुंधला होने के बावजूद एक बहुत बहुमुखी, जल्दी जा रहा है, और सरल विधि, नहीं सभी जैविक नमूनों को इस पद्धति से दृश्य के लिए उत्तरदाई हैं । नाजुक विधानसभाओं पतन या सोखना पर जुदा कर सकते हैं, धुंधला या EM ग्रिड22पर सुखाने । नकारात्मक धुंधला भी अणुओं के समतल करने के लिए नेतृत्व कर सकते है और कार्बन समर्थन फिल्म7पर अणुओं के पसंदीदा झुकाव प्रेरित ।

नकारात्मक दाग अपने आप में नमूनों के आकलन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है और यह भी क्रायो-EM विश्लेषण से पहले लेकिन शारीरिक बलों प्रक्रिया के दौरान नमूना मुठभेड़ों के कई खराब समझ रहे हैं । इसलिए, का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा तरीका उच्च नमूना निर्भर है और परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए और त्रुटि के बजाय एक निश्चित प्रोटोकॉल के बाद सिखाया.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम बहुत उपयोगी चर्चा और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए पीटर नाइट के लिए आभारी हैं । हम सभी के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा नील राँसन और स्टीफन Muench लैब्स और Astbury संरचना प्रयोगशाला के कर्मचारियों के लिए उपयोगी विचार विमर्श के लिए । यह काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (FP7/2007-2013)/ERC अनुदान समझौते ३२२४०८ द्वारा वित्त पोषित किया गया था । सी-प्रोटीन एक ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन ग्रांट (BHF PG/13/83/30485) द्वारा प्रदान किए गए संसाधनों का उपयोग कर उत्पादित किया गया था । हम यह भी धंयवाद करने के लिए उपकरण धन के लिए वेलकम ट्रस्ट लीड्स में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (090932/z/z और 094232/z/10/z) का समर्थन । सीएस एक वेलकम ट्रस्ट आईएसएसएफ अनुदान द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh copper EM grids Sigma-Aldrich G4776-1VL Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate Sigma-Aldrich 277908
Carbon evaporator Ted Pella Inc. 9620 Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate Sigma-Aldrich 9817
Dumont #5 negative pressure tweezers World Precision Instruments 501202 Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate Sigma-Aldrich 325570
Gadolinium Acetate Sigma-Aldrich 325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. AGAR Scientific AGG250-1
Microscope slides, white frosted Fisher Scientific 12607976 Or equivalent
Parafilm Fisher Scientific 10018130 Or equivalent
Pasteur pipette (glass) Fisher Scientific 10343663 Or equivalent
Razor blade Fisher Scientific 11904325 Or equivalent
Sandpaper Hardware store Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate Sigma-Aldrich 325872
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462
Sodium Phosphotungstate Sigma-Aldrich P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size). AGAR Scientific AGG252
Thulium Acetate Sigma-Aldrich 367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods Ted Pella Inc. 57-10 Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22450
Vacuum grease Fisher Scientific 12719406 Or equivalent
Whatman #1 Filter paper. Fisher Scientific 1001 090 Or equivalent
Whatman #40 filter paper Fisher Scientific 10674122 Or equivalent

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References

  1. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  2. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  3. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  4. Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
  5. Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
  6. Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
  7. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  8. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
  9. Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
  10. Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
  11. Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
  12. Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
  13. Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
  14. Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
  15. Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179 (2015).
  16. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  17. Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
  18. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
  19. Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  20. Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
  21. Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
  22. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).

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जैव रसायन मुद्दा १३२ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नकारात्मक दाग जैविक उनि सोख्ता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड कार्बन कोटिंग

Erratum

Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 01/30/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Matthew G. Iadaza

to:

Matthew G. Iadanza

नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों पर रूपांतरों: चुनौतीपूर्ण प्रणालियों से निपटने के लिए उपकरण
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Scarff, C. A., Fuller, M. J. G.,… More

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. J. Vis. Exp. (132), e57199, doi:10.3791/57199 (2018).

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