Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Variationer på Negative pletten Elektron Mikroskopi metoder: værktøjer til håndtering af udfordrende systemer

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57199
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Astbury Biostructure Laboratory, University of Leeds

ERRATUM NOTICE

Summary

Negative pletten EM er en effektiv teknik til at visualisere makromolekylære struktur, men forskellige farvning teknikker kan producere varierende resultater i en stikprøve afhængige måde. Her er flere negative farvning tilgange beskrevet i detaljer for at give en indledende arbejdsgang til håndtering af visualisering af udfordrende systemer.

Abstract

Negative pletten elektronmikroskopi (EM) giver mulighed for forholdsvis enkel og hurtig observation af makromolekyler og makromolekylære komplekser ved hjælp af kontrast styrke pletten reagens. Selv begrænset i beslutningen til et maksimum på ~ 18-20 Å, negative pletten EM er nyttige for en bred vifte af biologiske problemer og også leverer en hurtig vurdering af prøver for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Arbejdsprocessen negative pletten er ligetil metode; prøven er adsorberet på et substrat, så en plet er anvendt, renset, og tørret til at producere et tyndt lag af elektron tætte plet hvor partikler er indlejret. Enkelte prøver kan imidlertid opføre sig markant forskelligt under varierende farvning forhold. Dette har ført til udviklingen af en lang række substrat forberedelse teknikker, negative farvning reagenser og gitter vask og duppe teknikker. Bestemmelse af den mest hensigtsmæssige teknik for hver enkelt prøve skal ske på et sag til sag grundlag og en microscopist skal have adgang til en række forskellige teknikker til at opnå de højeste kvalitet negativ pletten resultater. Detaljerede protokoller for to forskellige substrat præparationsmetoder og tre forskellige blotting teknikker findes, og er vist et eksempel på en prøve, der viser markant forskellige resultater afhængigt af den anvendte metode. Desuden er udarbejdelse af nogle fælles negativ farvning reagenser, og to nye Lanthanide-baserede pletter, beskrevet med diskussion om brugen af hver.

Introduction

Trods nylige opmærksomhed på beslutningsforslaget pletten revolution som følge af betydelige fremskridt i cryo-Elektron Mikroskopi1 (cryo-EM), negative EM er stadig en kraftfuld teknik og en afgørende komponent i elektron microscopists' værktøjskasse. Negative farvning er stadig den bedste metode til hurtig vurdering af en prøve før optimering cryo-grid betingelser2. Høj kontrast og hastighed af gitter forberedelse af negative farves prøver gør den ideel til vurdering af stikprøve renhed, koncentration, heterogenitet og konformationelle fleksibilitet3. Mange biologisk informative strukturer har resulteret fra negative pletten rekonstruktioner, trods den teknik opløsning er begrænset til ~ 18 Å opløsning4,5,6, og nogle prøver giver bedre resultater i pletten end cryo-EM for en række forskellige grunde7.

I negativ pletten EM, er partikel af interesse adsorberet på overfladen af en EM gitter og omsluttet af en amorf matrix af elektron tætte pletten sammensatte. En høj relativ kontrast er produceret mellem baggrunden og partikel af interesse, med partikel bliver mindre elektron tæt end den omkringliggende pletten8. Partiklerne vises som lyse områder på grund af deres lave elektron spredning magt i forhold til den tætte omkringliggende pletten, der spilder flere elektroner og vises mørkere. Substructural funktioner af partikler kan udledes af den detaljerede gennemgang af resulterende billeder som pletten vil trænge ind i enhver sprække og producere uregelmæssige kontrast detalje9.

Den negative farvning processen begynder med udarbejdelsen af en støtte substrat som prøve partiklerne fanges, og lag af tørrede pletten understøttes. De mest almindeligt anvendte støtte substrat er et lag af amorf carbon, undertiden understøttet af et tyndt lag af polyvinyl (f.eks. Formvar) eller nitrocellulose (f.eks. Kolloidbomuld) polymer. Disse substrater kan købes kommercielt eller udarbejdet internt ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet nedenfor.

Efter støtte substrat er forberedt, prøven kan anvendes, og den overskydende løsning renset ud. Prøverne bør suspenderes i en velegnet stødpude for negativ-farvning. Det er bedst at undgå brug af fosfat buffer og saltkoncentrationer, der kan give anledning til krystallinsk bundfald, der kan sløre modellen. Reduktionsmiddel, vaske-og rengøringsmidler, saccharose, glycerol og høje koncentrationer af nukleotid bør også undgås, da de påvirker også pletten kvalitet4. Når bufferen sammensætning kan ikke ændres, vask overfladen af gitteret EM med vand eller en mere velegnet stødpude efter adsorption og før farvning kan reducere dannelsen af buffer relaterede artefakter og generelt forbedre pletten baggrund. Hvis bufferen artefakter er mistænkt, kan det være oplysende at plette en buffer-only gitter for at afgøre, om komponenterne buffer er kilden til de observerede artefakter.

Efter prøven er adsorberet, og renset og vasket om nødvendigt, anvendes en farvning reagens. Et udvalg af reagenser er blevet fundet for at være effektiv negative pletter (tabel 1), men pletten må vælges så de passer til prøven. En 'halo' pletten former rundt i partikel på grund af både forskydningen af pletten molekyler af de hydrofobe regioner af protein og frastødning af opkrævet grupper. Derfor skal være udvalgt pletten, så tilstanden protonation af enhver potentiel opladet grupper på protein er det samme som pletten på arbejde pH. Overfor afgifter på overfladen af proteinet kan bidrage til en positiv farvning virkning, som selv en nyttig teknik i sin egen ret10 ikke er omfattet af dette papir. De mest almindeligt anvendte negative farvning reagenser er uranyl acetat og uranyl formate. Disse pletter har en forholdsvis fine kornstørrelse (4-5 Å)9 og give højere opløsning billeder over andre pletter som phospho-tungstates (8-9 Å kornstørrelse)9,11, ammonium molybdat11, og nogle lanthanide-baserede pletter12. Uranyl acetat og formate også fungere som fiksativ, bevare mange protein-protein interaktioner på en millisekund tid skala13, selv om den lave pH af pletten og dens tilbøjelighed til at udfælde ved fysiologisk pH kan være skadelig for nogle prøver14 . Trods deres nytte fremlægge uranyl salte også logistiske udfordringer som de er giftige og mildt radioaktivt, hvilket kan kræve særlige håndtering, oplagring, og bortskaffelse af krav, som fører nogle brugere at finde ikke-radioaktive alternativer.

Der er en lang række metoder beskrevet for substrat forberedelse, eksempelprogram, og farvning af EM gitre. Den mest hensigtsmæssige metode til at bruge udsnit afhængige og kan være vanskeligt at fastslå når håndtering af et nyt system. Dette manuskript beskrives to metoder til substrat forberedelse og tre blotting metoder; side blotting, svippede5og hurtig rødmen15. Side-blotting er den enkleste af de beskrevne metoder. Både metoden svippede og hurtige trækmetoden er vanskeligere at gennemføre, men begrænse kontakttid af prøven med støtte filmen før fiksering og har vist sig at forbedre dannelsen af pletten artefakter for nogle prøver5. Målet med dette manuskript er således at give en indledende arbejdsgang til håndtering af visualisering af udfordrende systemer af negativ-pletten EM.

Protocol

1. forberedelse af EM gitre

  1. Carbon ark metode
    1. Forberede en frisk kløvet glimmerplade.
      1. Isæt forsigtigt en præcision sprøjte nål eller et barberblad i det ene hjørne af glimmerplade, et par mm mellem lagene. Indsæt værktøj som tæt på lodret centrum af arket som muligt at producere to stykker af nogenlunde samme tykkelse.
      2. Forsigtigt frem fra hinanden de to halvdele af arket glimmer. Gøre dette kan med det blotte øje, eller under en dissekere mikroskop.
      3. Afbrød et af hjørnerne af hvert af nyligt kløvet glimmer ark. I tilfælde af at arket slår i CO2 fordamper under vakuum frigivelse, kan carbon coated side af arket identificeres.
    2. Placer kløvet glimmer ark/s i salen af et CO2 fordamper, med frisk kløvet overflade vender opad.
    3. Sørg for CO2 fordamper er set-up korrekt med en ordentligt forberedt carbon elektrode.
      Bemærk: Metoden til at forberede carbon stænger vil variere afhængigt af specifikationerne af CO2 fordamper. En protokol til ét instrument er som følger indtil trin 1.1.5.
      1. Skærpe en carbon stang med en blyantspidser har en skarp spids og derefter polere det med et stykke køkkenrulle til at fjerne enhver uslebne grater.
      2. Ved hjælp af fint sandpapir flade ende af en anden stang og igen polsk det glat med et stykke køkkenrulle.
      3. Læg to carbon stænger i fordamperen ifølge producentens anvisninger. Sikre skærpet slutningen på den første rod gør fast kontakt med den fladtrykte ansigt af den anden stang.
    4. Placere et lille stykke rent, tørt filtrerpapir delvist under glimmer, hvis kulstof tykkelse skal måles visuelt. Alternativt kan du placere en hvid matteret objektglas med en lille dab af vakuum fedt sammen med glimmer til at måle carbon tykkelse.
    5. Deponere kulstof på glimmer ifølge producentens anvisninger.
      1. Pumpe vakuum ned og vente, indtil det er på 10-5 mbar. Indstillet spænding af elektrode til 4.0 V (op til 5 V kan være påkrævet afhængigt af kulstof stang kilde).
      2. Køre flere korte pulser af ca 3,5 s i varighed gennem elektrode til at deponere 1-2 nm tykke evaporations af kulstof på glimmer overflade.
        Bemærk: Som nuværende påføres carbon stang vil glød rød og derefter hvid. Ikke stirre på den lyse lys da dette kan beskadige dine øjne.
      3. Tillad carbon at deponere på glimmer, indtil den ønskede tykkelse er nået, målt ved CO2 fordamper tykkelse gauge eller ved visuel observation af kulstoffet deponeret på filtrerpapir eller objektglas. Sikre at den endelige kulstof lag er 5-10 nm tykke.
        1. Hvis carbon tykkelse måles visuelt Sammenlign matteret objektglas belagt med vakuum fedt til det udsatte område, det bliver mørkere efterhånden mere kulstof er deponeret.
          Bemærk: Der findes ingen kvantitativ metode til at bestemme carbon tykkelse, når du bruger denne metode.
    6. Lufte den vakuumkammer og fjerne de kulstof-belagt glimmer fra CO2 fordamper.
      Bemærk: Den CO2-belagt glimmer kan overlades at bosætte sig natten over, før du fortsætter med efterfølgende trin
    7. Brug en af de to vandbeholdere for at flyde carbon film på EM gitre: en container med en afløbsventil i bunden så vandet kan drænes og kulstof lag sænkes på de afventer gitre eller en hejse rig, at nettene kan indstilles på under vandet overflade, som efterfølgende kan hæve gitre til carbon filmen på vandoverfladen.
    8. Fyld beholderen med laves destilleret vand, således at overfladen af vandet er ca 5 mm fra toppen. Ren overfladen af vandet ved at trække en ark eller to af linse væv over overfladen for at fjerne enhver flydende partikler.
    9. Læg et stykke af rene rustfrit stål mesh (1 tomme af 2,5 inches er en passende størrelse) under overfladen af vandet.
    10. Med en god pincet, lægge rent, tørt EM gitre ansigt op (ifølge fabrikantens beskrivelse) på rustfrit stål mesh. Pack gitrene sammen så stramt som muligt, men ikke tillader dem at overlappe hinanden.
    11. Når gitrene er arrangeret, fast greb carbon coated glimmerplade i et par pincet eller film udvikle tænger.
    12. Indføre glimmerplade i vandet. Sikre, at dette sker i en meget flad vinkel (~ 10 grader).
      Bemærk: Glimmer bør bryder gennem vandoverfladen og dykke, mens carbon film bør adskille fra glimmer og flyder på vandoverfladen. Dette skridt bør ikke udføres direkte over gitre, at undgå skader og/eller forurening.
      1. For at minimere muligheden for carbon film vil ikke adskille fra glimmerplade, score omkring kanten af glimmerplade med et barberblad eller skåret et hjørne af med en lille saks før at indføre det i vandet.
    13. Når carbon film har parcelhus, fjerne glimmerplade eller lade det falde til bunden af beholderen.
    14. Bruger fine tippes pincet, gælder meget blide tryk og med langsomme bevægelser guide carbon film over toppen af nettene.
    15. Bring arket kulstof i kontakt med overfladen af gitre enten af langsomt dræne vandet eller at hæve det løfte ring, afhængigt af apparater, der anvendes.
    16. Løft forsigtigt rustfrit stål mesh (nu med carbon-belagt gitre) fra apparater og vægen væk nogle af de overskydende vand ved hjælp af et stykke filtrerpapir. Sikre, at dette gøres ved at røre filtrerpapir til kanten af den armeringsnet men ikke kommer i kontakt med gitre eller carbon film.
    17. Placere trådnet af gitre i en petriskål, som indeholder et tørt stykke filtrerpapir og lad det tørre helt.
      Bemærk: Dette er bedst påvirket af tørring natten over ved stuetemperatur, men skridt kan fremskyndes ved at placere gitrene i ovn ved ca 60 ° C.
  2. Float og pels (direkte carbon deposition). Denne metode er blevet beskrevet i detaljer tidligere16
    1. Helt udfylde en ren stor glasskål til randen med destilleret vand, så en menisken danner øverst.
    2. Anvende en enkelt dråbe af Kolloidbomuld løsning (nitrocellulose i amyl acetat) på overfladen af vandet ved hjælp af en ren pasteur pipette, tillader denne droplet til at sprede og tørre fuldstændigt. Når tør vil et tyndt lag af Kolloidbomuld flyder oven på vandoverfladen være synlige.
    3. Fjern forsigtigt de Kolloidbomuld lag ved hjælp af en tandstikker til at fjerne støv eller anden kontaminering fra overfladen af vandet.
    4. Anvende et andet Kolloidbomuld slipværktøj til vandet og gør det muligt at sprede og tørre i 2-3 minutter.
      Bemærk: Gentag trin 1.2.3-1.2.4 indtil en flad og rynke fri ark Kolloidbomuld er opnået.
    5. Ved hjælp af et par fine pincet sted EM gitre ansigt ned (ifølge fabrikantens beskrivelse) på den flydende Kolloidbomuld ark. Pakke gitrene sammen stramt i en sekskantet array, men ikke tillader dem at overlappe hinanden.
      Bemærk: Hvis et gitter er malplacerede eller placeret hovedet er det generelt bedst at overlade det i sted frem for at risikere skader Kolloidbomuld ark, når du forsøger at flytte den.
    6. Når alle gitrene er placeret, forsigtigt lægge et ark filtrerpapir over dem. Tillade, at papiret bliver mættet af kapillaritet.
      Bemærk: Enhver størrelse eller tykkelse filtrerpapir er hensigtsmæssig, hvis det fuldstændig dækker gitrene.
    7. Brug en tandstikker til at fjerne alle Kolloidbomuld film, der strækker sig ud over filtrerpapir.
    8. Greb filtrerpapir på kanten og flå det fra vandoverfladen.
      Bemærk: Gitrene skal blive overholdt på papiret.
    9. Placer papir fladt og Kolloidbomuld-ansigt op i en petriskål og lad det tørre helt.
    10. Sted filtrerpapir med gitre i salen af et CO2 fordamper med et ordentligt forberedt carbon elektrode som beskrevet i punkt 1.1.2.
    11. Følg proceduren carbon fordampning som beskrevet for metoden carbon ark i
  3. Tillad flere sekunder mellem pulser at undgå overophedning og skade nitrocellulose ark.
    Bemærk: Hvis det ønskes, polymer lag kan fjernes efter gitrene har været carbon coated, selvom dette trin er sjældent nødvendigt. Læg den gitre carbon side op på en frisk stykke filtrerpapir og sætte flere dråber af acetone på papir i nærheden af, men ikke på, Grid-net. Tillad acetone spredt ud under gitrene og opløse og absorbere polymer lag.

2. forberedelse af Negative farvning reagenser

  1. Forberedelse af Uranyl acetat
    1. Bring en lille mængde ultrarent vand i kog og lad det koge i 10 min at grundigt degas. Lad det køle lidt, og derefter bruge det til at opløse uranyl acetat (UA) på 1-2% (w/v).
      Bemærk: Udføre denne procedure i et stinkskab og med passende personlige værnemidler.
    2. Efter løsningen er afkølet, filtreres gennem et filter papir eller 0,2 µm sprøjte filter.
    3. Gemme UA beskyttet mod lys og på 4 ˚C. Løsningen er stabilt i op til 1 år.
  2. Forberedelse af Uranyl Formate fra pulver. Denne metode er blevet beskrevet i detaljer tidligere8
    1. Opløse 20 mg uranyl formate (UF) pulver i 2 mL kogt afgassede ultrarent vand (som i trin 2.1.1) ved omrøring.
    2. Samtidig med at røre, tilføje 8 µL af 5 M NaOH, løsningen skal skifte til en mørkere gul farve, men ingen bundfald bør danne.
    3. Opløsningen filtreres gennem et filter, 0,2 µm sprøjte.
    4. Butik UF pletten beskyttet mod lys. Kassér pletten bør hvis nogen bundfald eller brun misfarvning er observeret. Løsningen er kun holdbar i 1-2 dage.
  3. Forberedelse af Uranyl Formate fra Uranyl acetat
    1. Bundfald 1 mL 1% (w/v) UA pletten ved at tilføje 100 µL 1 M NaOH.
    2. Der centrifugeres blandingen for 2 min. ved maksimal hastighed i en benchtop centrifuge.
    3. Kassér eventuelle supernatanten og bundfaldet oploeses i 100 µL af 5% (v/v) myresyre af kraftig vortexing.
    4. Fortyndes til en endelige mængden af 1 mL med 900 µL ultrarent vand at give UF pletten i 0,5% (v/v) myresyre.
    5. Butik UF pletten beskyttet mod lys. Kassér pletten, hvis nogen forhastede eller brun misfarvning er observeret.
  4. Forberedelse af andre farvning reagenser
    1. Forberedelse af Lanthanide acetat pletter
      1. Opløse Samarium acetat (SmAc), Gadolinium acetat (GdAc), Thulium acetat (TmAc) eller Erbium acetat (ErAc) på 1-2% (w/v) i ultrarent vand.
        Bemærk: Hvis prøver viser positive farvning eller dårlig tilslutning til nettet, når du bruger disse pletter, de kan være syrnet med op til 0,5% (v/v) myresyre. Positive farvning resulterer i stikprøven optræder som et mørkt objekt omgivet af en hvid halo. Dårlig tilslutning til elnettet vil resultere i færre molekyler end forventet overholdes på nettet.
    2. Forberedelse af ammoniummolybdat og natrium Phosphotungstate
      1. Opløse pletten på 1-3% (w/v) i ultrarent vand. PH indstilles til 7.0 ved hjælp af 5 M NaOH, hvis det ønskes.

3. adsorbing prøver at kulstoffet substrat og farvning

  1. Forberedelse af overfladen, gitter til eksempelprogrammet ved at gøre det Hydrophilic
    1. Placer gitteret opad på et objektglas i en glød decharge enhed.
    2. Behandle gitteret for mindst 30 s på 10 mA.
      Bemærk: Den nøjagtige metode til glød decharge vil afhænge af specifikationerne af den særlige stykke udstyr, der anvendes.
    3. Alternativt kan dette ske ved UV-bestråling i 10 minutter ved hjælp af en benchtop UV lampe4.
  2. Side Blotting metode. Denne metode er blevet beskrevet i detaljer tidligere8
    1. Greb kanten af gitteret med et par undertryk pincet, og anvende 3-5 µL af prøven til støtte overflade.
    2. Tillad prøven til adsorberes til gitter overfladen for 10 s til 1 min. Optimer adsorption tid skal for individuelle prøver.
    3. Tryk kanten af gitteret til et ark filtrerpapir og tillade kapillaritet til at trække ud af væsken.
    4. Valgfrit: Vaske gitteret. Sted 50 µL dråber ultrarent vand eller passende flygtige stødpudeopløsning på et ark af laboratoriet film. Forsigtigt røre carbon overfladen af gitteret til drop og løft af en lille dråbe på overfladen af gitteret. Tryk kanten af gitteret til et ark filtrerpapir og tillade kapillaritet til at trække ud af væsken.
    5. Gentag trinnet vask så mange gange som ønsket.
    6. Sted to 50 µL dråber farvning reagens på et ark af laboratoriet film.
    7. Forsigtigt røre carbon overfladen af gitteret til drop og løft af en lille dråbe på oversiden af gitteret.
      Bemærk: Hvis pletten vandrer til bagsiden af nettet så gitteret skal kasseres.
    8. Tryk kanten af gitteret til et ark filtrerpapir og tillade kapillaritet at trække off væsken. Udføre denne farvning trin to gange.
    9. Tillad gitter til luft tørre eller tørre under en glødelampe.
  3. Svippede metode
    1. Greb kanten af gitteret med et par undertryk pincet, og anvende 3-5 µL af prøven til støtte overflade.
    2. Holding pincet i den ene hånd, således at gitteret er vinklet på ca 45° vendende væk, hurtigt svirp håndled for at hånd til 'bladre ' størstedelen af slipværktøjet over nettet.
    3. Valgfrit: Ved hjælp af et glas Pasteur pipette Påfør en dråbe af vaskeopløsning til støtte overfladen og svip som 3.2.2. Gentag som nødvendigt.
    4. Ved hjælp af et glas Pasteur pipette Påfør en dråbe af farvning reagens, der skal støtte overflade og svip som 3.2.2. Gentag 1 - 3 gange afhængig af pletten dybde kræves for visualisering af modellen.
      Bemærk: Dette er ikke den eneste faktor, der tillægger endelige pletten dybde (Se diskussion).
    5. Fjern overskydende pletten ved at røre ved den iturevne kant af et stykke filtrerpapir ind til kanten af gitteret.
    6. Tillad gitter til luft tørre eller tørre under en glødelampe.
  4. Hurtig Trækmetode
    1. Trække 30-70 µL af pletten (1% UA normalt anvendes) i spidsen af en 200 µL pipette, drej volume skiven for at udarbejde 5 µL af luft, så udarbejde vask/blanding reagens (5-30 µL), hvis påkrævet, efterfulgt af en anden lille luftmellemrummet og derefter udarbejde 5 µL af prøven.
    2. Greb kanten af et gitter med et par undertryk pincet, holder pincet, således at gitteret er vinklet på ca 45° vender væk fra forsker, skubbe hele indholdet af pipette tip i hele ansigtet af carbon-belagt EM gitter.
    3. Fjern overskydende pletten ved at røre ved den iturevne kant af et stykke filtrerpapir ind til kanten af gitteret.
    4. Tillad gitter til luft tørre eller tørre under en glødelampe.
      Bemærk: For alle metoder er det tilrådeligt at glide et ark filtrerpapir langs pincet iturevet kant, indtil den når gitteret som dette fjerner løsning fanget mellem de to sider af pincet, der kan trække den tørrede gitter i kæberne på tang, når de er åbnet. Gitteret i pincet kan også placeres på kanten af et stinkskab tørre. Konstant luftstrømmen kan hjælpe med at producere mere selv farvning.

Representative Results

Alle farvning reagenserne testet produceret negative farvning til en vis grad, med UF giver prøver med den største kontrast og skarpeste, mest detaljerede partikler. For dybt indlejret prøver (figur 1) lanthanide baseret pletter ErAc og TmAc produceret negative farvning af tilsvarende kvalitet til UA som bedømt af tilsyneladende kontrast og skarphed af de farvede partikler, producerer med TmAc klarere, mere skarpe billeder end ErAc. Selvom de større kornstørrelse af TmAc bliver synlige på høj forstørrelse, når tobak mosaik Virus (TMV) partikler blev farves med 1% TmAc ~ 23 Å gentage af TMV partikel17 stadig var klart synlige med det blotte øje og som meridional lag linie i den Fouriertransformation af raw-billede. Ingen af de andre lanthanide pletter testet, ErAc, SmAc eller GdAc, var i stand til at løse denne funktion. Klasse gennemsnit blev genereret ved at udtrække overlappende segmenter fra TMV partikler hvor den heliske gentagelse var synlige. De udpakkede segmenter blev derefter justeret og klassificeres ved hjælp af RELION18 bedre visualisere den periodiske funktion (figur 2).

Nogle prøver er særligt følsomme over for metoden til farvning, såsom musklen stammer C-protein. C-protein, som består af en fleksibel streng af Ig og Fn-lignende domæner, producerer væsentligt forskellige billeder af negativ-pletten EM afhængig af metoden til farvning brugte (figur 3). Når ved hjælp af metoden side-blotting kollapsede overholdes ring-lignende strukturer, der henviser til, at når farvede af den hurtige rødmen eller svippede metoder, C-protein er observeret som en serie af domæner, der ligner perler på en snor.

Reagens Koncentration pH Type
Ammoniummolybdat 1 - 2% 5 – 7 Anioniske
Erbium acetat (ErAc) 1-2% 6 Kationiske
Gadolinium acetat (GdAc) 1-2% 6 Kationiske
Methylamin tungstate 2% 6 – 7 Anioniske
Samarium acetat (SmAC) 1% 6 Kationiske
Natrium silicotungstate 1 – 5% 5 – 8 Anioniske
Natrium phosphotungstate 1 -3% 5 – 8 Anioniske
Thulium acetat (TmAc) 1-2% 6 Kationiske
Uranyl acetat (UA) 1-3% 3-4 Kationiske
Uranyl Formate (UF) 0,75-1% 3-4 Kationiske

Tabel 1: Nogle almindelige negative farvning reagenser.

Figure 1
Figur 1: eksempel micrographs af tobak mosaik Virus farves med forskellige negative pletten reagenser (A) 1% UF (B) 2,5% TmAc (C) 2,5% ErAc. (D) 1% UA (E) 2,5% GdAc og F 2,5% SmAc. Skala barer er 100 nm. Repræsentative billeder fra flere flergangsbestemmelser med flere områder afbildet pr. replikat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: farvning tobak mosaik Virus med Thulium acetat (A) høj forstørrelse af området fra en Mikrograf af TMV farves med 1% TmAc. Skalalinjen er 20 nm. (B) klasse gennemsnittet uddraget TMV segmenter. (C) Fouriertransformation af billedet i panelet A viser lag linje refleksioner på ~ 23 Å. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: virkningerne af blotting metode på kropsbygning af C-protein. (A) C-protein farves med UA side skamplet metode og (B) svippede metode. Overpanelets skalalinjen er 50 nm, nederste panel skalalinjen er 20 nm. Repræsentative billeder fra flere flergangsbestemmelser med flere områder afbildet pr. replikat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette manuskript beskriver flere metoder for negative farvning af prøver til elektronmikroskopi ved hjælp af en række farvning reagenser, herunder to nye lanthanide reagenser (TmAc og ErAc). Mange af skridt af negative farvning processen skal optimeres for individuelle prøver herunder valg af pletten, mængden af vask kræves, hvis nogen, og den blotting teknik. Dette håndskrift giver således grundlag for microscopists til at udvikle deres egne arbejdsprocesser til at tackle negative-farvningen af udfordrende systemer.

Valget af pletten er meget prøve afhængige. Prøver, der er særligt følsomme over for lav pH kan blive forringet af UA og/eller UF, trods de Fikseringsvæske egenskaber af disse pletter19. I disse tilfælde baseret lanthanide pletter såsom TmAc eller ErAc kan være mere hensigtsmæssigt, selv om den samlede pH af præparatet skal holdes under det isoelektriske punkt af prøven protein for at forhindre positive farvning. Dette kan ske ved forsurende pletten med eddikesyre, hvis nødvendigt. For især lav pH følsomme prøver, kan anioniske tungstate eller molybdat pletter være mere effektive. Selvom disse pletter er blevet fundet for at inducere dannelse af artefakter i nogle tilfælde, såsom dannelsen af rouleaux i lipoprotein prøver20. PH af pletten kan igen, skal justeres, denne gang til over det isoelektriske punkt i eksemplet, at forhindre positive farvning.

Vask af prøven før farvning kan være nødvendigt hvis bufferen som modellen bevares har et højt salt- eller fosfatgruppe komponent. I mange tilfælde, vask kan udføres med ultrarent vand men mere følsomme prøver, som kan forringe eller undergår strukturændringer når det udsættes for vand alene, vask skal udføres med en flygtige buffer på lav ionisk styrke8. Selv under nøje kontrollerede forhold, kan vask resultere i nogle strukturelle omrokering på carbon overflade21.

Metoden som et gitter er forberedt med hensyn til prøven adsorption, blotting og farvning kan også væsentligt påvirke, hvad er observeret. Den mest hensigtsmæssige metode er således igen, meget prøve afhængige. C-protein, for eksempel, er observeret som en kugleformet ring-lignende struktur efter side-skamplet farvning, men dette synes at være en artefakt af farvning processen, som afslørede når gitre er tilberedt af metoden svippede (eller den hurtige trækmetoden) (figur 3 ). I de svirpe og hurtige trækmetoder, den tid, prøven har til at interagere med carbon støtte overflade før fiksering er minimeret15. Prøven oplevelser også færre kræfter fra de vigende menisk på blotting før fiksering. Det betyder, at strukturelle ændringer i modellen, der kan opstå ved længerevarende absorption tid på carbon film eller gennem kapillaritet minimeres. Den hurtige Trækmetode kan også bruges til tidsopløst analyse af prøver. Prøven kan være blandet med en ligand eller tilsætningsstof i en pipette tip til et sæt periode af tid, før ansøgningen til et gitter eller kun et øjeblik på gitteret overfladen før fiksering i millisekunder.

Dybde af pletten forpligtet til at give optimale billeder af en bestemt model er igen prøve afhængige2. Hvis pletten er også lavvandet, molekyler kan blive beskadiget af elektronstrålen men hvis pletten er for tyk strukturelle træk kan gå tabt. Pletten dybde er påvirket af flere faktorer såsom hydrofiliciteten af gitter overflade, jævnhed af kulstof lag, mængden af pletten anvendes til gitteret, varigheden af pletten er i kontakt med gitter før blotting, omfanget af blotting og tid det ta kes for gitter til helt tørt. Et gitter vil aldrig have en jævn fordeling af pletten hele sin helhed og områder af gitteret passer til imaging skal derfor vælges omhyggeligt. Faktisk, gitre ofte varierer i kvalitet, selv når forberedt samme dag på samme betingelser. Et godt eksempel på hvordan variation i pletten dybde påvirker udseendet af molekyler og passende pletten dybde af imaging tilbydes af Burgess mfl5.

Trods negative farvning er en meget alsidig, hurtig og enkel metode, er ikke alle biologiske prøver indstillet til visualisering af denne metode. Skrøbelige forsamlinger kan skjule eller demontere ved adsorption, farvning eller tørring på EM gitter22. Negative farvning kan også føre til udfladning af molekyler og fremkalde foretrukne retningslinjer af molekyler på kulstof support film7.

Negative pletten er et værdifuldt redskab til vurdering af enheder i sin egen ret, og også før cryo-EM analyse, men mange af de fysiske kræfter prøven møder i løbet af processen er dårligt forstået. Derfor, den bedste fremgangsmåde at bruge er meget prøve afhængige og bestemmes ved trial-and-error snarere end undervises efter en fast protokol.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige for Peter Knight til nyttige diskussioner og kritiske gennemgang af håndskriftet. Vi vil gerne takke alle medlemmerne af Neil Ranson og Stephen Muench labs og Bioanalytikere Astbury Biostructure til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (FP7/2007-2013) / ERC tilskudsaftale 322408. C-protein blev produceret ved hjælp af midler fra en British Heart Foundation grant (BHF PG/13/83/30485). Vi takker også Wellcome Trust for udstyr finansiering til støtte for Elektron Mikroskopi i Leeds (090932/Z/09/Z og 094232/Z/10/Z). CS er finansieret af en Wellcome Trust ISSF tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh copper EM grids Sigma-Aldrich G4776-1VL Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate Sigma-Aldrich 277908
Carbon evaporator Ted Pella Inc. 9620 Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate Sigma-Aldrich 9817
Dumont #5 negative pressure tweezers World Precision Instruments 501202 Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate Sigma-Aldrich 325570
Gadolinium Acetate Sigma-Aldrich 325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. AGAR Scientific AGG250-1
Microscope slides, white frosted Fisher Scientific 12607976 Or equivalent
Parafilm Fisher Scientific 10018130 Or equivalent
Pasteur pipette (glass) Fisher Scientific 10343663 Or equivalent
Razor blade Fisher Scientific 11904325 Or equivalent
Sandpaper Hardware store Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate Sigma-Aldrich 325872
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462
Sodium Phosphotungstate Sigma-Aldrich P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size). AGAR Scientific AGG252
Thulium Acetate Sigma-Aldrich 367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods Ted Pella Inc. 57-10 Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22450
Vacuum grease Fisher Scientific 12719406 Or equivalent
Whatman #1 Filter paper. Fisher Scientific 1001 090 Or equivalent
Whatman #40 filter paper Fisher Scientific 10674122 Or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  2. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  3. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  4. Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
  5. Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
  6. Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
  7. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  8. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
  9. Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
  10. Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
  11. Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
  12. Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
  13. Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
  14. Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
  15. Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179 (2015).
  16. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  17. Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
  18. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
  19. Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  20. Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
  21. Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
  22. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).

Tags

Biokemi sag 132 elektronmikroskopi Negative pletten biologiske TEM Blotting elektronmikroskopi gitre Carbon belægning

Erratum

Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 01/30/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Matthew G. Iadaza

to:

Matthew G. Iadanza

Variationer på Negative pletten Elektron Mikroskopi metoder: værktøjer til håndtering af udfordrende systemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G.,… More

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. J. Vis. Exp. (132), e57199, doi:10.3791/57199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter