Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Variasjoner på Negative flekken elektronmikroskop metoder: verktøy for å takle utfordrende systemer

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57199
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Astbury Biostructure Laboratory, University of Leeds

ERRATUM NOTICE

Summary

Negativ flekken EM er en kraftig teknikk for å visualisere macromolecular struktur, men ulike flekker teknikker kan produsere varierende resultater i en prøve avhengige måte. Her er flere negative flekker tilnærminger beskrevet i detalj å gi en første arbeidsflyt for å takle visualisering av utfordrende systemer.

Abstract

Negativ flekken elektronmikroskop (EM) kan relativt enkel og rask observasjon av makromolekyler og macromolecular komplekser gjennom bruk av motsetning styrke flekken reagens. Begrenset i oppløsning til maksimalt ~ 18-20 Å, negative flekken EM er nyttig for en rekke biologiske problemer og gir også en rask måte å vurdere prøver for cryo-elektronmikroskop (cryo-EM). Negativ flekken arbeidsflyten er enkel metode; prøven er adsorbert på et substrat, så en flekk er brukt, strøket og tørket for å produsere et tynt lag av elektron tett flekk der partikler er innebygd. Enkelte eksempler kan imidlertid fungere i markant forskjellige måter under varierende flekker forhold. Dette har ført til utviklingen av en rekke substrat forberedelser teknikker, negative flekker reagenser, og rutenettet vask og blotting teknikker. Bestemme den mest passende teknikken for hver enkelte eksempel må gjøres på et sak-til-sak grunnlag og en microscopist må ha tilgang til en rekke ulike teknikker for å oppnå høyeste kvalitet negative flekken resultatene. Detaljert protokoller for to forskjellige substrat forberedelse metoder og tre ulike blotting teknikker tilbys, og et eksempel på et utvalg som viser markant ulike resultater avhengig av metoden som brukes er vist. I tillegg er utarbeidelse av noen vanlige negative flekker reagenser, og to romanen transisjonsmetall flekker, beskrevet med diskusjon om bruken av hver.

Introduction

Til tross for siste oppmerksomheten til oppløsningen flekken revolusjon skyldes betydelige fremskritt i cryo-elektron mikroskopi1 (cryo-EM), negative EM restene en kraftig teknikk og en viktig del av elektron microscopists' verktøykassen. Negativ flekker fortsatt den beste metoden for rask vurdering av en prøve tidligere optimizing cryo-rutenettet forhold2. Høykontrast og hastighet for rutenettet negative farget prøver gjør det ideelt for å vurdere eksempel renhet, konsentrasjon, heterogenitet og conformational fleksibilitet3. Mange biologisk informativ strukturer har resultert fra negative flekken rekonstruksjoner, til tross for den teknikken oppløsning blir begrenset til ~ 18 Å oppløsning4,5,6, og noen prøver gi bedre resultater i flekk enn cryo-EM for en rekke grunner7.

I negativ flekken EM, partikkel rundt adsorbert på overflaten av et EM rutenett og omsluttet av en amorf matrise av elektron tett flekken sammensatte. En relativ Høykontrast er produsert mellom bakgrunnen og partikkel av interesse, med partikkel blir mindre elektron tett enn de omkringliggende flekk8. Partiklene vises som lyse områder på grunn av deres lave elektron spredning fullmakt til tett rundt flekken, som sprer elektronene mer og mørkere. Substructural funksjoner partikler kan utledes fra detaljert undersøkelse av resulterende bildene som flekken vil trenge inn alle fugemunnstykke og produsere uregelmessig kontrast detalj9.

Negativ farging prosessen begynner med utarbeidelse av en støtte substrat som eksempel partiklene er fanget og laget av tørkede flekken støttes. Mest brukte støtte underlaget er et lag av amorfe karbon, noen ganger støttes av et tynt lag av polyvinylacetat (f.eks Formvar) eller nitrocellulose (f.eks Collodion) polymer. Disse underlag kan kjøpt kommersielt eller forberedt huset ved hjelp av protokoller som beskrevet nedenfor.

Når støtte underlaget er klargjort, prøven kan brukes og overflødig løsningen tas av. Prøver bør bli suspendert i en egnet buffer for negative flekker. Det er best å unngå bruk av fosfatbuffer og høye salt konsentrasjoner, som kan gi opphav til krystallinsk precipitates som kan skjule prøven. Reduserer agenter, vaskemidler, sukrose, glyserol og høye konsentrasjoner av nukleotid bør også unngås som de påvirker også flekken kvalitet4. Når bufferen sammensetningen kan ikke endres, vaske overflaten av EM rutenettet med vann eller en mer egnet buffer etter adsorpsjon og før flekker kan redusere dannelsen av buffer relaterte gjenstander og generelt bedre flekk bakgrunnen. Hvis bufferen gjenstander er mistenkt, kan det være informativ stain et buffer-bare rutenett for å avgjøre hvis bufferen komponentene er kilden til de observerte gjenstandene.

Når prøven er adsorbert, og strøket og vasket eventuelt, brukes en flekker reagens. En rekke reagenser har blitt funnet for å være effektiv negative flekker (tabell 1), men flekken må velges for prøven. En "halo" flekken former rundt partikkel på grunn av både forskyvning av flekken molekyler av regionene hydrofobe protein og frastøting av belastet grupper. Flekken må derfor velges slik at protonation tilstanden til alle potensielle ladet grupper på protein er det samme som flekken på arbeider pH. Motsatt avgifter på overflaten av proteinet kan bidra til en positiv flekker effekt, som selv om en nyttig teknikk i sin egen rett10 ikke er i omfanget av dette dokumentet. Mest brukte negative flekker reagensene er uranyl acetate og uranyl formiat. Disse flekker har en relativt finkornet størrelse (4-5 Å)9 og tilbyr høyere oppløsning over andre flekker som phospho-tungstates (8-9 Å kornstørrelse)9,11, ammonium molybdate11og noen transisjonsmetall-basert flekker12. Uranyl acetate og formiat også fungere som et bindemiddel, bevare mange protein-protein interaksjoner på et millisekund tid skala13, selv om den lave pH av flekken og sin hang til å utløse på fysiologisk pH kan være skadelig for eksempler14 . Til tross for sin nytteverdi presentere uranyl salter også logistiske utfordringene som de er både giftige og mildt radioaktive, som kan kreve spesiell håndtering, oppbevaring, og disposisjon krav, som fører noen brukere å søke ikke radioaktiv alternativer.

Det finnes et stort utvalg av metodene beskrevet for substrat forberedelse, eksempelprogram, og flekker av EM nett. Mest hensiktsmessige metoden som skal brukes er eksempel avhengige og kan være vanskelig å fastslå når takler et nytt system. Dette manuskriptet beskriver to metoder for substratet og tre blotting metoder; siden blotting, flicking5og rask rødme15. Side-blotting er den enkleste av metodene. Både metoden flicking og rask trekkmetoden er vanskeligere å implementere, men begrense utvalget med støtte filmen før fiksering kontakt tid og har vist seg å forbedre dannelsen av flekken gjenstander for noen prøver5. Målet med dette manuskriptet er dermed å gi en første arbeidsflyt for å takle visualisering av utfordrende systemer av negative-flekken EM.

Protocol

1. forberedelse av EM rutenett

  1. Karbon ark metode
    1. Forberede en fersk kløyvde glimmer ark.
      1. Forsiktig sett en presisjon sprøyte nål eller et barberblad i et hjørne av glimmer arket, noen mm mellom lagene. Sett verktøyet som vertikale sentrum av arket som mulig for å produsere to stykker av omtrent samme tykkelse.
      2. Nøye ing hverandre de to halvdelene av glimmer arket. Gjøre dette kan av øyet, eller under dissecting mikroskop.
      3. Klipp av ett av hjørnene av nylig kløyvde glimmer arkene. I tilfelle at arket svinger i karbon fordamperen under vakuum utgivelsen, kan karbon belagt side av arket identifiseres.
    2. Plassere kløyvde glimmer ark/s i kammeret av en karbon fordamperen, med fersk kløyvde overflaten grossist.
    3. Kontroller at karbon fordamperen er satt opp riktig med en skikkelig forberedt karbon elektrode.
      Merk: Metode for å forberede den karbon stenger, varierer etter spesifikasjonene til karbon fordamperen. En protokoll for ett instrument er slik til trinn 1.1.5.
      1. Skjerpe en karbon stang med en knivsliper å har en skarp spiss og deretter Polen med et papirhåndkle fjerne eventuelle grove grader.
      2. God sandpapir flat slutten av andre stang og igjen polske det glatt med et papirhåndkle.
      3. Plass to karbon stenger i fordamperen i henhold til produsentens instruksjoner. Sikre skjerpet slutt på første stangen gjør fast kontakt med flat overfor andre stangen.
    4. Sett en liten bit av ren, tørr filter papir delvis under glimmer hvis karbon tykkelsen skal avleses visuelt. Alternativt sted en hvit mattslipt microscope skyve med en liten dab av vakuum fett sammen med glimmer å måle karbon tykkelse.
    5. Innskudd karbon på glimmer i henhold til produsentens instruksjoner.
      1. Pumpe vakuum ned og vent til det er 10-5 mbar. Sett spenningen av elektroden 4.0 V (opptil 5 V kan være nødvendige, avhengig av hvor karbon stang).
      2. Kjøre flere korte pulser av ca 3,5 s i varighet elektroden innskudd 1-2 nm tykk evaporations karbon glimmer overflaten.
        Merk: Som strøm brukes til karbon stangen vil gløden rød og så hvit. Ikke stirr på sterkt lys da dette kan skade øynene.
      3. Tillate karbon innskudd av glimmer til ønsket tykkelse er nådd, målt ved karbon fordamperens tykkelse gauge eller visuell observasjon av karbon avsatt på filter papir eller microscope skyve. Kontroller at det endelige karbon laget er 5-10 nm tykk.
        1. Hvis karbon tykkelsen er gauged visuelt sammenligne den frostet delen av mikroskopet lysbildet belagt med vakuum fett å eksponert område, vil det bli mørkere som mer karbon er avsatt.
          Merk: Det finnes ingen kvantitativ metode å avgjøre karbon tykkelse når du bruker denne metoden.
    6. Vent vakuum kammeret og fjern den karbon-belagt glimmer fra karbon fordamperen.
      Merk: Karbon-belagt glimmer kan stå for å avgjøre over natten før du fortsetter med neste trinn
    7. Bruke en av to vann beholdere flyte karbon filmen på EM-rutenett: en beholder med en bunnventil nederst så vann kan dreneres og karbon laget senket på de venter på nett eller en løft rigg som rutenettet kan angis under vann overflate, som senere kan øke rutenettet til karbon filmen på vannoverflaten.
    8. Beholderen fylles med ultrapure destillert vann slik at overflaten av vannet er ca 5 mm fra toppen. Rengjør overflaten av vann ved å dra et eller to av linseklut over overflaten for å fjerne eventuelle flytende partikler.
    9. Plasser et rent rustfritt stål netting (1 tomme x 2,5 tommer er en passende størrelse) under overflaten av vannet.
    10. Med en fin pinsett, lå ren og tørr EM rutenett forsiden opp (i henhold til produsentens beskrivelse) på rustfritt stål mesh. Pack rutenettene sammen så tett som mulig, men ikke la dem overlappe.
    11. Når rutenettet er ordnet, fast grep karbon belagt glimmer arket i et par pinsett eller film utvikle tang.
    12. Innføre glimmer arket i vannet. Kontroller at dette er gjort i svært grunt vinkel (~ 10 grader).
      Merk: Glimmer bør bryte gjennom vannflaten og dukke, mens karbon filmen bør skille fra glimmer og flyter på vannoverflaten. Dette trinnet bør ikke utføres direkte over rutenett, for å unngå skade og/eller forurensning.
      1. For å minimere muligheten for karbon filmen vil ikke skille fra glimmer arket, score rundt kanten av glimmer et barberblad eller kuttet et hjørne med liten saks før innføre den i vannet.
    13. Når carbon filmen har enebolig, fjerne glimmer arket eller la den falle til bunnen av beholderen.
    14. Ved hjelp av fine tippet pinsett, gjelder svært lett trykk og med langsomme bevegelser guide karbon filmen over toppen av rutenettet.
    15. Ta karbon arket i kontakt med overflaten av rutenettene enten ved sakte drenering av vann eller høyne løfte ringen, avhengig av apparater.
    16. Nøye løft rustfritt stål mesh (nå med karbon-belagt rutenett) fra apparatet og veken bort noen av overflødig vann med filter papir. Kontroller at dette er gjort av berøre filter papir til utkanten av stål mesh, men ikke kommer i kontakt med rutenett eller karbon film.
    17. Sett maskene på nett i en Petriskål som inneholder litt tørr filter papir og la det tørre helt.
      Merk: Dette er best påvirket av tørke over natten i romtemperatur, men trinnet kan være raskere ved å plassere rutenettene i en ovn på ca 60 ° C.
  2. Flyte og frakk (direkte karbon deponering). Denne metoden har blitt beskrevet i detalj tidligere16
    1. Fylle en ren stor glassbolle til randen med destillert vann så en menisk danner øverst.
    2. Bruke en eneste dråpe collodion løsning (nitrocellulose i amyl acetate) på overflaten av vannet med en ren pasteur pipette, tillate slippverktøyet til spredt og tørke. Når tørr vises et tynt lag av collodion flyte over vannflaten.
    3. Fjern collodion laget med en tannpirker fjerne støv eller andre forurensninger fra overflaten av vannet.
    4. Bruke en andre collodion dråpe vann og la det spredt og tørt for 2-3 minutter.
      Merk: Gjenta trinn 1.2.3-1.2.4 til en flat og rynke gratis ark collodion hentes.
    5. Med en fin pinsett sted EM rutenett forsiden ned (i henhold til produsentens beskrivelse) på flytende collodion ark. Pakke rutenettene sammen tett i et Sekskantet utvalg, men ikke la dem overlappe.
      Merk: Hvis et rutenett er forlagt eller plassert opp-ned er det vanligvis best å la den i sted i stedet for å risikere å ødelegge det collodion arket når du prøver å flytte den.
    6. Når alle rutenettene er plassert, forsiktig lå et ark filter over dem. La papiret å bli mettet av kapillær handling.
      Merk: Enhver størrelse eller tykkelsen på filter papir er riktig hvis den helt dekker rutenettet.
    7. Bruk en tannpirker for å fjerne noen collodion film som strekker seg utover filter papir.
    8. Grip filter papir på kanten og skrelle den fra vannoverflaten.
      Merk: Rutenettene bør holde adhered til papiret.
    9. Plasser papiret flatt og collodion-ansikt opp i en Petriskål og la den tørke helt.
    10. Plass filteret papiret rutenettene i kammeret av en karbon fordamperen med en skikkelig forberedt karbon elektrode som beskrevet i 1.1.2.
    11. Følg karbon fordampning prosedyren som metoden karbon ark i
  3. Tillate flere sekunder mellom pulser å unngå overoppheting og skade nitrocellulose arket.
    Merk: Hvis ønskelig polymer laget kan fjernes etter at rutenettet har vært karbon belagt, men dette er sjelden nødvendig. Plasser nett karbon siden opp på en frisk filter papir og sette flere dråper aceton på papiret nær, men ikke på rutenettet. Tillate aceton spredt ut under rutenettet oppløse og absorbere polymer laget.

2. forberedelse av Negative flekker reagenser

  1. Utarbeidelse av Uranyl Acetate
    1. Ta en liten mengde ultrapure vann til en byll og la det koke i 10 min å grundig degas. La den avkjøles litt og deretter bruke det til å oppløse uranyl acetate (UA) på 1-2% (w/v).
      Merk: Denne fremgangsmåten i en røyk skap og med riktig personlig verneutstyr.
    2. Når løsningen er avkjølt, filtrere gjennom en 0,2 µm sprøyte eller filter.
    3. Lagre UA beskyttet fra lys og 4 grader. Løsningen er stabil i opptil 1 år.
  2. Utarbeidelse av Uranyl formiat fra pulver. Denne metoden har blitt beskrevet i detalj tidligere8
    1. Oppløse 20 mg uranyl formatter (UF) pulver i 2 mL degassed ultrapure vann (som i trinn 2.1.1) ved røring.
    2. Mens du fortsetter å røre, kan du legge 8 µL av 5 M NaOH, løsningen skal endres til en mørkere gul farge, men ikke utløse bør danne.
    3. Filtrere løsningen gjennom en 0,2 µm sprøyten.
    4. Butikken UF flekken beskyttet mot lyset. Forkast flekken bør hvis noen utløse eller brun misfarging er observert. Løsningen er bare stabil i 1-2 dager.
  3. Utarbeidelse av Uranyl formiat fra Uranyl Acetate
    1. Utløse 1 mL 1% (w/v) UA flekken ved å legge til 100 µL av 1 M NaOH.
    2. Sentrifuge blandingen i 2 minutter på maksimal hastighet i en Borstemmaskin sentrifuge.
    3. Forkast alle nedbryting og oppløse bunnfall i 100 µL av 5% (v/v) maursyre av energisk vortexing.
    4. Fortynne til et siste volum 1 ml med 900 µL ultrapure vann å gi UF flekken i 0,5% (v/v) maursyre.
    5. Butikken UF flekken beskyttet mot lyset. Kast flekken hvis noen bunnfall eller brun misfarging er observert.
  4. Utarbeidelse av andre flekker reagenser
    1. Utarbeidelse av transisjonsmetall Acetate flekker
      1. Oppløse Samarium Acetate (SmAc), Gadolinium Acetate (GdAc), Thulium Acetate (TmAc) eller Erbium Acetate (ErAc) på 1-2% (w/v) i ultrapure vann.
        Merk: Hvis prøver viser positive flekker eller dårlig tilslutning til rutenettet når du bruker disse flekker, de kan være acidified med opptil 0,5% (v/v) maursyre. Positiv flekker resulterer i eksemplet vises som et mørkt objekt omgitt av en hvit halo. Dårlig tilslutning til rutenettet vil medføre færre molekyler enn forventet å bli observert på rutenettet.
    2. Utarbeidelse av Ammonium Molybdate og natrium Phosphotungstate
      1. Oppløse flekken på 1-3% (w/v) i ultrapure vann. Justere pH 7.0 med 5 M NaOH hvis ønsket.

3. adsorbing prøver å karbon substrat og flekker

  1. Utarbeidelse av rutenettet overflaten for eksempelprogram ved å gjengi det Hydrophilic
    1. Plass rutenettet vendt opp på et mikroskop lysbilde i en glød utslipp enhet.
    2. Behandle rutenettet for minst 30 s 10 mA.
      Merk: Den nøyaktige metoden glød utslipp vil avhenge spesifikasjonene for bestemt stykke utstyret brukes.
    3. Alternativt kan dette gjøres av UV bestråling i 10 minutter med en Borstemmaskin UV-lampe4.
  2. Side Blotting metode. Denne metoden har blitt beskrevet i detalj tidligere8
    1. Grep kanten av rutenettet med et par negative trykket pinsett, og 3-5 µL av prøve gjelder støtte overflaten.
    2. Lar prøve å adsorberes til rutenettet overflaten for 10 å 1 min. Optimaliser adsorpsjon tiden må for individuelle prøver.
    3. Touch kanten av rutenettet til et ark filter og tillater kapillær handlingen å trekke av væsken.
    4. Valgfritt: Vask rutenettet. Sted 50 µL drops ultrapure eller aktuelle flyktige buffer løsning på et laboratorium film. Forsiktig ta karbon overflaten av rutenettet til drop og løft av en liten dråpe på overflaten av rutenettet. Touch kanten av rutenettet til et ark filter og tillater kapillær handlingen å trekke av væsken.
    5. Gjenta dette trinnet for vask så mange ganger som ønsket.
    6. Sted to 50 µL dråper flekker reagens på et laboratorium film.
    7. Forsiktig ta karbon overflaten av rutenettet til drop og løft av en liten dråpe på overflaten av rutenettet.
      Merk: Hvis flekken overfører til baksiden av rutenettet og rutenettet skal bli forkastet.
    8. Touch kanten av rutenettet til et ark filter og tillater kapillær handlingen tegne av væske. Utføre dette flekker trinnet to ganger.
    9. Tillate rutenettet til luften tørr eller tørr under en glødepære.
  3. Flicking metode
    1. Grep kanten av rutenettet med et par negative trykket pinsett, og 3-5 µL av prøve gjelder støtte overflaten.
    2. Holder pinsett i en hånd, slik at rutenettet har en vinkel på ca 45° rettet bort, raskt bla håndleddet til hånden til å "Bla av" fleste slippverktøyet som er over rutenettet.
    3. Valgfritt: Bruker et glass Pasteur pipette Påfør en dråpe vaskeløsning til støtte overflaten og flick av som 3.2.2. Gjenta etter behov.
    4. Et glass Pasteur pipette Påfør en dråpe flekker reagens til støtte overflaten og flick av som 3.2.2. Gjenta 1 - 3 ganger avhengig flekken dybde kreves for visualisering av prøven.
      Merk: Dette er ikke den eneste faktoren som attributtene til siste flekken dybde (se diskusjon).
    5. Fjern overflødig stain ved å trykke på revet kanten av filter papir til kanten av rutenettet.
    6. Tillate rutenettet til luften tørr eller tørr under en glødepære.
  4. Rask Trekkmetode
    1. Tegne 30-70 µL av flekk (1% UA vanligvis brukt) i spissen av en 200 µL pipette, gjøre volumet ringe å trekke opp 5 µL av luft, og deretter trekke opp vask/miksing reagens (5-30 µL), hvis nødvendig, etterfulgt av en annen liten luftspalte og deretter trekke opp 5 µL av prøven.
    2. Grep kanten av et rutenett med et par negative trykket pinsett, holde pinsett slik at rutenettet har en vinkel på ca 45° vendt fra forskeren, kaste ut hele innholdet pipette tips over ansiktet av karbon-belagt EM rutenettet.
    3. Fjern overflødig stain ved å trykke på revet kanten av filter papir til kanten av rutenettet.
    4. Tillate rutenettet til luften tørr eller tørr under en glødepære.
      Merk: For alle metodene er det tilrådelig å skyve revet kanten av arket filter langs tang til den når rutenettet som dette fjerner løsning fanget mellom de to sidene av tang, som kan trekke tørket rutenettet i kjevene av Tang når de er åpnet. Rutenettet i pinsett kan også plasseres på kanten av avtrekksvifte tørke. Konstant luftstrømmen kan hjelpe produsere mer selv flekker.

Representative Results

Alle flekker reagensene testet produsert negative farging til en viss grad, med UF gir prøvene med høyest kontrast og skarpeste, mest detaljerte partikler. For dypt innebygd eksempler (figur 1) transisjonsmetall basert flekker ErAc og TmAc produsert negative farging av tilsvarende kvalitet til UA som dømmes av tydelig kontrast og skarphet av fargede partikler, produserende med TmAc klarere, mer skarpe bilder enn ErAc. Selv om større korn størrelsen på TmAc blir tydelig i forstørring, når tobakk mosaikk Virus (TMV) partikler var farget med 1% TmAc ~ 23 Å gjenta av TMV partikkel17 var fortsatt godt synlig av øyet og meridional lag linje i den Fourier-transformere rå bildet. Ingen andre transisjonsmetall flekker testet, ErAc, SmAc eller GdAc, var løse denne funksjonen. Klassen gjennomsnitt ble generert ved å trekke ut overlappende deler fra TMV partikler der spiralformede gjenta var synlig. Utdraget segmentene ble deretter justert og klassifisert bruker RELION18 bedre visualisere funksjonen periodisk (figur 2).

Noen eksempler er spesielt følsomme for metoden for flekker, slik som muskelen avledet C-protein. C-protein, som består av en fleksibel rekke Ig og Fn-lignende domener, gir betydelig forskjellige bilder av negative-flekken EM avhengig av metoden for farging brukt (Figur 3). Når bruke metoden side-blotting kollapset er ring-lignende strukturer observert, mens når farget av rask rødme eller flicking metoder, C-protein er observert som en rekke domener som ligner perler på en snor.

Reagens Konsentrasjon pH Type
Ammonium Molybdate 1 - 2% 5 – 7 Anionic
Erbium acetate (ErAc) 1-2% 6 Kationisk
Gadolinium Acetate (GdAc) 1-2% 6 Kationisk
Methylamine tungstate 2% 6 – 7 Anionic
Samarium acetate (SmAC) 1% 6 Kationisk
Natrium silicotungstate 1-5% 5 – 8 Anionic
Natrium phosphotungstate 1 -3% 5 – 8 Anionic
Thulium Acetate (TmAc) 1-2% 6 Kationisk
Uranyl Acetate (UA) 1-3% 3-4 Kationisk
Uranyl formatter (UF) 0,75-1% 3-4 Kationisk

Tabell 1: Noen vanlige negative flekker reagenser.

Figure 1
Figur 1: eksempel micrographs av tobakk mosaikk Virus beiset med ulike negative flekken reagenser (A) 1% UF (B) 2,5% TmAc (C) 2,5% ErAc. (D) 1% UA (E) 2,5% GdAc og (F) 2,5% SmAc. Skala barer er 100 nm. Representant bilder fra flere gjentak med flere områder fotografert per replikere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: flekker tobakk mosaikk Virus med Thulium acetate (A) forstørring av området fra et mikroskop-bilde av TMV beiset med 1% TmAc. Skala bar er 20 nm. (B) klasse gjennomsnitt på utdraget TMV segmenter. (C) Fourier-transformere bildet i panelet A viser lag linje refleksjoner ~ 23 Å. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: effekter av blotting metoden på konformasjon av C-protein. (A) C-protein farget med UA side blot metoden og (B) flicking metoden. Øvre panel skala bar er 50 nm, nedre panelet skala bar er 20 nm. Representant bilder fra flere gjentak med flere områder fotografert per replikere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette manuskriptet beskriver flere metoder for negative farging av prøver for elektronmikroskop bruker en rekke flekker reagenser, inkludert to romanen transisjonsmetall reagenser (TmAc og ErAc). Mange av disse trinnene av negative farging prosessen må være optimalisert for individuelle prøver inkludert valg av flekken, vaske nødvendig hvis noen og blotting teknikken. Dette manuskriptet gir dermed grunnlag for microscopists å utvikle egne arbeidsflyter for å takle de negative flekker av utfordrende systemer.

Valget av flekken er svært prøve avhengige. Prøver som er spesielt følsomme for lav pH kan være dårligere UA og/eller UF, til tross for etappe, den stabiliserende egenskaper for disse flekker19. I disse tilfellene basert transisjonsmetall flekker som TmAc eller ErAc kan være mer passende, men samlet pH av preparatet må holdes under isoelectric punktet av prøve protein for å hindre positiv flekker. Dette kan oppnås ved forsurende flekken med eddiksyre om nødvendig. For spesielt lav pH følsom prøver, kan anionic tungstate eller molybdate flekker være mer effektiv. Selv om disse flekker er funnet for å indusere dannelsen av gjenstander i noen tilfeller, som dannelsen av rouleaux i lipoprotein eksempler20. Igjen, pH flekken må justeres, denne gangen til over isoelectric punktet av prøven, å forhindre positiv flekker.

Vask av prøven før flekker kan være nødvendig hvis bufferen som prøven har bevart har en høy salt eller fosfat komponent. I mange tilfeller vask kan utføres med ultrapure vann, men for mer følsomme prøver, som kan redusere eller gjennomgå strukturelle endringer når de utsettes for vann alene, vask må utføres med en flyktig buffer av lav ioniske styrke8. Selv under nøye kontrollerte forhold, kan vask resultere i noen strukturelle omorganisering på karbon overflaten21.

Metoden som et rutenett er utarbeidet i prøven adsorpsjon, blotting og flekker kan også påvirke hva er observert. Den mest hensiktsmessige metoden er dermed igjen, svært prøve avhengige. C-protein, for eksempel er observert som en globular ring-lignende struktur etter siden-blot flekker, men dette synes å være en gjenstand av farging prosessen, som når rutenett tilberedes av metoden flicking (eller rask trekkmetoden) (Figur 3 ). De flicking og rask trekkmetodene, tiden utvalget har å samhandle med karbon støtte overflaten før fiksering er minimert15. Prøven erfaringer også færre styrker fra den viker meniscus etter blotting før fiksering. Dette betyr at strukturelle endringer i prøven som kan oppstå ved langvarig absorpsjon tid på karbon filmen eller gjennom kapillære handling er minimert. Rask trekkmetoden kan også brukes for tid-løst analyse av prøver. Prøven kan blandes med en ligand eller additiv i en pipette tips for et sett perioden før programmet til et rutenett eller bare et øyeblikk på rutenettet overflaten før fiksering i millisekunder.

Dybden på flekken nødvendig å gi optimale bilder av en bestemt er igjen eksempel avhengige2. Hvis flekken er for tynt, molekyler kan bli skadet av elektronstråle men hvis flekken er for tykk strukturell funksjoner kan gå tapt. Flekk dybde påvirkes av flere faktorer som hydrophilicity av rutenettet overflaten, jevn karbon laget, hvor mye flekken brukes til rutenettet, hvor lenge flekken er i kontakt med rutenettet før blotting, omfanget av blotting og tiden det ta Kes for rutenettet til helt tørt. Et rutenett vil aldri ha en jevn distribusjon av farge i sin helhet og derfor områder av rutenettet passer for bildebehandling må velges nøye. Faktisk varierer rutenett ofte i kvalitet, selv når forberedt på samme dag under like forhold. Et godt eksempel på hvordan variasjon i flekken dybde påvirker utseendet til molekyler og riktig flekken dybden for imaging leveres av Burgess et al5.

Til tross for negative flekker en svært allsidig, rask og enkel metode, er ikke alle biologiske prøver mottakelig for visualisering av denne metoden. Skjøre samlinger kan skjule eller demontere på adsorpsjon, flekker eller tørke EM rutenettet22. Negativ flekker kan også føre til sammenslåing av molekyler og indusere foretrukne orientering av molekyler på karbon støtte filmen7.

Negativ flekken er et verdifullt verktøy for vurdering av eget og også før cryo-EM analyse, men mange av de fysiske kreftene prøven oppstår under prosessen er dårlig forstått. Derfor den beste måten å bruke er svært prøve avhengige og må avgjøres av prøving og feiling snarere enn undervist etter en bestemt protokoll.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi er svært takknemlig til Peter Knight for nyttig diskusjoner og kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi ønsker å takke alle medlemmer av Neil Ranson og Stephen Muench labs og Astbury Biostructure laboratoriet staff for nyttig diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av den europeiske Research Council (FP7/2007-2013) ERC støtte avtalen 322408. C-protein er produsert med ressurser fra British Heart Foundation stipend (BHF PG/13/83/30485). Vi takker også Wellcome Trust for utstyr finansiering for å støtte elektronmikroskop i Leeds (090932/Z/09/Z og 094232/Z/10/Z). CS er finansiert av Wellcome Trust ISSF stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh copper EM grids Sigma-Aldrich G4776-1VL Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate Sigma-Aldrich 277908
Carbon evaporator Ted Pella Inc. 9620 Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate Sigma-Aldrich 9817
Dumont #5 negative pressure tweezers World Precision Instruments 501202 Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate Sigma-Aldrich 325570
Gadolinium Acetate Sigma-Aldrich 325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. AGAR Scientific AGG250-1
Microscope slides, white frosted Fisher Scientific 12607976 Or equivalent
Parafilm Fisher Scientific 10018130 Or equivalent
Pasteur pipette (glass) Fisher Scientific 10343663 Or equivalent
Razor blade Fisher Scientific 11904325 Or equivalent
Sandpaper Hardware store Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate Sigma-Aldrich 325872
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462
Sodium Phosphotungstate Sigma-Aldrich P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size). AGAR Scientific AGG252
Thulium Acetate Sigma-Aldrich 367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods Ted Pella Inc. 57-10 Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22450
Vacuum grease Fisher Scientific 12719406 Or equivalent
Whatman #1 Filter paper. Fisher Scientific 1001 090 Or equivalent
Whatman #40 filter paper Fisher Scientific 10674122 Or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  2. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  3. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  4. Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
  5. Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
  6. Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
  7. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  8. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
  9. Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
  10. Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
  11. Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
  12. Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
  13. Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
  14. Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
  15. Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179 (2015).
  16. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  17. Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
  18. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
  19. Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  20. Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
  21. Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
  22. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).

Tags

Biokjemi problemet 132 elektronmikroskop Negative flekken biologiske TEM Blotting elektronmikroskop rister karbon belegg

Erratum

Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 01/30/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Matthew G. Iadaza

to:

Matthew G. Iadanza

Variasjoner på Negative flekken elektronmikroskop metoder: verktøy for å takle utfordrende systemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G.,… More

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. J. Vis. Exp. (132), e57199, doi:10.3791/57199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter