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Biology

ठहराव of Site-विशिष्ट प्रोटीन Lysine Acetylation और Succinylation Stoichiometry का उपयोग डाटा-स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57209
Automatic Translation
1, 1, 1
1Buck Institute for Research on Aging

Summary

यहां, हम साइट के निष्पक्ष ठहराव-विशिष्ट प्रोटीन acetylation और/या succinylation अधिभोग (stoichiometry) एक पूरे proteome के ratiometric संशोधनों के एक अंतर्जात विश्लेषण के माध्यम से मात्रात्मक के बाद शुरू संशोधनों के लिए उपस्थित रासायनिक acylation प्रयोग गर्ने स्थिर आइसोटोप-त्यसपछि anhydrides. संवेदनशील डेटा के साथ संयोजन में स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री, सटीक साइट अधिभोग माप प्राप्त कर रहे हैं ।

Abstract

NƐ-acylation द्वारा प्रोटीन lysine अवशेषों की पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (PTM), उदाहरण के लिए, एंजाइमी गतिविधि को परिवर्तित करके या मध्यस्थता करने वाली सहभागिता से संरचनात्मक परिवर्तन लाती है जो प्रोटीन फ़ंक्शंस को विनियमित कर सकता है । साइट-विशिष्ट प्रोटीन acylation अधिभोग, या stoichiometry की सटीक ठहराव, दोनों वैश्विक कम स्तर stoichiometry और विशिष्ट acylation के व्यक्तिगत उच्च स्तरीय stoichiometry lysine के कार्यात्मक परिणामों को समझने के लिए आवश्यक है अवशेषों. अन्य समूहों के माप की रिपोर्ट है lysine acetylation stoichiometry के अनुपात की तुलना करके पेप्टाइड का प्रणेता आइसोटोप अंतर्जात से, प्राकृतिक बहुतायत acylation और exogenous, भारी आइसोटोप-लेबल acylation के बाद पेश मात्रात्मक स्थिर आइसोटोप का उपयोग प्रोटीन का रासायनिक acetylation-त्यसपछि एसिटिक एनहाइड्राइड. इस प्रोटोकॉल सहित कई सुधार की विशेषता एक अनुकूलित दृष्टिकोण का वर्णन: (1) रासायनिक acylation क्षमता में वृद्धि हुई, (2) acetylation के अलावा प्रोटीन succinylation को मापने की क्षमता, और (3) बेहतर मात्रात्मक सटीकता के कारण डेटा-निर्भर अर्जन (डीडीए) से पूर्ववर्ती आयन संकेत के बजाय डेटा-स्वतंत्र अर्जन (व्यास) से अंश आयन ठहराव का उपयोग करके कम हस्तक्षेप । ठहराव के लिए टुकड़ा आयनों से निकाले चोटी के क्षेत्रों का उपयोग भी विशिष्ट साइट स्तर के भेदभाव सक्षम बनाता है proteolytic पेप्टाइड्स से एक से अधिक lysine अवशेषों, जो अग्रदूत आयन का उपयोग संभव नहीं है से युक्त acylation stoichiometry ठहराव के लिए संकेत । क्षितिज में डेटा विज़ुअलाइज़ेशन, एक खुला स्रोत मात्रात्मक प्रोटियोमिक् वातावरण, सुविधाजनक डेटा निरीक्षण और समीक्षा के लिए अनुमति देता है. साथ में, यह कार्यप्रवाह किसी संपूर्ण proteome के साइट-विशिष्ट lysine acetylation और succinylation अधिभोग के निष्पक्ष, सटीक और सटीक ठहराव प्रदान करता है, जो जैविक रूप से प्रासंगिक acylation साइटों को प्रकट और प्राथमिकता दे सकता है ।

Introduction

NƐ-प्रोटीन lysine अवशेषों का acylation प्रोटीन फंक्शन का एक महत्वपूर्ण नियामक है । Lysine acetylation और अंय acylations, जैसे succinylation, malonylation, और glutarylation, के लिए चयापचय, सेल संकेतन, और अंय सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए लगा रहे है1,2,3,4 , और चयापचय विकारों में निहितार्थ5है । कई अध्ययनों से पाया है कि lysine acyl संशोधनों स्तनधारी ऊतकों और सेल लाइनों में विभिन्न स्थितियों के तहत बड़े गुना परिवर्तन से गुजरना5,6,7,8 के रूप में अच्छी तरह के रूप में बैक्टीरिया9,10,11, तथापि, इन सापेक्ष गुना परिवर्तन अंतर्दृष्टि कुल प्रोटीन संशोधित के अनुपात में प्रदान नहीं करते । अध्ययन acylation साइट अधिभोग के माप रिपोर्टिंग दुर्लभ है12,13,14, प्रासंगिकता और ऐसे अध्ययनों के लिए जरूरत के रूप में वे रिश्तेदार गुना परिवर्तन से अधिक विस्तार प्रदान करने के बावजूद । उदाहरण के लिए, 10-गुना परिवर्तन 0.01 से 0.1%, 1 से 10%, या 10 से 100% तक साइट अधिभोग वृद्धि का प्रतिनिधित्व कर सकता है । सटीक stoichiometry मापन acylation के जैविक महत्व की व्याख्या करने के लिए और प्रोटीन संरचनात्मक की भयावहता के बारे में प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए आवश्यक हैं, और संभवतः, कार्यात्मक परिवर्तन.

एक पिछले विधि के लिए साइट अधिभोग का उपयोग करता है भारी स्थिर-unlysine अवशेषों की लेबलिंग-आइसोटोप रासायनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा करने के लिए अंतर्जात "प्रकाश" acetylation की तुलना में exogenous के बीच अनुपात को मापने के लिए, रासायनिक-लेबल "भारी" एसिटाइल-lysine का उपयोग कर प्रणेता आयन तीव्रता12. झोउ एट अलद्वारा हाल ही में एक अध्ययन । 13 lysine acetylation stoichiometry का आकलन करने के लिए एक समान दृष्टिकोण वर्णित है कि यह भी स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के साथ प्रोटीन में सभी अनसंशोधित lysine अवशेषों का एक पूरा रासायनिक acetylation कार्यरत है, लेकिन द्वारा मापा के रूप में टुकड़ा आयन तीव्रता इस्तेमाल किया डीडीए. Nakayasu एट अल. 14 एक समान डीडीए दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, लेकिन इसके बजाय ठहराव के लिए प्रकाश और भारी एसिटाइल-lysine immonium आयनों के अनुपात का इस्तेमाल किया । ठहराव टुकड़े आयनों, immonium या अनुक्रम आयनों (MS2) पर आधारित है, ज्यादातर मामलों में कम संकेत हस्तक्षेप में बरकरार पेप्टाइड अग्रदूत आयनों (MS1) प्रसंस्करण की तुलना में परिणाम. हालांकि, डीडीए से टुकड़ा आयनों के ठहराव-ms/एमएस स्पेक्ट्रा stochastic नमूना की कमी है, जहां उच्च बहुतायत अग्रदूत आयनों और एमएस के लिए चयनित होने की संभावना है से पीड़ित कर सकते हैं/ms और इस प्रकार, एक पक्षपाती और अपूर्ण नमूने के लिए नेतृत्व अग्रदूत आयनों ।

यह उपंयास कार्यप्रवाह4 (चित्रा 1) मूल रूप से Baeza एट अलद्वारा विकसित एक स्थिर आइसोटोप रासायनिक लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग करता है. 12, लेकिन कार्यप्रवाह बाद में व्यास के साथ युग्मित करने के लिए detectable जन सीमा15,16 सटीक stoichiometry गणना प्रदान करने पर दोनों के अग्रदूत और कई टुकड़े आयन बहुतायत इकट्ठा ।

टुकड़ा आयनों से पीक क्षेत्रों है कि ब्याज की acylation साइट होते हैं, या ' अंतर टुकड़ा आयनों ', acylation साइट अधिभोग (चित्रा 2) यों तो इस्तेमाल कर रहे हैं । टुकड़ा आयनों कि संशोधन शामिल नहीं है समान प्रकाश और भारी m/z मान, और पेप्टाइड पहचान के लिए लेकिन ठहराव के लिए नहीं किया जाता है । क्षितिज सॉफ्टवेयर17 के अग्रदूत और टुकड़ा चोटी क्षेत्रों को निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक दिया acylation साइट युक्त एकाधिक टुकड़ा आयनों की उपस्थिति लचीलापन प्रदान करता है यदि टुकड़ा आयनों के कुछ में हस्तक्षेप का पता चला रहे हैं । क्षितिज में डेटा विज़ुअलाइज़ेशन प्रकाश से भारी टुकड़ा आयन अनुपात के महत्वपूर्ण निरीक्षण के लिए अनुमति देता है । मैनुअल डेटा विश्लेषण, एक मुक्त स्रोत आर में लिखा पैकेज के अलावा घर, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), विकसित किया गया था, जो अग्रदूत आयन और टुकड़ा आयन व्यास और quantifies के माध्यम से एकत्र डेटा का उपयोग करता है साइट विशेष acylation एकाधिक lysine अवशेषों से युक्त पेप्टाइड से stoichiometry, एक सुविधा के अग्रदूत आयन केवल तीव्रता माप4के साथ संभव नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल भी endoproteinase Glu-सी है, जो सी के लिए विशिष्ट है glutamic और एसपारटिक एसिड अवशेषों पर टर्मिनल दरार, बजाय trypsin या Arg-सी को छेड़ने का उपयोग कर के उपयोग को दर्शाता है, के रूप में बाद अक्सर बहुत बड़ी उत्पंन और संभावित गुणा acylated proteolytic acylated lysine अवशेषों पर अवरुद्ध trypsin दरार से उत्पंन पेप्टाइड्स । succinic एनहाइड्राइड (चित्र 1) के उपयोग को शामिल करने के लिए रासायनिक लेबलिंग प्रक्रिया को भी बढ़ाया गया था, जिससे succinylation stoichiometry succinylation के ठहराव को सक्षम किया जा सके । नमूना तैयार करने के लिए सुधार के अलावा, ऑफ़लाइन द्वारा पेप्टाइड भिन्नीकरण के कार्यांवयन, बुनियादी पीएच, उलट-चरण (bRP) पेप्टाइड्स की जुदाई आगे ठहराव हस्तक्षेप की कमी हुई, बेहतर de-कनवल्शनफ़िल्टर्स की अनुमति पूरे proteome नमूनों में acylation stoichiometry । एक साथ, इस विधि सुविधाओं और कई लाभ पर प्रकाश डाला गया: (1) रासायनिक acylation की क्षमता में वृद्धि; (२) acetylation के अतिरिक्त प्रोटीन succinylation stoichiometry का मापन; और (3) बेहतर ठहराव सटीकता । बेहतर ठहराव के कारण है व्यास से टुकड़ा आयन संकेतों में हस्तक्षेप की तुलना में डीडीए के प्रणेता संकेत है, साथ ही साथ बंद के कार्यांवयन लाइन पेप्टाइड पूर्व bRP द्वारा भिंन ।

Protocol

1. मात्रात्मक Acetylate और/या Succinylate प्रोटीन का उपयोग आइसोटोप-त्यसपछि एसिटिक वा Succinic एनहाइड्राइड

  1. तैयार 3 के 100 µ जी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के समांतर में प्रोटीन का नमूना है, 1 µ g/µ l (कुल 100 µ l) का उपयोग कर, यूरिया और triethylammonium बिकारबोनिट (TEAB) समाधान (8 एम यूरिया, 200 mM TEAB, पीएच 8) ।
    नोट: यह अमीन मुक्त बफर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में यहां प्रयुक्त प्रोटीन नमूने BSA, मात्रात्मक succinylated BSA हैं, और उसके मिश्रण 0%, 1%, 10%, 50%, और 100% पर परिभाषित succinylation अधिभोग के साथ BSA नमूने उपज, क्रमशः (प्रत्येक नमूना तैयार किया जाएगा 3 में प्रतिकृति) । इस प्रोटोकॉल भी ई कोलाई और माउस जिगर4से प्रोटीन lysates का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है । प्रोटोकॉल को अंय सेल या टिशू lysates पर भी लागू किया जा सकता है ।
  2. BSA नमूना के 100 µ एल कम (100 µ जी) 250 मिमी dithiothreitol के 8 µ एल के साथ (डीटीटी) 20 मिमी डीटीटी की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने और 1,400 rpm पर आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन ।
  3. Alkylate 200 मिमी iodoacetamide के २१.६ µ एल के साथ कम BSA नमूना 40 मिमी iodoacetamide की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूना मशीन.
    नोट: यह iodoacetamide एकाग्रता थोड़ा अधिक डीटीटी एकाग्रता के 2x से यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सभी कम प्रोटीन thiols alkylated हैं ।
  4. या तो एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 (step 1.4.1) या succinic एनहाइड्राइड-d4 (step 1.4.2) की तैयारी के साथ आगे बढ़ें रासायनिक (मात्रात्मक) acetylation या नमूनों के succinylation के लिए आवश्यक ।
    1. आणविक भार (१०८.१३ g/मोल) और घनत्व (१.१४३ g/mL से 25 ° c) में जलीय एसिटिक एनहाइड्राइड-डी6 के 1 g aliquot के molarity (M) का निर्धारण ।
      नोट: 1 g पैकेज में एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 में 875 µ l वॉल्यूम के ९,२४८ µmol हैं, नमूने के प्रति-acetylation के लिए प्रयुक्त १०.५७ M समाधान की उपज ।
    2. succinic एनहाइड्राइड-d4 का एक 5 मीटर समाधान तैयार करें निर्जल DMSO में पाउडर भंग करने से तुरंत पहले रिएजेंट के hydrolysis से बचने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए । भंग ०.२४ g को succinic एनहाइड्राइड-d4 में से 461 µ l का निर्जल DMSO के 5 M हल प्राप्त करने के लिए ।
  5. मात्रात्मक रासायनिक acetylation या succinylation के 60 µmol जोड़कर कार्य करें एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 (6 µ l के १०.५७ m समाधान) या succinic एनहाइड्राइड-d4 (5 एम समाधान के 12 µ l) क्रमशः, और मशीन एक भंवर मिक्सर पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना ।
    नोट: anhydrides की अम्लता के कारण, प्रोटीन हाला हो सकता है । कदम 1.6 में वर्णित के रूप में ध्यान दें और समायोजित करें ।
  6. के 10 µ l को 7.25 M NaOH के बाद इस मशीन के लिए पीएच बढ़ाने के लिए ~ 8 किसी भी ओ-acylation ओर उत्पादों को खत्म करने के लिए जोड़ें । भंवर संक्षेप में और पीएच कागज पर 1 µ एल खोलना द्वारा नमूना पीएच की जांच करें ।
    नोट: इसके लिए 7.25 मीटर NaOH के 10 से अधिक µ l को नं० 8 पर पहुंचने के लिए जोड़ना आवश्यक हो सकता है । इसके अलावा, संभावित उपजी प्रोटीन फिर से भंग करना चाहिए ।
  7. दोहराएं प्रति-acylation और पीएच समायोजन चरण 1.5 और 1.6 कुल तीन बार के लिए । पीएच मूल्यों की जांच करें और नोट मूल समाधान की मात्रा पुनरावृत्ति प्रति जोड़ा गया । ऊपर रासायनिक acylation चरणों के दौरान तेजी से काम क्योंकि anhydrides hydrolyze और जेट खो देंगे ।
  8. अंतिम लेबलिंग प्रतिक्रिया और पीएच समायोजन के बाद, O-acylation साइड प्रतिक्रियाओं को वापस लाने के लिए 50% hydroxylamine समाधान की 10 µ l जोड़ें ।

2. डाइजेस्ट Glu-सी Endoproteinase का उपयोग कर प्रोटीन नमूने प्रतिक्रिया व्यक्त की

  1. 50 मिमी TEAB, पीएच 8 का उपयोग कर 0.8 M करने के लिए यूरिया एकाग्रता पतला और नमूना मात्रा को सामान्य.
  2. endoproteinase Glu-सी को जोड़ने के द्वारा प्रोटीन के नमूनों को पचाने में एक 1:50 पर सब्सट्रेट प्रोटीन अनुपात करने के लिए (डब्ल्यू/डब्ल्यू) और पर रात के नमूनों की मशीन 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ 1400 rpm ।
  3. Acidify और मात्रा से 1% करने के लिए फार्म का अंल जोड़कर प्रोटीन पाचन नमूनों बुझाने ।
  4. हाइड्रोफिलिक-lipophilic संतुलन ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस का उपयोग कर नमूनों को नमक । का प्रयोग करें १ ३० प्रति नमूना मिलीग्राम sorbent कारतूस, अधिकतम 5 कारतूस प्रति मिलीग्राम सामग्री 4, 18 ।
    नोट: यह इस लवण प्रक्रिया भर में गीला कारतूस के अंदर sorbent रखने के लिए महत्वपूर्ण है । जब आवश्यक हो, निर्वात पंप बारी बंद करने के लिए नीचे विलायक या कारतूस के माध्यम से नमूने के पारित होने के लिए ।
    1. (ओं) में बंदरगाह 24 बंदरगाह ग्लास ब्लॉक वैक्यूम कई गुना और वैक्यूम पंप पर बारी पर कारतूस डालें । अप्रयुक्त पोर्ट (ओं) को छाया छोड़ दें । यदि आवश्यक हो तो वैक्यूम गेज पर कम दबाव बनाए रखने के लिए एक या दो बंदरगाहों संयुक्त राष्ट्र-छाया छोड़ दें ।
    2. प्रत्येक कारतूस के साथ दो बार गीला 800 µ एल के 80% acetonitrile (ACN)/0.2% फार्मिक एसिड/19.8% पानी । सुनिश्चित विलायक स्तर sorbent स्तर से ऊपर 2 – 3 मिमी रहता है । सुनिश्चित करें कि कई गुना पर वैक्यूम गेज 16.9-67.7 केपीए (पारा में 5-20) पढ़ता है ।
    3. प्रत्येक कारतूस Equilibrate पानी में 0.2% फार्मिक एसिड की 800 µ एल के साथ तीन बार । सुनिश्चित करें कि कई गुना पर वैक्यूम गेज 16.9-67.7 केपीए (पारा में 5-20) पढ़ता है ।
    4. कारतूस पर पेप्टाइड नमूने लोड । सुनिश्चित करें कि कई गुना पर वैक्यूम गेज 6.77 पढ़ता है-8.47 केपीए (2-पारा में 2.5), और प्रवाह की दर से अधिक नहीं है 1 मिलीलीटर/
    5. प्रत्येक कारतूस धो 800 µ l 0.2% पानी में फार्म का अंल के साथ तीन बार । सुनिश्चित करें कि कई गुना पर वैक्यूम गेज 16.9-67.7 केपीए (पारा में 5-20) पढ़ता है ।
    6. निर्वात कई गुना से कारतूस निकालें और एक 1.5 मिलीलीटर microtube में बसा ।
    7. 80% ACN/0.2% फार्मिक एसिड/19.8% पानी की 800 µ एल के साथ एक बार Elute पेप्टाइड्स और विलायक 2 के लिए sorbent के साथ-3 मिनट की मशीन के लिए अनुमति देते हैं ।
    8. कारतूस के अंदर sorbent परत के माध्यम से विलायक पुश करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें । 400 µ एल के दूसरे रेफरेंस के लिए दोहराएं l 80% ACN/एक ही 1.5 मिलीलीटर microtube में 0.2% फार्मिक एसिड/19.8% पानी ।
  5. वैक्यूम केंद्रापसारक द्वारा eluate सूखी (268 x gपर निश्चित केंद्रापसारक दर), आमतौर पर 3 एच के लिए ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, सूखे eluate नमूने-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए जमा किया जा सकता है जब तक अंश के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार ।

3. Fractionate पेप्टाइड्स ऑफ़लाइन मूल का उपयोग कर-पीएच चरण HPLC उलट

  1. प्रति-acylated और Glu-C डाइजेस्ट नमूनों को पुन: निलंबित (अनुभागों 1 और 2 में वर्णित के रूप में तैयार) के 200 µ l में बफर A (10 mM अमोनियम formation पानी में, पीएच 10), 4 डिग्री सेल्सियस पर एक भंवर मिक्सर पर 10 मिनट के लिए नमूना मिश्रण है, और 10 मिनट के लिए १७,५०० x g पर कमरे ते में केंद्रापसारक mperature ।
    नोट: परिणामी पेप्टाइड नमूना उच्च पीएच जुदाई19,20द्वारा fractionated ऑफ़लाइन होने के लिए तैयार है ।
  2. प्रोग्राम ऑफ़लाइन HPLC अंश विधि साधन और सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है । निम्नलिखित विधि एक दोहरी तरंग दैर्ध्य यूवी डिटेक्टर, एक नमूना, एक अंश कलेक्टर, और एक C18 कॉलम (4.6 मिमी x 250 मिमी, 5 µm कण आकार) है कि पीएच 10 बर्दाश्त सहित एक द्विआधारी HPLC पंप प्रणाली के लिए विशिष्ट है ।
  3. प्रति अंश 2.1 मिनट के लिए प्रत्येक 40 भागों लीजिए और हर चौथे अंश, चार अंतिम परित भागों4में जिसके परिणामस्वरूप गठबंधन । pooled अंशों की एक बड़ी संख्या को आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा संग्रह समय की कीमत पर नमूना जटिलता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. एक lyophilizer में परित भागों सूखी, 1 मिलीलीटर में 50% ACN और 1% पानी में अंलीय एसिड, और एक छोटे नमूना कंटेनर के हस्तांतरण के लिए सूख पेप्टाइड नमूने फिर से स्थगित । वैक्यूम केंद्रापसारक के माध्यम से स्थानांतरित नमूना सूखी (268 x gपर निश्चित केंद्रापसारक दर), आम तौर पर 1 के लिए एच ।
    नोट: अमोनियम formation के कम वाष्प दबाव पूरा सुखाने मुश्किल बना सकते हैं । यदि अमोनियम formation नमक के महत्वपूर्ण मात्रा में नमक सूखने के बाद हाला, ठोस चरण निष्कर्षण दोहराने के रूप में रहते हैं ।
  5. फिर से 20 µ एल में नमूनों को निलंबित 0.2% के साथ पानी में फार्मिक एसिड अनुक्रमित प्रतिधारण समय (iRT) पेप्टाइड मानक मिश्रण.
    नोट: नमूने अब जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।

4. Fractionated पेप्टाइड नमूनों का व्यास विश्लेषण

  1. एक दीया LC-ms/एमएस विधि का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण, जो जन spectrometric उपलब्ध उपकरणों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । विश्लेषण एक नैनो-LC 2d HPLC प्रणाली ऑनलाइन एक ओर्थोगोनल quadrupole समय की उड़ान (QqTOF) मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े का उपयोग किया गया था ।
    1. कार्यक्रम साधन सॉफ्टवेयर इतना है कि पेप्टाइड मिश्रण एक C18 पूर्व स्तंभ चिप पर स्थानांतरित कर रहे हैं (200 µm एक्स 6 मिमी C18-सीएल चिप, 3 µm, 300 Å) और 2 µ एल/मिनट पर धोने के लिए लोड हो रहा है विलायक (एच2O/0.1% फार्मिक एसिड) के साथ 10 मिनट के लिए नमक ।
    2. एक 75 µm x 15 सेमी C18 पर पेप्टाइड्स chromatographically-सीएल चिप (3 µm, 300 Å) एक 2 के साथ 300 nL/मिनट के प्रवाह की दर पर एक ठेठ (और नियंत्रण रेखा प्रणाली विशिष्ट) जलीय और ACN विलायक बफ़र्स का उपयोग कर4buffers ।
    3. एक चर विंडो दीया विधि, जहां चर चौड़ाई (5 से 90 m/z) की मास रेंज विंडोज़ से पारित कर रहे है Q1 quadrupole में टक्कर सेल में पूर्ण मास रेंज पर वृद्धिशील चरणों में (m/जेड 400-1250) ।
      नोट: 3.2 s के चक्र के समय एक 250 एमएस पूर्ववर्ती आयन स्कैन 64 ःवाथ खंडों21,22में से प्रत्येक के लिए 45 एमएस संचय समय के बाद भी शामिल है ।
  2. डीडीए द्वारा नमूनों के समानांतर विश्लेषण का उपयोग करके पेप्टाइड की पहचान करें एमएस और वर्णक्रमीय पुस्तकालयों के निर्माण, या वैकल्पिक रूप से, पेप्टाइड्स PIQED सॉफ्टवेयर23का उपयोग कर दीया डेटा से सीधे पहचाना जा सकता है, जो डेटा प्रोसेसिंग के सभी तकनीकी कदम संभालती है, पहचान, और बाद में ठहराव के लिए क्षितिज में आयात करते हैं ।

5. उदाहरण डेटा विश्लेषण ट्यूटोरियल

  1. क्षितिज सॉफ्टवेयर (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) डाउनलोड करें और एक PanoramaWeb खाता (https://panoramaweb.org) बनाएं ।
    नोट: डेटा के साथ क्षितिज के उपयोग का वर्णन विस्तृत ट्यूटोरियल के लिए, कृपया (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials) देखें । अंय सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए प्रकाश और भारी अंश आयन, ऐसे खुला ःवाथ24, ःवाथ 2.0 PeakView में प्लगइन के रूप में व्यास अधिग्रहण से चोटी के क्षेत्रों में25, और Spectronaut26।
    1. succinylated BSA प्रतिनिधि परिणाम के लिए क्षितिज डेटा फ़ाइल डाउनलोड करें (चित्र 3) पैनोरमा सार्वजनिक: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url से । पैनोरमा वेबपेज पर, "लक्षित एमएस रन" तालिका के लिए जाना है, और सही पक्ष पर डाउनलोड लिंक का चयन स्काई. zip फ़ाइल डाउनलोड करें । डाउनलोड. zip फ़ोल्डर निकालें और क्षितिज में इसे खोलने के लिए क्षितिज. स्काई फ़ाइल पर डबल क्लिक करें । पेप्टाइड टुकड़ा आयन लक्ष्य पेड़ (बाएँ पैनल) और प्रकाश succinylation (सही पैनलों) के परिभाषित प्रतिशत से चार chromatograms की जाँच करें.
    2. "दृश्य" मेनू का चयन करें, नेविगेट "पीक क्षेत्रों । तुलना दोहराने "। "पीक क्षेत्रों-तुलना दोहराने" पट्टी रेखांकन युक्त पैनल खिड़की के दाईं ओर दिखाई देगा । पीक क्षेत्रों पैनल में, राइट क्लिक करें और चुनें "संक्रमण । एकल ", जो टुकड़ा आयन चयनित टुकड़ा आयन के लिए पीक क्षेत्र से पता चलता है । अंत में, राइट क्लिक करें "पीक क्षेत्रों" पैनल और चुनें "आदेश । दस्तावेज़ "।
    3. विंडो के बाईं ओर लक्ष्य ट्री पैनल में, पर राइट-क्लिक करें पेप्टाइड "E. LCKVASLRE. T | को अनुपात । Oneheavy ", जो भारी आयन संकेत पर प्रकाश आयन संकेत के अनुपात की गणना करता है, प्रकाश/
      नोट: यह साइट अधिभोग प्रकाश के stoichiometry अनुपात के रूप में ही नहीं है/
    4. ध्यान दें कि लक्ष्य ट्री अब अनुपात एल/एच प्रकाश टुकड़ा आयनों के अधिकार के लिए रिपोर्ट ।
  2. "भिंनता टुकड़ा आयनों" है कि ब्याज की acylation साइट शामिल निर्धारित करें ।
    नोट: के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, इस सटीक उदाहरण की विशेषता, अंतर आयनों y के रूप में निर्धारित किया गया था7 (सर्वोच्च स्थान पर), y8, बी3, और बी4. ध्यान दें कि गैर-अंतर अंश आयनों लक्ष्य ट्री में 1 का अनुपात दिखाएँ ।
    1. बाएँ पैनल लक्ष्य पेड़ में, 588.30 के तहत + + पेप्टाइड ई. LCKVASLRE के उप नोड. टी, y7 अंतर टुकड़ा आयन पर क्लिक करें
      K [y7 ] – 902.49 + (rank1) [5]
      बढ़ती पीक ऊंचाई और क्षेत्र की सूचना ।
    2. बाएँ पैनल लक्ष्य पेड़ में, 588.30 के तहत + + पेप्टाइड ई. LCKVASLRE के उप नोड. टी, y पर क्लिक करें5 गैर अंतर टुकड़ा आयन एक [y5 ] – 575.31 + (रैंक 6) [1]. निरीक्षण करें कि y5 टुकड़ा आयन chromatograms और पीक क्षेत्रों सभी नमूनों के लिए एक ही श्रेणी में रहते हैं ।
    3. लक्ष्य ट्री पैनल में, अन्य अंतर के माध्यम से ब्राउज़ (1 के अलावा अन्य अनुपात) और गैर अंतर (1 के अनुपात) टुकड़ा आयनों और पीक क्षेत्र बार ग्राफ और chromatograms में परिवर्तन और पैटर्न नोटिस.
    4. stoichiometry की गणना करने के क्रम में अंतर आयनों के प्रकाश और भारी जोड़े के लिए सटीक पीक क्षेत्रों का निर्धारण (अतिरिक्त विवरण के लिए भी मेयेर एट अल देखें. 4). पर क्लिक करें "देखें | दस्तावेज़ ग्रिड "और दस्तावेज़ ग्रिड पॉप अप होगा । दस्तावेज़ ग्रिड की ऊपरी बाईं ओर, "दृश्य | संक्रमण परिणाम "अंश आयन जानकारी, जैसे पेप्टाइड अनुक्रम, प्रणेता mz, दोहराने का नाम, के साथ एक बहु-स्तंभ तालिका देखने के लिए आदि ।
    5. दस्तावेज़ ग्रिड में "दृश्य" पर क्लिक करके और अनुकूलित दृश्य विंडो खोलने के लिए "दृश्य संपादित करें" का चयन करके रिपोर्ट स्वरूप को "पिवट" से फिर से परिवर्तित करें । "दृश्य अनुकूलित करें" विंडो के नीचे बाईं ओर, "पिवट प्रतिकृति नाम" की जाँच करें और अनुकूलित दृश्य विंडो को बंद करने के लिए "ठीक" चुनें । कि अब निरीक्षण "दस्तावेज़ ग्रिड: संक्रमण परिणाम" तालिका विंडो फिर से दोहराने का नाम, अवधारण समय, क्षेत्र, पृष्ठभूमि, पीक रैंक स्तंभों (1%, 10%, 50%, 100% succinylation) को दोहराने के समूह के लिए व्यवस्था की है ।
    6. के लिए पेप्टाइड "ई. LCKVASLRE. T "में" दस्तावेज़ ग्रिड: संक्रमण परिणाम "तालिका, ढूँढें" प्रणेता Mz "स्तंभ," टुकड़ा आयन "स्तंभ, और 1pct_light_sw1 क्षेत्र (1% succinylation) स्तंभ. निरीक्षण है कि इस पेप्टाइड के लिए दो अग्रदूत आयनों हैं, प्रकाश (५८८.३० के पहले 8 पंक्तियों में प्रणेता Mz), और भारी (पिछले 8 पंक्तियों में ५९०.३२ के प्रणेता Mz) ।
    7. "टुकड़ा आयन" कॉलम में, और8 टुकड़ा प्रकाश और भारी अग्रदूत आयनों के अनुरूप आयन के लिए दो पंक्तियों को खोजने के लिए । 1pct_light_sw1 क्षेत्र स्तंभ में समान पंक्तियों से, प्रकाश (१५,८२०), और हेवी (१,४२६,४६१) के लिए और8 क्षेत्रों को रिकॉर्ड करें ।
  3. इन पीक क्षेत्र मानों का उपयोग करना, succinylation stoichiometry की गणना करना, या संशोधित अनुपात, नीचे दिए गए सूत्र के अनुसार और 0.01, या 1% succinylation का stoichiometry अनुपात प्राप्त करना, जो इस परिभाषित में प्रकाश succinylation के अनुपात से मेल खाता है मिश्रण:
    Equation
  4. 10pct_light_sw1 क्षेत्र स्तंभ, १४४,९५३ (प्रकाश) और १,१८८,०४१ (भारी), 0.10, या 10% succinylation का अनुपात प्राप्त करने के लिए से और8 अंतर अंश आयन पीक क्षेत्र मानों का उपयोग कर 10% succinylation के लिए stoichiometry अनुपात की गणना ।
  5. 100pct_light_sw1 क्षेत्र स्तंभ, ९५४,५१३ (light) और १६,४०७ (भारी), ०.९८, या 98% succinylation का अनुपात प्राप्त करने के लिए से और8 अंतर अंश आयन पीक क्षेत्र मानों का उपयोग करते हुए 100% succinylation के लिए stoichiometry अनुपात की गणना करें ।
  6. इसी प्रकार, 1% succinylation के लिए stoichiometry अनुपात b3 विभेदन अंश आयन 1pct_light_sw1 क्षेत्र स्तंभ, ५५,६९७ (प्रकाश) और ३,१४९,११९ (भारी), 0.01, या 1% succinylation का अनुपात प्राप्त करने के लिए पीक क्षेत्र मूल्यों का उपयोग कर की गणना ।
  7. सभी अंतर टुकड़ा आयनों, दोनों y और बी आयनों के लिए फार्मूला का उपयोग कर stoichiometry अनुपात गणना जारी रखें, 1, 10, 50, और 100% succinylation मिश्रण के लिए lysine succinylation stoichiometry मूल्यों को प्राप्त करने के लिए ।

Representative Results

डेटा अधिग्रहण के बाद, MS2 टुकड़ा आयनों अंतर proteolytic acylated पेप्टाइड्स से निर्धारित किया गया था, बाद में निकाले आयन chromatograms (XIC) क्षितिज में संसाधित किया गया, और इसी प्रकाश और भारी पीक क्षेत्रों जो थे निर्यात किया गया अंत में साइट अधिभोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया । चित्रा 2a कैसे अग्रदूत आयन XIC दोनों प्रकाश और भारी पेप्टाइड संकेतों की विशेषता प्रकट हो सकता है की एक वैचारिक चित्रण से पता चलता है, और चित्रा बी सी रंग कोडिंग के साथ इसी टुकड़ा आयन XICs का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है (लाल = प्रकाश; नीला = भारी ) lysine acylation संशोधनों युक्त टुकड़ा आयनों अंतर के लिए ।

चित्रा 3 एक अधिभोग प्रयोग से उत्पंन डेटा से पता चलता है, जैसे प्रकाश/भारी succinylated BSA के पूर्व निर्धारित अनुपात का विश्लेषण ऊपर वर्णित के रूप में-घर में 1, 10, 50, या 100% पर उत्पंन, और succinylation अधिभोग का निर्धारण । क्षितिज में दीया अधिभोग डेटा आयात लक्ष्य पेड़ की आसान दृश्य सक्षम बनाता है, पेप्टाइड दृश्यों को प्रदर्शित करने, और दोनों प्रकाश और भारी अग्रदूत आयनों (चित्रा 3) के लिए टुकड़ा आयनों. प्रत्येक परिभाषित succinylated BSA अनुपात के दीया-MS से डेटा प्रकाश से भारी y7 आयन के अनुपात में सापेक्ष मतभेद immanently से पता चला, सबसे अधिक पहचान पेप्टाइड-स्पेक्ट्रा मैच से अंतर-अंश आयन (लाल रंग में संकेत दिया, चित्र बी) । चित्रा 4 MS2 अधिभोग गणना है कि इनपुट प्रोटीन के succinylation प्रतिशत अधिभोग की पुष्टि से संसाधित परिणामों के एक सिंहावलोकन दिखाता है, यहां पूर्व succinylated BSA से मिलकर । 20 proteolytic succinylated पेप्टाइड्स वाणिज्यिक पूर्व succinylated BSA से प्राप्त करने के लिए मापा lysine succinylation अधिभोग, निर्धारित प्रतिशत पर succinylated (उदा., 0, 1, 10, 50, और 100%) में तालिका 2में दिखाया गया है । 20 proteolytic BSA पेप्टाइड्स में से प्रत्येक के लिए, उच्चतम क्रमित, MS2 टुकड़ा आयन अंतर lysine succinylation (Ksucc) अधिभोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में एल/(एल + एच)% में. कुल मिलाकर, MS2 आधारित ठहराव कम stoichiometries पर भी acylation अधिभोग के निर्धारण में बहुत अच्छा सटीकता दिखाया ।

Figure 1
चित्र 1: Stoichiometry कार्यप्रवाह. (क) प्रोटीन तीन बार एसिटिक एनहाइड्राइड-डी6 के साथ acetylate को संशोधित lysine अवशेषों की मशीन हैं । अगला, acetylated प्रोटीन endoproteinase Glu-सी के साथ पचा रहे हैं, proteolytic पेप्टाइड्स के HPLC अंश के बाद बुनियादी-पीएच उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर । अंत में, पेप्टाइड्स द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं LC-MS चर प्रणेता खिड़की की चौड़ाई के साथ दीया का उपयोग कर. (B) समान कार्यप्रवाह का उपयोग (A) में बताए गए अनुसार succinylation stoichiometry को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, सिवाय हेवी acylation रिएजेंट को succinic एनहाइड्राइड-d4में बदल दिया जाता है । चित्रा मेयेर एट अलसे अनुकूलित । 4 (जे. के. समाज. जन Spectrom., खुला विकल्प) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: संभावित डेटा के उदाहरण प्राप्त किए गए और stoichiometry परिकलन. (A) प्रकाश (L) और भारी (H) MS1 अग्रदूत आयनों वाले एक acetylated lysine 3 जन इकाइयों द्वारा अलग. XICs दोनों प्रकाश और भारी isotopic लिफाफे क्रमशः लाल और नीले रंग में संकेत के लिए उत्पंन कर रहे हैं । (ख) व्यास अधिग्रहण से MS2 टुकड़ा आयन XICs से ठहराव ' अंतर ' प्रकाश और भारी टुकड़ा आयनों है कि acetylation लाल और नीले रंग में संकेत साइट होते है का उपयोग किया जा सकता है । आम टुकड़ा आयनों बिंदीदार काले में प्रदर्शित कर रहे हैं और संशोधन की साइट शामिल नहीं है । चित्रा मेयेर एट अलसे अनुकूलित । 4 (जे. के. समाज. जन Spectrom., खुला विकल्प) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अलग अधिभोग के स्तर पर succinylated proteolytic BSA पेप्टाइड के क्षितिज दृश्य. (A) क्षितिज लक्ष्य पेड़ proteolytic पेप्टाइड LCKsuccVASLRE और उसके परिणामस्वरूप टुकड़ा आयनों दिखा । (ख) क्षितिज succinylation अधिभोग के स्तर पर अलग से टुकड़ा आयन chromatograms निकाले । उच्चतम क्रमित आयन, y7, पीक क्षेत्र में बढ़ जाती है 1, 10, 50, और 100% correlating पूर्व के इनपुट प्रतिशत को succinylated BSA (में उत्पंन घर) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्री-succinylated BSA के BSA acylation stoichiometry का आकलन. पांच भारी संशोधन के निर्धारित प्रतिशत पर अलग BSA नमूने (उदा, 0, 1, 10, 50, और 100%) MS2 अधिभोग निर्धारण के अधीन थे । 20 succinylated BSA पेप्टाइड्स के लिए साइट अधिभोग उच्चतम स्थान प्रकाश संशोधन के परिभाषित प्रतिशत पर पांच अलग BSA नमूनों के लिए टुकड़ा आयनों अंतर से निर्धारित किया गया (उदा, 0, 1, 10, 50, और 100%) । बॉक्स मूंछ भूखंड 20 succinyl पेप्टाइड्स का वितरण प्रदर्शित करता है, 50% पेप्टाइड्स से मान ' बॉक्स ' (75% शतमक के लिए 25% शतमक) में हैं, ऊपरी मूंछ 75% शतमक से अधिकतम (100%), और निचली मूंछ इंगित करता है मानों को इंगित करता है से मान 25% शतमक न्यूनतम करने के लिए (0% शतमक) । (जे. एएम. समाज. जन Spectrom., खुला विकल्प) । माप का ठहराव तालिका 2में पाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समय (मिनट) % क % B
0.00 100 0
७.२७ 92 8
४५.२७ 73 27
४९.२७ 69 31
६५.२७ 61 39
७२.२७ 40 60
८०.०० 10 90
८५.०० 10 90
८६.०० 100 0
१२०.०० 100 0
प्रवाह दर: 0.7 मिलीलीटर/
एक बफर: 10 मिमी अमोनियम पानी में formate, 10 पीएच
बफ़र B: 10 mM अमोनियम formation में 90% ACN और 10% पानी, पीएच 10
नोट: दोनों मोबाइल स्वच्छ अमोनिया के साथ 10 को समायोजित चरणों का पीएच

तालिका 1: ऑफ़लाइन basic-pH के लिए ग्रैडिएंट औंधा-चरण HPLC भिन्नीकरण. ढाल लंबाई: 120 min. Buffer A: 10 मिमी अमोनियम पानी में स्वरूपित, 10 पीएच । बफ़र B: 10 mM अमोनियम formation में 90% ACN और 10% पानी, पीएच 10 ।

l/l + H% म l/l + H% म l/l + H% म l/l + H% म l/l + H% म
Ksucc 0% Ksucc 1% Ksucc १० टक्के Ksucc ५० टक्के Ksucc 100%
0.2 1.7 11.1 ५०.९ ९९.२
1.2 2.3 12.3 ४९.४ ९७.६
2.9 3.8 14 ४८.६ 99.5
0.5 1.8 11.7 ५०.८ 99.5
0.2 1.7 11.1 ४८.३ ९८.२
0.2 1.2 11 ४७.५ ९६.१
0.3 1.6 12.8 51 ९९.२
3.7 5.2 14.7 ५१.९ ८९.५
१.५ 1.8 12.5 ४७.२ ९१.१
0.8 १.५ 11.3 ४८.४ ९६.८
0.2 1.6 १३.९ ४९.७ ९८.९
0.1 1.1 10.7 ४८.२ ९८.६
0.2 0.9 10.3 ४९.४ ९९.४
0.5 2.5 17.2 ५२.३ ९७.५
0.1 3.5 २०.८ 51 ९९
0.3 1.9 10.7 ४९.६ ९८.२
2 1.7 10.9 ४७.७ ९६.३
0.3 1.2 10 53 ९८
1.1 1.8 12.9 ५७.९ ९४.१
0.2 1.4 11.6 ४८.६ ९८.८

तालिका 2: ठहराव की मापी BSA lysine succinylation अधिभोग के लिए 20 proteolytic succinylated पेप्टाइड्स. Succinylated से प्राप्त पेप्टाइड्स वाणिज्यिक पूर्व Succinylated BSA, निर्धारित प्रतिशत पर Succinylated (उदा, 0, 1, 10, 50, और 100%) । 20 proteolytic BSA पेप्टाइड्स में से प्रत्येक के लिए, उच्चतम क्रमित, MS2 टुकड़ा आयन अंतर lysine succinylation (Ksucc) अधिभोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में एल/(एल + एच)% में.

Discussion

इस प्रोटोकॉल एक उपंयास और सटीक विधि के लिए साइट-विशिष्ट lysine acetylation और succinylation अधिभोग है कि एक पूरे proteome के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान करता है । इस विधि अंतर्जात प्रकाश पेप्टाइड्स और exogenous भारी पेप्टाइड्स की माप पर निर्भर करता है, जो बाद के इन विट्रो में उत्पन्न कर रहे हैं मात्रात्मक रासायनिक acylation के साथ प्रोटीन का उपयोग deuterated एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 या succinic एनहाइड्राइड-d4 (चित्र 1) । इसी तरह के तरीके स्थिर isotopic लेबलिंग का इस्तेमाल किया है देशी unlysine अवशेषों और प्रदर्शन साइट अधिभोग के आधार पर ठहराव या तो अग्रदूत आयन केवल12 या टुकड़ा आयनों से डीडीए अधिग्रहण13,14. इस प्रोटोकॉल acylation दक्षता में सुधार करने के लिए नमूना तैयारी के दौरान कई चरणों पर लागू होता है और succinylation करने के लिए रासायनिक लेबल का विस्तार । डेटा संग्रह का उपयोग कर दीया अधिग्रहणों दोनों के प्रणेता आयन और MS2 टुकड़ा आयन तीव्रता पूरे पता लगाने वाला जन सीमा से अधिक, इस प्रकार टुकड़ा आयन हस्तक्षेप को कम करने प्राप्त करता है । विश्लेषण और ठहराव के माध्यम से क्षितिज और कस्टम लिपियों में विकसित घर साइट अधिभोग गणना एक से अधिक lysine अवशेषों और एक साइट पर एक से अधिक acylation युक्त पेप्टाइड्स के लिए अनुमति देते हैं ।

इस प्रोटोकॉल है कि बारीकी से पालन किया जाना चाहिए के नमूना तैयारी चरण के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । के बाद से पूरे प्रोटोकॉल सभी lysine अवशेषों के कुशल रासायनिक संशोधन पर निर्भर करता है, यह कदम अत्यंत महत्व का है । Anhydrides मुक्त अमीन के साथ प्रतिक्रिया, तो अमीन-बफर युक्त या प्रोटीन lysate में contaminant अणुओं से बचा जाना चाहिए. इसके अलावा रासायनिक प्रति acylation कदम के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया मिश्रण के पीएच वापस पीएच 8 के लिए इस मिश्रण acidifies प्रतिक्रिया के रूप में एनहाइड्राइड रिएजेंट के साथ तीन मशीन के प्रत्येक के बाद समायोजित है, और ओ-acylation पक्ष प्रतिक्रियाओं फार्म का हो सकता है । इसके अलावा, 8 मीटर यूरिया युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के आसपास के लिए लगभग 0.8 मीटर यूरिया पाचन से पहले और जांच है कि पीएच इष्टतम रेंज के भीतर है endoproteinase Glu की इष्टतम गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है-सी । हमारे प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण घटक डेटा संग्रह कदम और एक दीया कार्यप्रवाह है, जो किसी भी डीडीए डेटा नमूने विसंगतियों पर काबू पाता है और जो MS2 टुकड़ा आयन स्तर पर ठहराव के लिए अनुमति देता है की शुरूआत है । व्यास पद्धति का एक मुख्य लाभ हस्तक्षेप की कमी है जो आम तौर पर कर रहे है और अधिक प्रवण और समस्याग्रस्त जब MS1 अग्रदूत आयन संकेत बढ़ाता है (पिछले प्रकाशनों में से कुछ के रूप में सुझाव दिया है) ।

अत्यधिक जटिल नमूनों की तैयारी करते समय कार्यप्रवाह में कई संशोधन किए जा सकते हैं. आंशिक रूप से ऑफ़लाइन मूल-पीएच उलट-चरण HPLC भिन्नीकरण के बाद परित किए गए अंशों की संख्या कम करने के लिए pooled नमूनों कि नियंत्रण रेखा से प्राप्त किया जाएगा की जटिलता/MS. इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक क्रोमेटोग्राफिक ग्रैडिएंट भी उपयोग किया जा सकता है अधिग्रहण बेहतर पेप्टाइड जुदाई के लिए अनुमति देने के लिए । वैकल्पिक रूप से, एकाधिक टीज़र के लिए नमूनों को पचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक बड़ी विविधता के लिए सट पेप्टाइड और प्रोटीन lysine अवशेषों की कवरेज में वृद्धि । परीक्षण चलाता है और अनुकूलन वाणिज्यिक acetylation या succinylation के विशिष्ट प्रतिशत युक्त BSA का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा के संभावित मामूली साइट अधिभोग इस तरह के मिथाइल या ubiquitination के रूप में बेहिसाब अंय lysine संशोधनों, के कारण अधिक है, आदि, एक ही साइट पर4। प्रकाश और भारी acyl संशोधनों के शिखर क्षेत्रों से गणना, एल/(एल + एच), साइट अधिभोग धारणा है कि एक lysine साइट पर संशोधन के कुल स्तर पर ही अंतर्जात ' प्रकाश ' acylation (एल) और रासायनिक लेबल के होते है पर आधारित है ' भारी ' acylation (ज). हालांकि, वास्तविक कुल acylation अधिभोग vivo में एक साइट पर acetylation और/या succinylation से परे अन्य संशोधनों शामिल हो सकते हैं । साथ ही, खरीदे गए रिएजेंट की सूचना isotopic शुद्धता एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 (99%) और succinic एनहाइड्राइड-d4 (> 98%) 2% तक (succinyl) या 1% (एसिटाइल) के एक छोटे से अधिक अनुमान लगाने के लिए योगदान कर सकते है अंतर्जात acylation तर४. एक साथ, इन मामूली अनुमान से कम 1% अधिभोग के साथ साइटों को बढ़ाता में कठिनाई के लिए जोड़ें । पूर्ण रासायनिक acylated पेप्टाइड्स और देशी acylated पेप्टाइड्स के बीच बड़े बहुतायत अंतर भी संभावित साइट अधिभोग ठहराव त्रुटियों के लिए योगदान, विशेष रूप से कम अंतर्जात acylated पेप्टाइड्स के लिए27. Weinert एट अलद्वारा हाल ही में एक अध्ययन । 27 पाया कि पूर्ण प्रति-acetylated पेप्टाइड्स के बीच कम बहुतायत अंतर ठहराव त्रुटि27को कम कर सकते हैं ।

Stoichiometry quantifications इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर इकट्ठे हुए एक विशेष प्रोटीन और जैविक अनुवर्ती प्रयोगों के लिए फार्म का परिकल्पना में महत्वपूर्ण acylation के आकर्षण के उपसाधन, इस तरह साइट के रूप में तुच्छ कर सकते है ब्याज की कुछ साइटों के निर्देश mutagenesis । यह प्रोटोकॉल भी कम acylation stoichiometry साइटों के संयुक्त प्रभाव है कि प्रोटीन संरचनात्मक स्थिरता और स्थानीयकृत सेलुलर वातावरण पर अप्रत्यक्ष या सूक्ष्म प्रभाव डालती सकता प्रकट सकता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के लिए acetylation और succinylation और अंय संभव lysine acylation संशोधनों को मापने के लिए acetylation से परे विशिष्ट के तहत प्रोटीन पर गतिशील acylation प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा अलग जैविक स्थितियों ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के NIH राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था NIH-NIDDK ग्रांट R24 DK085610 (पीआई: ई. Verdin) । JGM एक NIH T32 फैलोशिप (T32 AG000266, PI: जे Campisi) द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक बक संस्थान (1S10 OD016281, PI: बीवीएससी गिब्सन) में TripleTOF 6600 प्रणाली के लिए NIH साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aqueous acetic anhydride-d6 Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 175641-1G 1% isotopic purity
succinic anhydride-d4 Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 293741 2% isotopic purity
sequencing grade endoproteinase Glu-C Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) 10791156001 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt)
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges Waters Corp., Milford, MA, USA WAT 094225
HPLC acetonitrile Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA BJAH015-4
HPLC grade water Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA BJAH365-4
iodoacetamide Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA I1149-25G
dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA D9779-5G
FLUKA formic acid (FA) for mass spec Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA C988C27 ~98%
urea Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA PI29700
bovine serum albumin (BSA) Pierce, Rockford, IL, USA 88341
triethylammonium bicarbonate (TEAB) Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA T7408-100ML
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA 43998
sodium hydroxide (NaOH) EMDMillipore, Burlington, MA, USA SX0590
50% hydroxylamine solution in water Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 438227-50ML
LC-MS grade water Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA BJLC365-4
LC-MS acetonitrile Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact Eppendorf AG, Hamburg, Germany T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA SPD131DDA-115
Waters 1525 binary HPLC pump system Waters Corp., Milford, MA, USA WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector Waters Corp., Milford, MA, USA WAT081110
Waters 717plus Autosampler Waters Corp., Milford, MA, USA WAT022939
Waters Fraction Collector III Waters Corp., Milford, MA, USA 186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18 column Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA 770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer Labconco, Kansas City MO, USA 7751000
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA model# 845
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer Sciex LLC, Framingham, MA, USA per quote
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer Sciex LLC, Framingham, MA, USA per quote
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) Sciex LLC, Framingham, MA, USA 804-00006
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 Sciex LLC, Framingham, MA, USA software download Sciex
Spectronaut Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland Sw-3001
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) Sciex LLC, Framingham, MA, USA 804-00001

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जीव विज्ञान अंक 134 Stoichiometry acetylation succinylation आंकडा-स्वतंत्र अर्जन मास स्पेक्ट्रोमेट्री क्षितिज
ठहराव of Site-विशिष्ट प्रोटीन Lysine Acetylation और Succinylation Stoichiometry का उपयोग डाटा-स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री
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Wei, L., Meyer, J. G., Schilling, B. … More

Wei, L., Meyer, J. G., Schilling, B. Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (134), e57209, doi:10.3791/57209 (2018).

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