Summary
여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.
Abstract
NƐ-acylation에 의해 단백질 리 진 잔류물의 포스트 번역 상 수정 (PTM) 수 동적으로 정돈해 단백질 기능, 예를 들어 효소 활동을 변경 하 여 또는 상호 작용을 중재 하 여 구조적인 변화를 유도 합니다. 사이트별 단백질 acylation 인, 또는 산출할, 정확한 정량화 글로벌 수준의 산출할와 특정 신의 개별 고급 acylation 산출할의 기능적인 결과 이해 하기 위한 필수적 이다 잔류물입니다. 다른 그룹 내 생, 자연의 풍요로 움 acylation에서 펩 티 드 선구자 동위 원소의 비율을 비교 하 여 lysine acetylation 산출할의 측정 보고와 외 인, 무거운 동위 원소 표시 acylation 도입 후 양적 안정 동위 원소 분류 아세트산 무수 물을 사용 하 여 단백질의 화학 acetylation. 이 프로토콜 최적화 방법 등 여러 가지 개선 기능을 설명 합니다: (1) 화학 acylation 효율성, (2) acetylation, 뿐만 아니라 단백질 succinylation를 측정 하는 능력 증가 하 고 (3)로 인해 양적 정확도 향상 데이터 의존 인수 (DDA) 선구자 이온 신호 대신 데이터 독립적인 인수 (디 아)에서 조각 이온 정량화를 사용 하 여 감소 된 방해. 정량화에 대 한 조각 이온에서 추출 된 피크 넓이의 사용은 또한 고유 사이트 수준 acylation 산출할 불가능 선구자 이온을 사용 하 여 하나 이상의 lysine 잔류물을 포함 하는 분해 펩 티 드에서의 수 있습니다. 정량화에 대 한 신호입니다. 편리한 데이터 검사 및 검토에 대 한 스카이 라인, 오픈 소스 양이 많은 proteomics 환경 데이터 시각화 수 있습니다. 함께,이 워크플로 계시 하 고 생물학으로 관련 acylation 사이트 순위 수는 전체 프로테옴의 사이트별 lysine acetylation 및 succinylation 점령의, 정확, 공평 하 고 정확한 정량화를 제공 합니다.
Introduction
NƐ-acylation 단백질 리 진 잔류물의 단백질 기능의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. Lysine acetylation 및 다른 acylations, succinylation, malonylation, glutarylation, 등 대사, 세포 신호, 및 다른 세포질 과정1,2,3,4 생각 된다 , 신진 대사 장애5에 있는 의미. Lysine acyl 수정 포유류 조직에서 서로 다른 조건 하에서 큰 배-변화를 받아야 하 고 셀 라인5,6,,78 수많은 연구 발견 뿐만 아니라 그러나 박테리아9,,1011,, 이러한 상대 배 변경 제공 하지 않습니다 수정 총 단백질의 비율에 대 한 통찰력. 연구 보고 acylation 사이트 점령의 측정 부족12,,1314, 관련성에도 불구 하 고 상대 배 보다 더 자세한 정보를 제공 하는 그들은 이러한 연구에 필요한 변경 합니다. 예를 들어 사진 변경 0.1%, 1 ~ 10%, 또는 심지어 10 ~ 100 %0.01에서 사이트 인 증가 대표할 수 있었다. 정확 하 게 산출할 측정은 필요한 acylation의 생물학적 의미를 해석 하 고 구조, 단백질의 크기에 대 한 영향 예측 가능성, 기능 변경.
뒤에 비해 외 인, 내 인 성 "빛" acetylation 사이의 비율을 측정 하는 질량 분석에 의해 수정 되지 않은 리 진 잔류물의 무거운는 안정 동위 원소 화학 라벨 사이트 인 척도를 한 이전 방법 활용 화학적으로 표시 된 "무거운" 틸 리 선구자 이온 농도12를 사용 하 여. 저 우 외다른 최근 연구. 13 lysine acetylation 산출할 또한 안정 동위 원소, 단백질에서 모든 수정 되지 않은 리 진 잔류물의 완전 한 화학 acetylation 고용 하지만 조각 이온 농도 의해 측정 된 사용을 평가 하는 유사한 접근 방식을 설명 DDA 협상입니다. 나카 야 스 외. 14 비슷한 DDA 접근 방식을 사용 하지만 대신 빛과 무거운 틸 리 immonium 이온의 비율을 사용 하는 정량화에 대 한. 정량화 파편 이온에 따라 그대로 펩 티 드 선구자 이온 (MS1) 처리에 비해 적은 신호 간섭에 대부분의 경우 결과에 immonium 또는 시퀀스 이온 (MS2). 그러나, DDA 생성 MS/MS 스펙트럼에서 조각 이온의 정량화에서 확률적 샘플링 결함, MS/MS에 대 한 선택 되 고 따라서,의 치 우 치고 다 불완전 한 샘플링으로 이어질 가능성이 더 높은 풍부 선구자 이온이은 겪을 수 있다 선구자 이온입니다.
이 소설 워크플로4 (그림 1) 개념적으로 안정 동위 원소 화학 라벨 바 외에 의해 원래 개발 접근 방식을 사용 합니다. 그러나 12, 워크플로 이후에 결합 디 아 모두 전조를 수집 하 고 여러 조각 이온 나타났는데 감지 질량에 범위15,16 정확 하 게 산출할 계산을 제공 하.
피크 넓이에서 조각 관심, acylation 사이트를 포함 하는 이온 또는 acylation 사이트 인 (그림 2)를 계량 하는 데 사용 됩니다 '조각 이온 차별화'. 조각 이온 수정 포함 되지 않은 동일한 빛과 무거운 m/z 값, 고 정량화 하지만 펩 티 드 식별을 위해 사용 됩니다. 스카이 라인 소프트웨어17 전조 및 조각 피크 영역을 추출 하는 데 사용 됩니다. 주어진된 acylation 사이트를 포함 하는 여러 개의 조각 이온의 존재는 간섭 조각 이온의 일부에서 검색 되 면 유연성을 제공 합니다. 가벼운-무거운 조각 이온 비율의 중요 한 검사에 대 한 스카이 라인 데이터 시각화 수 있습니다. 수동 데이터 분석 이외에 자체, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR)를 작성 하는 오픈 소스 R 패키지 개발 되었다,이 데이터를 사용 하는 선구자 이온 및 조각 이온 디 아를 통해 수집 하 고 단정 사이트별 acylation 산출할 펩 티 드 포함 여러 리 진 잔류물, 선구자 이온 전용 강도 측정4불가능 기능에서.
이 프로토콜은 또한 endoproteinase Glu-C, 글루타민, aspartic 산 성 잔류물, 후자는 종종 매우 큰 생성 하 고 잠재적으로 증식 트립 신 또는 Arg C 효소를 사용 하는 대신에 C 터미널 분열에 대 한 특정의 사용 방법을 보여 줍니다. acylated 분해 펩 티 드에서 유래한 acylated 리 진 잔류물에 트립 신 분열을 차단. 화학 절차 라벨은 또한 호박 무수 물 (그림 1), succinylation 산출할 succinylation의 정량화 함으로써의 사용을 포함 하도록 확장 됩니다. 샘플 준비, 오프 라인, 기본 산도 의해 펩 티 드 분별 법의 구현에 개선 뿐만 아니라 더 펩 티 드의 반전 위상 (bRP) 분리 정량화 방해의 더 나은 드 회선 수 감소 acylation 산출할 전체 프로테옴 샘플에. 함께,이 방법을 기능과 여러 가지 이점을 강조: 화학 acylation;의 효율성 향상된 (1) (2) 단백질 succinylation 산출할 acetylation; 외의 측정 그리고 (3) 향상 된 정량화 정확도입니다. 향상 된 정량화 bRP에 의해 오프 라인 펩 티 드 사전 분류의 구현 뿐 아니라 DDA 전조 신호에 비해 디 아에서 조각 이온 신호 감소 방해 때문 이다.
Protocol
1. 양적 Acetylate 또는 Succinylate 단백질 동위 원소 표시를 사용 하 여 아세트산 또는 호박 무수 물
- (총 100 µ L), µ 1 µ g/L의 농도에서 병렬로 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 단백질 견본의 100 µ g의 3 복제 준비 요소 및 triethylammonium 중 탄산염 (TEAB) 솔루션 (8 M 요소, 200 m m TEAB, pH 8)를 사용 하 여.
참고: 아민 프리 버퍼를 사용 하 여 중요 하다. 여기 섹션에서 사용 되는 대표적인 결과 단백질 견본 BSA, 양적 BSA, succinylated 그리고 혼합물으로 샘플링 그 BSA를 매우 저조한 각각 0%, 1%, 10%, 50%, 및 100%에 succinylation 인 정의 (각 샘플 준비 됩니다 3 복제) 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 대장균 에서 단백질 lysates 수행 되었습니다 또한 고 간4마우스. 프로토콜은 다른 세포 또는 조직 lysates에 또한 적용할 수 있습니다. - 250 m m dithiothreitol 20 mM DTT의 최종 농도 도달 하 여 1400 rpm 동요와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어 (DTT)의 8 µ L와 BSA 샘플 (100 µ g) 100 µ L를 줄일 수 있습니다.
- 40 m m iodoacetamide의 최종 농도 도달 하 고 30 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어 200 m m iodoacetamide의 21.6 µ L로 감소 된 BSA 샘플 알
참고: 그것은 중요 한 약간 iodoacetamide 농도가지고 모든 단백질 thiols 감소 되도록 DTT 농도의 2 개 이상의 x alkylated는. -
아세트산 무수 물-d6 (단계 1.4.1) 또는 호박 무수 물-d4 (단계 1.4.2) 화학 (양적) acetylation 또는 샘플의 succinylation에 필요한 준비를 진행.
- 분자량 (108.13 g/mol) 및 밀도 (25 ° C에서 1.143 g/mL)에서 수성 아세트산 무수 물-d6 솔루션의 1 g 약 수의 몰 (M)을 결정 합니다.
참고: 1 g 패키지 샘플의 acetylation 당 사용 10.57 M 솔루션 저조한 875 µ L 볼륨에 아세트산 무수 물-d6 의 9,248 µmol을 포함 합니다. - 피하기 위해 시 약의 가수분해 반응 직전 무수 DMSO에 분말을 용 해 하 여 호박 무수 물-d4 의 5 M 솔루션을 준비 합니다. 5 M 솔루션을 얻기 위해 무수 DMSO의 461 µ L에서 호박 무수 물-d4 의 0.24 g을 분해.
- 분자량 (108.13 g/mol) 및 밀도 (25 ° C에서 1.143 g/mL)에서 수성 아세트산 무수 물-d6 솔루션의 1 g 약 수의 몰 (M)을 결정 합니다.
- 각각, 아세트산 무수 물-d6 (10.57 M 솔루션의 6 µ L) 또는 호박 무수 물-d4 (5 M 솔루션의 12 µ L)의 60 µmol을 추가 하 여 정량적 화학 acetylation 또는 succinylation를 수행 하 고 품 어는 와 동 믹서에 20 분 동안 4 ° C에서 샘플.
참고: anhydrides의 산 성도 때문에 단백질 수 있습니다 침전 됩니다. 주의 하 고 1.6 단계에서 설명한 대로 조정 합니다. - ~ 8 O acylation 측면-제품을 제거 하기 위해 pH를 증가 하는 부 화 후 7.25 M NaOH의 10 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 그리고 확인 탐지 1 µ L에 의해 샘플 pH pH 종이에.
참고: 그것은 pH 8 도달 7.25 M NaOH의 이상의 10 µ L를 추가 하려면 필요할 수 있습니다. 또한, 잠재적으로 침전 된 단백질 분해 다시 한다. - 총 세 번의 1.5 및 1.6 acylation 당 및 pH 조정 단계를 반복 합니다. PH 값을 확인 하 고 기본 솔루션 반복 당 추가 볼륨 합니다. 위의 기간 동안에 신속 하 게 작업 화학 acylation 단계는 anhydrides은 고 반응성을 잃을 것 이다 때문에.
- 최종 레이블 반응 및 pH 조정 후, O-acylation 측 반응에 되돌리려면 50 %hydroxylamine 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
2. 다이제스트 반응 단백질 견본 Glu C Endoproteinase를 사용 하 여
- 0.8 m 50 m m TEAB, pH 8 사용 하 여 우 레 아 농도 희석 하 고 샘플 볼륨을 정상화.
- 1:50 endoproteinase Glu-C를 추가 하 여 단백질 견본 소화 효소 기질 단백질 비율 (w/w)와 1400 rpm 동요와 37 ° C에서 하룻밤 샘플을 품 어.
- 시 어 지 다 하 고 1% 볼륨으로 포 름 산을 추가 하 여 단백질 소화 샘플을 끄다.
-
질 성 친수성 균형 고체 상 추출 카트리지를 사용 하 여 샘플 desalt 샘플, 최대 5 mg 자료 카트리지4,18당 당 한 30 mg 매 카트리지를 사용 합니다.
참고: 그것은 매 염이 과정을 통해 젖은 카트리지 안에 유지 하는 것이 중요입니다. 필요한 경우 용 매 또는 카트리지를 통해 샘플의 통로 천천히 진공 펌프를 해제 합니다.- 포트 24 포트 유리 블록 진공 매니폴드에는 카트리지를 삽입 하 고 진공 펌프를 켭니다. 사용 되지 않는 포트로 출장을 남겨 주세요. 필요한 경우 진공 게이지에 낮은 압력을 유지 하기 위해 취소 출장 하나 또는 두 개의 포트를 남겨 주세요.
- 각 카트리지 두 번 80% 이기 (ACN)/0.2% 개미의 acid/19.8% 물의 800 µ L 젖은. 유지할 용 매 수준의 매 수준 위에 2-3 m m. 매니폴드의 진공 게이지 16.9-67.7 kPa (Hg에서 5-20)을 읽고 확인 합니다.
- 각 카트리지 세 번 물에 0.2% 개미 산의 800 µ L equilibrate 매니폴드의 진공 게이지 16.9-67.7 kPa (Hg에서 5-20)을 읽고 확인 합니다.
- 카트리지에 펩 티 드 샘플을 로드 합니다. 매니폴드의 진공 게이지 읽고 6.77-8.47 kPa (2-2.5 Hg), 고 유량 1 mL/min를 초과 하지 않는 확인 하십시오.
- 각 카트리지 세 번 800 µ L 0.2% 개미 산 성 물에 씻는 다. 매니폴드의 진공 게이지 16.9-67.7 kPa (Hg에서 5-20)을 읽고 확인 합니다.
- 진공 매니폴드에서 카트리지를 제거 하 고 1.5 mL microtube에 정착.
- Elute 펩 티 드의 80 %ACN/0.2% 개미의 acid/19.8% 물 800 µ L로 한 번 하 고 용 매와 함께 알을 품을 수 있도록 매 2-3 분.
- 카트리지 내부 매 계층을 통해 밀어 용 매에 피 펫을 사용 합니다. 400 µ L 80%의 두 번째 차입에 대 한 동일한 1.5 mL microtube에 ACN/0.2% 개미의 acid/19.8% 물을 반복 합니다.
- 3 h에 대 한 일반적으로 진공 원심 (268 x g에서 원심 분리 속도 고정), 여는 eluate 건조.
참고: 필요한 경우, 말린된 eluate 샘플 저장할 수 있습니다 분류와 진행 준비까지-20 ° C에서 냉동.
3. 오프 라인 기본 상 반전된 단계 HPLC를 사용 하 여 펩 티 드 충분치
- 다시 200 µ L 버퍼 A의 (10 m m 염화 물, pH 10에에서 편대)에 당 acylated와 Glu-C 소화 샘플 (준비 섹션 1과 2에 설명 된 대로)를 일시 중단 하 고, 4 ° C에서와 동 믹서에 10 분에 대 한 샘플을 혼합 하 고 룸에서 10 분 동안 17500 x g 에서 원심 테 mperature입니다.
참고: 결과 펩 티 드 샘플은 오프 라인 될 준비가 높은 pH 분리19,20분류 한. - 악기 및 사용 소프트웨어에 따라 오프 라인 HPLC 분류 방법 프로그램. 다음 메서드는 이중 파장 UV 검출기, 등 한 autosampler, 분수 수집기 C18 열 (4.6 mm x 250 m m, 5 µ m 입자 크기) pH 10를 허용 하는 이진 HPLC 펌프 시스템에 대 한 특정.
- 분수 당 2.1 분으로 각 40 분수를 수집 하 고 모든 4 분수, 4 최종 풀링된 분수4결과 결합. 더 많은 수 풀링된 분수의 추가 질량 분석 데이터 수집 시간 비용 샘플 복잡성을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다.
- 건조 한 lyophilizer에서 풀링된 분수, 다시 물에 50 %ACN 1% 포 름 산의 1 mL에 건조 펩 티 드 샘플을 일시 중단 하 고 작은 샘플 컨테이너에 전송. 일반적으로 1 시간에 대 한 진공 원심 (268 x g에서 원심 분리 속도 고정) 통해 전송된 샘플을 건조.
참고: 암모늄 편대의 낮은 증기압 어려울 수 있습니다 완전 한 건조. 상당한 양의 암모늄 편대 소금 건조 후 소금 침전으로 남아, 단단한 단계 적 출을 반복 합니다. - 다시 인덱싱된 보존 시간 (iRT) 펩타이드 표준 혼합 물에 0.2% 개미 산의 20 µ L에서 샘플을 일시 중단 합니다.
참고: 샘플 질량 분석에 의해 분석에 대 한 준비가 있다.
4. 디 아 분석의 분류 한 펩 티 드 샘플
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사용할 수 있는 대량 spectrometric 악기에 따라 조정 될 수 있는 디 아 LC-MS/MS 메서드를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다. 분석 온라인 직교 사중 극 자 비행 시간 (QqTOF) 질량 분석기에 연결 된 나노-LC 2D HPLC 시스템을 사용 하 여 수행 되었다.
- 펩 티 드 혼합물 C18 사전 열 칩에 전송 됩니다 있도록 악기 소프트웨어 프로그램 (x 6 mm C18-CL 칩, 3 µ m의 200 µ m 300 Å) 고 분 2 µ L/담 대 한 로드 용 매 (H2O/0.1% 포 름 산)와 10 분 동안 세척.
- 75 µ m x 15 cm C18-CL 칩에 chromatographically 펩 티 드를 분리 (3 µ m, 300 Å) 300 nL/최소 2 h 그라데이션 사용 하 여 일반 (및 LC 시스템 특정)의 유량에 수성 ACN 용 매4버퍼링 및.
- 어디 가변 폭 (5 ~ 90 m/z)의 대량 범위 윈도우에 전달 되는 1 분기 4 중 극에서 증분 단계에서 충돌 셀 전체 질량 범위 (m/z 400-1250) 변수 창 디 아 메서드를 생성 합니다.
참고: 주기 시간 3.2 s 포함 64 길 세그먼트21,22의 각각 45 축적 시간 뒤 250 ms 선구자 이온 검사.
- 펩 티 드 DDA MS에 의해 견본의 병렬 분석 및 스펙트럼 라이브러리의 건물을 사용 하 여 식별 또는 양자 택일로, 펩 티 드 PIQED 소프트웨어23, 데이터 처리의 모든 기술적인 단계 처리를 사용 하 여 디 아 데이터에서 직접 확인할 수 있습니다. 식별, 그리고 이후 정량화에 대 한 스카이 라인으로 가져오기.
5. 예제 데이터 분석 자습서
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스카이 라인 소프트웨어 (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)를 다운로드 하 고 PanoramaWeb 계정 (https://panoramaweb.org)을 만듭니다.
참고: 데이터와 스카이 라인의 사용을 설명 하는 자세한 튜토리얼 (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials)을 참조 하십시오. 다른 소프트웨어 알고리즘 디 아 인수 오픈 길24,25, PeakView 및 Spectronaut26길 2.0 플러그인에서에서 빛과 무거운 조각 이온 피크 영역 추출 대신 사용할 수 있습니다.- 파노라마 공개에서 succinylated BSA 대표 결과 (그림 3)에 대 한 스카이 라인 데이터 파일 다운로드: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. 파노라마 페이지에 "MS 실행 대상" 테이블에가 고 오른쪽에 있는 다운로드 링크를 선택 하 고 sky.zip 파일을 다운로드. 다운로드 한.zip 폴더를 추출 하 고 스카이 라인에 그것을 열고 skyline.sky 파일에 더블 클릭. 펩 티 드 파편 이온 대상 트리 (왼쪽된 패널)와 4 개의 chromatograms 라이트 succinylation (오른쪽 패널)의 정의 된 백분율에서 확인 하십시오.
- "보기" 메뉴를 선택, 이동 "피크 지역 | 복제 비교 ". "피크 영역-복제 비교" 패널 막대 그래프를 포함 하는 창의 오른쪽에 표시 됩니다. 피크 넓이 패널에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 "전환 | 싱글 "선택한 조각 이온의 조각 이온 피크 영역을 보여줍니다. 마지막으로, "최대 영역" 패널을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 "주문 | 문서 "입니다.
- 윈도우의 왼쪽에 대상 트리 패널에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 펩 티 드 "E.LCKVASLRE. T | 비율을 | Oneheavy ", 무거운 이온 신호, 빛/무거운 빛 이온 신호의 비율을 계산 하는.
참고: 이것은 아닙니다 Light/(Heavy+Light)의 사이트 인 산출할 비율 동일입니다. - 대상 나무는 지금 빛의 조각 이온의 오른쪽 비율 L/H를 보고 알 수 있습니다.
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"차별화 조각 이온"의 acylation 사이트를 포함 하는 결정 합니다.
참고: 그림 3에서처럼이 정확한 예를 갖춘 차별화 이온 결정 했다 y7 (가장 위), y8, b3와 b4로. 비 차별화 조각 이온 대상 트리에 1의 비율을 보여 알 수 있습니다.- 588.30 + + 아래 왼쪽된 패널 대상 트리에 펩 티 드 E.LCKVASLRE의 하위 노드. T의 조각 이온 차별화는 y7 클릭
K [y7 ]-902.49 + (rank1) [5]
증가 피크 높이 위치를 알 수 있습니다. - 588.30 + + 아래 왼쪽된 패널 대상 트리에 펩 티 드 E.LCKVASLRE의 하위 노드. T, y5 비 차별화 조각 이온 클릭 [y5 ]-575.31 + (순위 6) [1]. Y5 조각 이온 chromatograms와 피크 지역 모든 샘플에 대 한 동일한 범위에 남아 확인 합니다.
- 대상 트리 패널에서 탐색할 다른 차별화 (1 이외의 비율)와 비 차별화 (1의 비율) 이온 그리고 변화 고 바 그래프와 chromatograms 피크 지역에서 패턴.
- (대 한 자세한 내용은 또한 참조 메이어 외 는 산출할 계산 하려면 차별화 이온의 빛과 무거운 쌍에 대 한 정확한 피크 넓이 결정 4). 클릭은 "보기 | "문서 격자와 문서 격자 팝업 됩니다. 상단에 문서 눈금의 왼쪽에서 클릭 "보기 | 결과 전환"펩 티 드 순서, 전조 mz, 등의 조각 이온 정보로 여러 열 테이블을 보고 복제 이름, 등
- "피벗" 다시 문서 눈금에 "조회" 클릭 하 고 보기 사용자 지정 창을 엽니다 "편집 보기"를 선택 하 여 보고서 형식을 변경 합니다. "사용자 지정 보기" 창 왼쪽 하단에 "피벗 복제 이름"을 확인 하 고 보기 사용자 지정 창을 닫습니다 "확인"을 선택 합니다. 관찰 하는 "문서 격자: 전환 결과" 표 창 그룹 복제 이름, 보존 기간, 지역, 배경을 다시 마련 했다, 이제 피크 순위 열으로 복제 (1%, 10%, 50%, 100 %succinylation).
- 펩 티 드 "E.LCKVASLRE에 대 한. "문서 격자:: 전환 결과" 테이블에 "T" 전조 Mz "열," 조각 이온 "열 및 1pct_light_sw1 지역 (1 %succinylation) 열을 찾아. 두 선구자 이온이 펩 티이 드, 빛에 대 한 (처음 8 행에서 588.30의 전조 Mz), 그리고 무거운 (마지막 8 행에서 590.32의 전조 Mz)는 관찰 합니다.
- "조각 이온" 열에서 y8 파편 이온에 해당 하는 빛과 무거운 선구자 이온에 대 한 두 개의 행을 찾습니다. 1pct_light_sw1 영역 열에서 같은 행에서 빛 (15,820), 그리고 무거운 (1,426,461)에 대 한 y8 영역을 기록 합니다.
- 588.30 + + 아래 왼쪽된 패널 대상 트리에 펩 티 드 E.LCKVASLRE의 하위 노드. T의 조각 이온 차별화는 y7 클릭
- 이러한 피크 지역 값을 사용 하 여 succinylation 산출할, 계산 또는 비율 수정, 아래의 공식에 따라 고 0.01, 또는 일치 하는 정의 된이 빛 succinylation의 비율 1 %succinylation 산출할 비율 혼합:
- Y8 차별화 조각 이온 피크 지역 값 144,953 (빛) 및 1,188,041 (무거운), 0.10, 또는 10 %succinylation 비율을 얻기 위해 10pct_light_sw1 영역 열에서를 사용 하 여 10 %succinylation 대 한 산출할 비율을 계산 합니다.
- Y8 차별화 조각 이온 피크 지역 값 954,513 (빛) 및 16,407 (무거운), 0.98, 또는 98 %succinylation 비율을 얻기 위해 100pct_light_sw1 영역 열에서를 사용 하 여 100 %succinylation 산출할 비율을 계산 합니다.
- 마찬가지로, 1 %succinylation 값을 사용 하는 b 3 차별화 조각 이온 피크 지역 55,697 (빛) 및 3,149,119 (무거운), 0.01, 또는 1 %succinylation 비율을 얻기 위해 1pct_light_sw1 영역 열에서 산출할 비율로 계산 합니다.
- 모든 차별화 조각 이온에 대 한 수식을 사용 하 여 산출할 비율 계산을 계속 산출할 값 1, 10, 50, 그리고 100 %succinylation 혼합물에 대 한 리 신 succinylation를 y와 b 이온.
Representative Results
데이터 수집 후 차별화 MS2 조각 이온 분해 acylated 펩 티 드에서 결정 되었다, 이후에 추출된 이온 chromatograms (XIC) 스카이 라인, 그리고 해당 빛 처리 및 무거운 피크 넓이 했다 수출 되었다 마지막으로 사이트 인 계산에 사용. 그림 2A 선구자 이온 XIC의 수 있습니다의 개념적 그림을 보여줍니다 모두 빛과 무거운 펩타이드 신호를 갖춘 나타나고 그림 2B 선물 해당 조각의 예 이온 XICs 컬러 코딩 (붉은 빛, 블루 = = 무거운 ) 리 acylation 수정을 포함 하는 조각 이온을 차별화 하는 데.
그림 3 같은 위에서 설명한 빛/중 succinylated-1, 10, 50, 또는 100%, succinylation 인 그의 결정에서 생성 하는 BSA의 미리 정의 된 비율 분석 인 실험에서 발생 하는 데이터를 보여 줍니다. 스카이 라인 디 아 인 데이터를 가져오는 대상 트리, 펩 티 드 순서, 및 조각 모두에 대 한 이온 (그림 3A) 빛과 무거운 선구자 이온 표시의 쉬운 시각화 수 있습니다. 각 정의 된 succinylated BSA 비율의 디 아-ms에서 데이터 공개 immanently 가벼운-무거운 y7 이온, 높은 순위 차별화 조각 이온에서 확인 된 펩 티 드-스펙트럼 일치의 비율의 상대적 차이 (빨간색으로 표시 된 그림 3B). 그림 4 여기 사전-succinylated BSA의 구성 된 확인 입력된 단백질의 succinylation 비율 인 MS2 인 계산에서 처리 결과 대 한 개요를 보여 줍니다. 상업적인 사전-succinylated BSA, succinylated에 정의 된 백분율 (예를 들어, 0, 1, 10, 50, 그리고 100%에)에서 얻은 20 분해 succinylated 펩 티 드에 대 한 측정된 lysine succinylation 인은 표 2에 표시 됩니다. 각 20 분해 BSA 펩 티 드에 대 한 가장 높은 순위, MS2 차별화 조각 이온이 L/(L+H) %에서로 리 신 succinylation (Ksucc) 인, 계산 하는 데 사용 되었다. 전반적으로, MS2 기반 정량화 낮은 stoichiometries에 acylation 인 결정에 아주 좋은 정확도 보였다.
그림 1: 산출할 워크플로. (A) 단백질은 알을 품을 세 번 아세트산 무수 물-acetylate 수정 되지 않은 리 진 잔류물을d6 와 함께. 다음, acetylated 단백질 endoproteinase Glu-C, 뒤에 기본 상 반전 단계 착 색 인쇄기를 사용 하 여 분해 펩 티 드의 HPLC 분류와 소화 됩니다. 마지막으로, 펩 티 드 LC MS 분석은 가변 전조 창 너비와 디 아를 사용 하 여. (B) 동일한 워크플로 무거운 acylation 시 약을 제외 하 고 (A)에 설명 된 대로 succinylation 산출할 호박 무수 물-d4로 변경 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 메이어 외에서 적응입니다. 4 (J. 이에요 soc. 질량 Spectrom., 열기 선택). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 획득 가능한 데이터의 예제 및 산출할 계산. (A) 빛 (L) 그리고 무거운 (H) MS1 선구자 이온 acetylated lysine 3 질량 단위 다른 하나를 포함 하. XICs 빛과 무거운 동위 원소 봉투 표시 된 빨간색과 파란색, 각각 생성 됩니다. (B) 정량화 MS2 디 아 인수에서 조각 이온 XICs '차별화' acetylation 사이트를 포함 하는 빛과 무거운 조각 이온을 사용 하 여 수행할 수 있습니다에서 빨간색과 파란색 표시. 일반적인 조각 이온 점선된 검은색으로 표시 하 고 수정 사이트를 포함 하지 않습니다. 그림 메이어 외에서 적응입니다. 4 (J. 이에요 soc. 질량 Spectrom., 열기 선택). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 다른 인 수준에서 succinylated 분해 BSA 펩타이드의 스카이 라인 시각화. (A) 스카이 라인 대상 트리 분해 펩 티 드를 보여주는 LCKsuccVASLRE와 그것의 유래 파편 이온. (B) 스카이 라인 조각 이온 chromatograms succinylation 점령의 다양 한 수준에서 추출. 최고 순위 차별화 이온, y7, 1, 10, 50 및 100% (자체 생성) 사전-succinylated BSA의 입력된 비율에 상관 피크 지역에서 증가 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 평가 사전 succinylated BSA의 BSA acylation 산출할. 5 다른 BSA 샘플 무거운 수정의 정의 된 비율에서 (예., 0, 1, 10, 50, 그리고 100%에) MS2 인 결정을 복종 되었다. 20 succinylated BSA 펩 티 드에 대 한 사이트 인 빛 수정 (예를 들어, 0, 1, 10, 50, 그리고 100%에서)의 정의 된 비율에 5 개의 다른 BSA 샘플에 대 한 높은 순위 차별화 조각 이온에서 결정 했다. 20 succinyl 펩 티 드의 분포를 표시 하는 상자 수염 음모, 펩 티 드의 50%에서 값은 '상자' (75% 백분위 수를 25% 백분위), 위 수염 최대 (100%), 75% 백분위 값을 나타내고 낮은 수염 나타냅니다. 최소 (0% 백분위)에서 25% 백분위 수 값입니다. (J. 이에요 soc. 질량 Spectrom., 열기 선택). 측정의 정량화는 표 2에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시간 (분) | % A | % B |
| 0.00 | 100 | 0 |
| 7.27 | 92 | 8 |
| 45.27 | 73 | 27 |
| 49.27 | 69 | 31 |
| 65.27 | 61 | 39 |
| 72.27 | 40 | 60 |
| 80.00 | 10 | 90 |
| 85.00 | 10 | 90 |
| 86.00 | 100 | 0 |
| 120.00 | 100 | 0 |
| 유량: 0.7 mL/min | ||
| 물, pH 10에에서 버퍼 a: 10 m m 염화 편대 | ||
| 90 %ACN 10% 물, pH 10에서에서 버퍼 b: 10 m m 염화 편대 | ||
| 참고: 두 단계 전부 모바일의 pH 조정 깔끔한 암모니아와 10 | ||
표 1: 오프 라인 기본 상 반전 단계 HPLC 분별에 대 한 그라데이션. 그라데이션 길이: 물, pH 10에에서 120 분 버퍼 a: 10 m m 염화 편대. 버퍼 b: 90 %ACN 10% 물, pH 10에서에서 10 m m 염화 편대.
| L / L + H % | L / L + H % | L / L + H % | L / L + H % | L / L + H % |
| Ksucc 0% | Ksucc 1% | Ksucc 10% | Ksucc 50% | Ksucc 100% |
| 0.2 | 1.7 | 11.1 | 50.9 | 99.2 |
| 1.2 | 2.3 | 12.3 | 49.4 | 97.6 |
| 2.9 | 3.8 | 14 | 48.6 | 99.5 |
| 0.5 | 1.8 | 11.7 | 50.8 | 99.5 |
| 0.2 | 1.7 | 11.1 | 48.3 | 98.2 |
| 0.2 | 1.2 | 11 | 47.5 | 96.1 |
| 0.3 | 1.6 | 12.8 | 51 | 99.2 |
| 3.7 | 5.2 | 14.7 | 51.9 | 89.5 |
| 1.5 | 1.8 | 12.5 | 47.2 | 91.1 |
| 0.8 | 1.5 | 11.3 | 48.4 | 96.8 |
| 0.2 | 1.6 | 13.9 | 49.7 | 98.9 |
| 0.1 | 1.1 | 10.7 | 48.2 | 98.6 |
| 0.2 | 0.9 | 10.3 | 49.4 | 99.4 |
| 0.5 | 2.5 | 17.2 | 52.3 | 97.5 |
| 0.1 | 3.5 | 20.8 | 51 | 99 |
| 0.3 | 1.9 | 10.7 | 49.6 | 98.2 |
| 2 | 1.7 | 10.9 | 47.7 | 96.3 |
| 0.3 | 1.2 | 10 | 53 | 98 |
| 1.1 | 1.8 | 12.9 | 57.9 | 94.1 |
| 0.2 | 1.4 | 11.6 | 48.6 | 98.8 |
표 2: 측정 된 BSA lysine succinylation 인 20 분해 succinylated 펩 티 드의 정량화. Succinylated 펩 티 드 상업 사전-succinylated BSA, 정의 된 백분율 (예를 들어, 0, 1, 10, 50, 그리고 100%에)에서 succinylated에서에서 얻은. 각 20 분해 BSA 펩 티 드에 대 한 가장 높은 순위, MS2 차별화 조각 이온이 L/(L+H) %에서로 리 신 succinylation (Ksucc) 인, 계산 하는 데 사용 되었다.
Discussion
이 프로토콜에는 소설과 정확한 방법 사이트별 lysine acetylation와 전체 proteome에 적용 될 수 있는 succinylation 인 척도를 제공 합니다. 이 방법은 생 빛 펩 티 드와 외 인 무거운 펩 티 드, 후자는 생성 되 체 외에서 deuterated 아세트산 무수 물-d6 단백질의 정량적 화학 acylation를 사용 하 여 측정에 의존 또는 호박 무수 물-d4 (그림 1). 비슷한 메서드는 네이티브 수정 되지 않은 리 진 잔류물의 안정 동위 원소 라벨 사용 하 고 어느 선구자 이온 전용12 또는 조각 이온 DDA 인수13,14에서 따라 사이트 인 정량화를 수행. 이 프로토콜 acylation 효율 향상을 위해 견본 준비 동안 여러 단계를 적용 하 고 succinylation를 화학 라벨을 확장 합니다. 디 아 인수를 사용 하 여 데이터 컬렉션을 가져옵니다 선구자 이온과 MS2 조각 이온 농도를 조각 이온 간섭 감소 전체 감지 대량 범위. 분석 및 정량화 스카이 라인 및 자체 개발 하는 사용자 지정 스크립트를 통해 하나 이상의 리 진 잔류물과 하나의 사이트에서 하나 이상의 acylation를 포함 하는 펩 티 드에 대 한 사이트 인 계산을 수 있습니다.
밀접 하 게 따라 합니다이 프로토콜의 샘플 준비 단계에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 때문에 전체 프로토콜 모든 리 진 잔류물의 효율적인 화학 수정에 의존,이 단계는 매우 중요. Anhydrides lysate 단백질에서 포함 하는 아민 버퍼 또는 오염 물질 분자를 피해 야 한다 그래서 자유로운 아민으로 반작용 한다. 또한 화학 당 acylation 단계는 반응 혼합물의 pH 조정 됩니다 다시 pH 8 후 무수 물 시 약으로 3 개의 외피의 각이 반응 혼합물을 산성화 하 고 O-acylation 측 반응 양식을 수 있습니다 확인 합니다. 또한, 8 M 요소 포함 된 반응 혼합물에 최적의 범위 내에서 pH는 소화와 검사 전에 0.8 M 요소 주위의 희석은 Glu C. endoproteinase의 최적 활동에 대 한 중요 한 우리의 프로토콜의 또 다른 핵심 구성 요소는 모든 DDA 데이터 샘플링 불일치를 극복 하 고 MS2 조각 이온 수준 정량화에 대 한 수 있는 디 아 작업의 소개와 데이터 수집 단계입니다. 디 아 방법론의 주요 장점 중 하나는 일반적으로 훨씬 더 경향이 문제 (로 이전 간행물의 일부 제안) MS1 선구자 이온 신호를 측정 하는 때 방해의 감소 이다.
매우 복잡 한 샘플을 준비할 때 워크플로에 여러 수정 할 수 있다. 풀링 후 오프 라인 기본 상 반전 단계 HPLC 분별 낮은 LC/양 또한, 더 이상 컬럼에 그라디언트 수에 의해 또한 인수는 풀링된 샘플의 복잡성 감소 수 분수의 수 중에 사용 될 더 펩타이드 분리 수 있도록 인수입니다. 또는, 여러 프로 테아 제 소화 쪼개진된 펩 티 드의 큰 다양 한 생산 단백질 리 진 잔류물의 범위를 증가 하는 샘플을 사용할 수 있습니다. 시운전 및 최적화 acetylation 또는 succinylation의 특정 백분율을 포함 하는 상업 BSA를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
한 제한은이 프로토콜입니다로 인해 잠재적으로 약간의 사이트 인과 메 틸 화 또는 ubiquitination, 등, 동일한 사이트4다른 신 수정, 걸렸다. 빛과 무거운 acyl 수정, L/(L+H)의 피크 넓이에서 계산 사이트 인은 리 사이트에서 수정의 총 수준만 생 '빛' acylation (L)의 구성 하는 가정에 기초 하 고 화학적 '무거운' 표시 acylation (H)입니다. 그러나, 한 사이트에서 에서 vivo에서 실제 총 acylation 인 acetylation 및/또는 succinylation를 넘어 다른 수정 내용을 포함할 수 있습니다. 또한, 구입한 시 약 아세트산 무수 물-d6 (99%)와 호박 무수 물-d4 의 보고 된 동위 원소 순수성 (> 98%)의 1% (틸) 또는 최대 2% (succinyl)의 작은 과대평가에 기여할 수는 내 인 성 acylation 레벨4. 함께, 이러한 약간의 과대평가 사이트 1% 미만으로 측정에 어려움에 추가 인. 완전 한 큰 풍부 차이 화학적 acylated 펩 티 드 및 네이티브 acylated 펩 티 드 또한 기여할 잠재적인 사이트 인 정량화 오류, 특히 낮은 생 acylated 펩 티 드27. Weinert 외최근 연구. 27 감소 풍부한 차이 완전 한 당 acetylated 펩 티 드27정량화 오류 줄일 수 있습니다 발견.
이 프로토콜을 사용 하 여 수집 산출할 quantifications 관심의 특정 사이트의 사이트 감독 mutagenesis와 같은 생물 학적 후속 실험에 대 한 특정 단백질 및 양식 가설에 중요 한 acylation 핫스팟 정확 하 게 수 있습니다. 이 프로토콜은 낮은 acylation 산출할 사이트 단백질 구조 안정성에 간접 또는 미묘한 영향을 발휘할 수 있는 셀룰러 환경 지역화의 결합된 효과 밝힐 수 수 있습니다. 또한, acetylation 및 succinylation 및 다른 가능한 lysine acylation 수정 acetylation 넘어 측정 하이 프로토콜의 구현 고유에서 다른 단백질에 동적 acylation 효과에 대 한 통찰력 제공 생물 학적 조건입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 국립 연구소의 당뇨병에 의해 지원 되었다 및 소화기 및 신장 질환 NIH-NIDDK 부여 R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM NIH T32 친교에 의해 지원 되었다 (T32 AG000266, PI: J. Campisi). 저자는 NIH에서 지원 공유 벅 연구소 TripleTOF 6600 시스템에 대 한 계측 부여 인정 (1S10 OD016281, PI: 들어 깁슨).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
| succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
| sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
| Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
| HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
| HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
| urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
| triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
| anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
| 50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
| LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
| LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
| Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
| Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
| Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
| Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
| Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
| indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
| SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
| Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |
References
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