Summary
Vi præsenterer her, objektiv kvantificering af lokationsspecifikke protein acetylation og/eller succinylation belægning (støkiometrisk) af en hel proteomet gennem en ratiometric analyse af endogene ændringer ændringer indført efter kvantitative kemiske acylation ved hjælp af stabile isotop-mærket anhydrider. I kombination med følsomme data-uafhængig erhvervelse massespektrometri fås nøjagtig site belægning målinger.
Abstract
Posttranslationel modifikation (PTM) af protein lysin rester af NƐ- acylation inducerer strukturelle ændringer, der kan dynamisk regulere protein funktioner, for eksempel ved at ændre enzymatisk aktivitet eller ved mægle interaktioner. Præcis kvantificering af lokationsspecifikke protein acylation belægning eller støkiometrisk, er afgørende for at forstå de funktionelle konsekvenser af både globale low-level støkiometrisk og enkelte højt niveau acylation støkiometrisk af specifikke lysin restkoncentrationer. Andre grupper har rapporteret måling af lysin acetylation støkiometrisk ved at sammenligne forholdet mellem peptid forløber isotoper fra endogene, naturlige overflod acylation og eksogen, tung isotop-mærket acylation indført efter kvantitative kemiske acetylation af proteiner ved hjælp af stabile isotop-mærket eddikesyreanhydrid. Denne protokol beskriver en optimeret tilgang byder adskillige forbedringer, herunder: (1) øget kemiske acylation effektivitet, (2) evnen til at måle protein succinylation ud over acetylation, og (3) forbedret kvantitative nøjagtighed grund reduceret interferenser bruge fragment ion kvantificering fra data-uafhængig erhvervelser (DIA) i stedet for forløber ion signal fra data-afhængige erhvervelse (DDA). De udtrukne toparealer fra fragmentioner for kvantificering også entydigt giver mulighed for differentiering af site-niveau acylation støkiometrisk fra proteolytiske peptider der indeholder mere end én lysin rester, som ikke er muligt at bruge forløber ion signaler til kvantificering. Datavisualisering i Skyline, en open source kvantitative proteomics miljø, giver mulighed for bekvem data inspektion og revision. Sammen, tilbyder denne arbejdsproces objektiv, præcis og nøjagtig kvantificering af lokationsspecifikke lysin acetylation og succinylation belægning af en hel proteomet, som kan afsløre og prioritere biologisk relevante acylation websteder.
Introduction
NƐ- acylation af protein lysin rester er en vigtig regulator af protein funktion. Lysin acetylation og andre acylations, såsom succinylation, malonylation og glutarylation, menes at regulere stofskiftet, celle signalering og andre cellulære processer1,2,3,4 , og har konsekvenser i stofskiftesygdomme5. Talrige undersøgelser har fundet at lysin acyl ændringer undergå store fold-ændringer under forskellige betingelser i mammale væv og celler linjer5,6,7,8 samt bakterier9,10,11, men disse relative fold ændringer ikke giver indsigt i andelen af det samlede proteinindhold ændres. Undersøgelser rapportering målinger af acylation site belægning er knappe12,13,14, trods relevansen og behov for sådanne undersøgelser, da de giver mere detaljeret end relative fold ændre. For eksempel, kunne en 10-fold ændring repræsentere et websted belægning stigning fra 0,01 til 0,1%, 1 til 10% eller endda 10 til 100%. Præcise støkiometrisk målinger er forpligtet til at fortolke biologisk betydning af acylation og forudsige konsekvenser med hensyn til omfanget af protein strukturelle, og eventuelt, funktionelle ændringer.
En tidligere metode til at kvantificere site belægning udnytter tunge stabil-isotop kemiske mærkning af umodificerede lysin restkoncentrationer efterfulgt af massespektrometri til at måle forholdet mellem endogene "lys" acetylation i forhold til det eksogene, kemisk mærket "tunge" acetyl-lysin bruge forløber ion intensiteter12. En anden nylig undersøgelse af Zhou mfl. 13 beskrevet en lignende tilgang til at vurdere lysin acetylation støkiometrisk, der også ansat en komplet kemiske acetylation af alle umodificeret lysin reststoffer i proteiner med stabil isotop mærkning, men anvendes fragment ionintensiteter som målt ved DDA. Nakayasu mfl. 14 brugt en lignende DDA tilgang, men i stedet bruges forholdet mellem lette og tunge acetyl-lysin immonium ioner til kvantificering. Kvantificering baseret på fragmentioner, immonium eller sekvens ioner (MS2), i de fleste tilfælde resulterer i mindre signal interferens i forhold til forarbejdning intakt peptid forløber ioner (MS1). Dog kan kvantificering af fragmentioner fra DDA-genereret MS/MS-spektre lider af stokastiske prøveudtagning mangler, hvor høj-overflod forløber ioner er mere tilbøjelige til at vælges til MS/MS og således føre til en forudindtagede og ufuldstændige prøveudtagning af forløber ioner.
Denne roman arbejdsproces4 (figur 1) bruger begrebsmæssigt en stabil isotop kemiske mærkning tilgang oprindeligt udviklet af Baeza mfl. 12, men arbejdsprocessen er efterfølgende kombineret med DIA at indsamle begge forløber og flere fragment ion mængder over påviselige massen spænder15,16 giver præcise støkiometrisk beregninger.
Toparealer fra fragment ioner, der indeholder acylation site af interesse, eller 'skelne fragmentioner', der bruges til at kvantificere acylation site belægning (figur 2). Fragmentioner, der ikke indeholder modifikation har identiske lette og tunge m/z-værdier, og der bruges for peptid identifikation, men ikke for kvantificering. Skyline software17 bruges til at udtrække forløber og fragment toparealer. Tilstedeværelsen af flere fragmentioner indeholdende en given acylation websted giver fleksibilitet, hvis interferenser er fundet i nogle af fragmentioner. Datavisualisering i Skyline giver mulighed for kritisk eftersyn af lys-til-tunge fragment ion nøgletal. Ud over manuel dataanalyse, blev en open source R pakke skrevet in-house, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), udviklet, som bruger den forløber ion og fragment ion data indsamlet gennem DIA og kvantificerer lokationsspecifikke acylation støkiometrisk fra peptider der indeholder flere lysin rester, en funktion ikke muligt med forløber kun ion-intensitet målinger4.
Denne protokol viser også brugen af endoproteinase Glu-C, som er specifikke for C-terminale kavalergang på glutaminsyre og aspartinsyre restkoncentrationer, i stedet for at bruge trypsin eller Arg-C protease, som sidstnævnte ofte generere meget stor og potentielt formere acylated proteolytiske peptider som følge af blokerede trypsin kavalergang på acylated lysin restkoncentrationer. Den kemiske mærkning procedure blev også udvidet til at omfatte brugen af ravsyre anhydrid (figur 1), hvorved kvantificering af succinylation støkiometrisk succinylation. Ud over forbedringer til forberedelsen, gennemførelsen af peptid fraktionering af offline, grundlæggende pH, faldt omvendt-fase (bRP) adskillelse af peptider yderligere kvantificering interferenser, giver bedre nedtrapning foldning af acylation støkiometrisk i hele proteomet prøver. Sammen, denne metode har og fremhæver flere fordele: (1) øget effektivitet af kemiske acylation; (2) måling af protein succinylation støkiometrisk ud over acetylation; og (3) forbedret kvantificering nøjagtighed. Den forbedrede kvantificering skyldes nedsat interferenser i fragment ion signaler fra DIA sammenlignet med DDA forløber signal, samt gennemførelsen af off-line peptid pre fraktionering af bRP.
Protocol
1. kvantitativt Acetylate og/eller Succinylate proteiner ved hjælp af isotop-mærket eddikesyre eller ravsyre eddikesyreanhydrid
- Forbered 3 replikater af 100 µg bovint serumalbumin (BSA) protein prøve parallelt i en koncentration på 1 µg/µL (alt 100 µL), ved hjælp af urinstof og triethylammonium bikarbonat (TEAB) løsning (8 M urinstof, 200 mM TEAB, pH 8).
Bemærk: Det er vigtigt at bruge Amin-fri buffer. Protein prøver bruges her i afsnittet repræsentative resultater er BSA, kvantitativt succinylated BSA, og blandinger heraf giver BSA prøver med defineret succinylation belægning på 0%, 1%, 10%, 50% og 100%, henholdsvis (hver prøve skal forberedes i 3 replikater). Denne protokol har også udført ved hjælp af protein lysates fra Escherichia coli og mus lever4. Protokollen kan også anvendes til andre celler eller væv lysates. - Reducere 100 µL af BSA prøve (100 µg) med 8 µL af 250 mM dithiothreitol (DTT) at nå frem til en endelig koncentration på 20 mM DTT og inkuberes prøve ved 37 ° C i 30 min med agitation ved 1.400 omdrejninger.
- Alkylatbenzin reduceret BSA prøven med 21,6 µL af 200 mM iodoacetamide til at nå frem til en endelig koncentration på 40 mM iodoacetamide og inkuberes prøven i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
Bemærk: Det er vigtigt for at have iodoacetamide fusionens lidt mere end 2 x af DTT koncentration til at sikre, at alle reduceret protein dithioler er alkylerede. -
Fortsætte med at forberede enten eddikesyre anhydrid -d6 (trin 1.4.1) eller ravsyre anhydrid -d4 (trin 1.4.2) behov for kemiske (kvantitative) acetylation eller succinylation af prøverne.
- Bestemme molariteten (M) for 1 g alikvot af vandige eddikesyre anhydrid -d6 løsning fra molekylvægt (108.13 g/mol) og massefylde (1.143 g/mL ved 25 ° C).
Bemærk: 1 g pakke indeholder 9,248 µmol eddikesyre anhydrid -d6 i 875 µL volumen, giver en 10,57 M oploesning medgaaet til per-acetylation af prøverne. - Forbered en 5 M opløsning af ravsyre anhydrid -d4 ved at opløse pulveret i vandfri DMSO umiddelbart før reaktionen at undgå hydrolyse af reagenset. Opløse 0,24 g af ravsyre anhydrid -d4 i 461 µL af vandfri DMSO at opnå en 5 M løsning.
- Bestemme molariteten (M) for 1 g alikvot af vandige eddikesyre anhydrid -d6 løsning fra molekylvægt (108.13 g/mol) og massefylde (1.143 g/mL ved 25 ° C).
- Udføre kvantitative kemiske acetylation eller succinylation ved at tilføje 60 µmol eddikesyre anhydrid -d6 (6 µL af opløsningen 10,57 M) eller ravsyre anhydrid -d4 (12 µL af 5 M-opløsning) henholdsvis, og Inkuber den prøven ved 4 ° C i 20 min. på en vortex-mixer.
Bemærk: På grund af surhedsgraden af anhydrider, proteiner kan udfældes. Tage til efterretning og justere som beskrevet i trin 1,6. - Tilsæt 10 µL 7.25 M NaOH efter inkubation at øge pH ~ 8 at eliminere enhver O-acylation side-produkter. Vortex kort og check prøven pH af spotting 1 µL på pH papir.
Bemærk: Det kan være nødvendigt at tilføje mere end 10 µL af 7.25 M NaOH til pH 8. Derudover bør potentielt bundfaldne proteiner re opløses. - Gentag pr. acylation og pH justering-trin 1,5 og 1,6 for i alt tre gange. Tjek pH-værdier og Bemærk mængden af grundlæggende løsning tilføjet pr. gentagelse. Arbejde hurtigt under ovenstående kemiske acylation skridt fordi anhydrider vil hydrolyserer og miste reaktivitet.
- Efter den endelige mærkning reaktion og pH justering, tilsæt 10 µL af 50% hydroxylamin løsning hen til hjemfalde til O-acylation side reaktioner.
2. Digest reagerede Protein prøver ved hjælp af Glu-C Endoproteinase
- Fortynd urea-koncentration til 0,8 M benytter 50 mM TEAB, pH 8 og normalisere prøve diskenheder.
- Fordøje protein prøver ved at tilføje endoproteinase Glu-C på en 1:50 protease til substrat protein forholdet (w/w) og inkuberes prøver natten over ved 37 ° C med agitation ved 1.400 omdrejninger.
- Surt og slukke protein fordøjelse prøver ved at tilføje myresyre til 1% af volumen.
-
Desalt prøver ved hjælp af hydrofile-lipofile balance fast-fase udvinding patroner. Bruge en 30 mg sorptionsmiddel patron pr. sample, højst 5 mg materiale pr. patron4,18.
Bemærk: Det er vigtigt at holde den sorptionsmiddel i patronen våd i hele denne udvanding proces. Når det er nødvendigt, slukke vakuumpumpe til langsommere passage af opløsningsmiddel eller prøve gennem patronen.- Indsæt tonerpatron(er) i havne på 24-port glas block vakuum manifold og tænde vakuumpumpen. Forlade ubrugte porte udjævnet. Forlade en eller to porte un-udjævnede at opretholde lavere tryk på vakuum måleren, hvis nødvendigt.
- Våd hver patron to gange med 800 µL 80% acetonitril (ACN)/0.2% myresyre acid/19.8% vand. Sikre opløsningsmiddel niveau forbliver 2 – 3 mm over den sorptionsmiddel niveau. Sikre vakuum sporvidde på mangfoldighedens læser 16,9 – 67,7 kPa (5-20 i Hg).
- Reagensglasset hver patron tre gange med 800 µL af 0,2% myresyre i vand. Sikre vakuum sporvidde på mangfoldighedens læser 16,9 – 67,7 kPa (5-20 i Hg).
- Indlæse peptid prøver på patronen. Sikre vakuum sporvidde på mangfoldighedens læser 6,77 – 8.47 kPa (2 – 2.5 i Hg), og strømningshastigheden ikke overstige 1 mL/min.
- Vask hver patron tre gange med 800 µL 0,2% myresyre i vand. Sikre vakuum sporvidde på mangfoldighedens læser 16,9 – 67,7 kPa (5-20 i Hg).
- Fjern blækpatronen fra vakuum manifold og bosætter sig i en 1,5 mL microtube.
- Elueres peptider én gang med 800 µL 80% ACN/0.2% myresyre acid/19.8% vand og tillade opløsningsmiddel til inkuberes med sorptionsmiddel for 2-3 min.
- Bruge en pipette til push solvent gennem det sorptionsmiddel lag i patronen. Gentag for den anden eluering af 400 µL 80% ACN/0.2% myresyre acid/19.8% vand ind i den samme 1,5 mL microtube.
- Tørre eluatet ved vakuum centrifugering (fast centrifugering sats på 268 x g), typisk for 3 h.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, tørrede eluatet prøver kan opbevares frosset ved-20 ° C indtil klar til at gå videre med fraktionering.
3. fractionate peptider ved hjælp af Offline Basic-pH med omvendt fase HPLC
- Genopslæmmes per-acylated og Glu-C fordøjet prøver (forberedt som beskrevet i afsnit 1 og 2) i 200 µL af Buffer A (10 mM ammonium formate i vand, pH 10), bland prøven i 10 min på en vortex mixer ved 4 ° C og centrifugeres ved 17.500 x g i 10 min. ved stuetemperatur te fugtighedsgrader.
Bemærk: Den resulterende peptid prøven er klar til at være offline fraktioneret af høj pH adskillelse19,20. - Programmere den offline HPLC fraktionering metode instrument og software, der anvendes. Følgende metode er specifikke for en binær HPLC pumpesystem, herunder en dobbelt bølgelængde UV detektor, en autosampler, en brøkdel collector og en C18 kolonne (4,6 mm x 250 mm, 5 µm partikelstørrelse), som tolererer pH 10.
- Indsamle 40 fraktioner i 2.1 min. pr. fraktion og kombinere hver fjerde brøkdel, hvilket resulterer i fire endelige poolede fraktioner4. Et større antal poolede fraktioner kan bruges til yderligere at reducere prøve kompleksitet på bekostning af massespektrometri data afhentningstidspunkt.
- Tør de poolede fraktioner i en lyophilizer, genopslæmmes tørrede peptid prøver i 1 mL 50% ACN og 1% myresyre i vand og overføres til en mindre prøvebeholder. Tør den overførte prøve via vakuum centrifugering (fast centrifugering sats på 268 x g), typisk i 1 h.
Bemærk: Lavt damptryk af ammonium formate kan vanskeliggøre komplet tørring. Hvis betydelige mængder ammonium formate salt som salt bundfald efter tørring, gentage den faste fase udvinding. - Genopslæmmes prøverne i 20 µL af 0,2% myresyre i vand med indekserede opbevaring tid (iRT) peptid standard blanding.
Bemærk: Prøver er nu klar til analyse af massespektrometri.
4. DIA analyse af fraktionerede peptid prøver
-
Analysere prøverne ved hjælp af en DIA LC-MS/MS metode, som kan reguleres efter de massespektrometriske instrumenter til rådighed. Analysen blev udført ved brug af en nano-LC 2D HPLC system online tilsluttet en ortogonale Quadrupol time of flight (QqTOF) massespektrometer.
- Programmere instrument software, således at peptid blandinger er overføres til en C18 pre kolonne chip (200 µm x 6 mm C18-CL chip, 3 µm, 300 Å) og vask 2 µL/min. i 10 min. med lastning af opløsningsmiddel (H2O/0.1% myresyre) til udblødning.
- Adskille peptider gaskromatografisk på et 75 µm x 15 cm C18-CL chip (3 µm, 300 Å) med en væskehastighed på 300 nL/min med en 2 h gradient bruger typisk (og LC-system specifikke) vandig og ACN opløsningsmiddel buffere4.
- Generere en variabel vinduet DIA metode, hvor masseinterval vinduerne i variabel bredde (5 til 90 m/z) er gået fra Q1 Quadrupol i cellen kollision i trinvis skridt over den fulde masseinterval (m/z 400-1250).
Bemærk: Procestid for 3.2 s omfatter en 250 ms forløber ion scanning efterfulgt af 45 ms akkumulering tid for hver af de 64 SKÅR segmenter21,22.
- Identificere peptider ved hjælp af en sideløbende analyse af prøverne af DDA MS og bygning af spektrale biblioteker, eller alternativt, peptider kan identificeres direkte fra DIA data ved hjælp af PIQED software23, som håndterer alle tekniske foranstaltninger for behandling af personoplysninger, identifikation, og importere til Skyline for efterfølgende kvantificering.
5. eksempel Data analyser Tutorial
-
Download Skyline software (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) og oprette en PanoramaWeb konto (https://panoramaweb.org).
Bemærk: For detaljeret tutorials der beskriver brugen af Skyline med data, se venligst (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Andre Softwarealgoritmer kan bruges i stedet til at udtrække lette og tunge fragment ion toparealer fra DIA erhvervelser, som åbent SKÅR24, SKÅR 2.0 plugin i PeakView25, og Spectronaut26.- Hent filen Skyline data for succinylated BSA repræsentative resultater (figur 3) fra Panorama offentlige: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Gå til tabellen "Målrettet MS kører" på websiden Panorama, og downloade filen sky.zip vælge DOWNLOAD-linket i højre side. Uddrag den downloadede .zip mappe og dobbeltklik på filen skyline.sky for at åbne det i Skyline. Kontrollere peptid fragment ion target træ (venstre panel) og de fire kromatogrammer fra definerede procenter af lys succinylation (højre paneler).
- Vælg "Vis"-menuen, gå til "Peak områder | Replikere sammenligning". Panelet "Peak områder – replikere sammenligning" indeholdende søjlediagrammer vises på højre side af vinduet. I panelet toparealer Højreklik og vælg "overgange | Single", som viser fragment ion topareal for det valgte fragment ion. Endelig, højreklikke i panelet "Toparealer" og vælg "ordre | Dokument".
- I målet tree panel i venstre side af vinduet, Højreklik på peptid "E.LCKVASLRE. T | Nøgletal til | Oneheavy", som beregner forholdet mellem lys ion signal over tunge ion signal, lys/tunge.
Bemærk: Dette er ikke det samme som site belægning Støkiometrisk forhold af Light/(Heavy+Light). - Bemærk, at træet mål nu rapporterer nøgletal L/H til højre for de lette fragmentioner.
-
Bestemme de "differentiering fragmentioner", der indeholder acylation site af interesse.
Bemærk: Som vist i figur 3, byder denne nøjagtige eksempel, de differentiering ioner blev fastsat som y7 (højest rangeret), y8, b3og b4. Bemærk at fragmentioner ikke skelne viser et forhold på 1 i træet mål.- I venstre panel mål træet under 588.30 ++ sub node af peptid E.LCKVASLRE. T, klik på y7 differentiere fragment ion
K [y7 ]-902.49 + (rank1) [5]
Bemærke den stigende tophøjde og område. - I venstre panel mål træet under 588.30 ++ sub node af peptid E.LCKVASLRE. T, klik på y5 ikke skelne fragment ion en [y5 ]-575.31 + (rank 6) [1]. Observere, at y5 fragment ion kromatogrammer og toparealer fortsat i samme størrelsesorden for alle prøver.
- I panelet target træ gennemgå andre differentiere (ratio end 1) og ikke-differentiering (forhold 1) fragment ioner og lægge mærke til ændringer og mønstre i topareal bar graf og kromatogrammer.
- Bestemme de nøjagtige toparealer for de lette og tunge par af de differentiering ioner for at beregne støkiometrisk (for yderligere oplysninger se også Meyer et al. 4). Klik på den "Se | Dokumentgitter"og dokumentlinjenet vil poppe op. I øverste venstre dokumentlinjenet, klik på "visninger | Overgang resultater"Se en multi-kolonne tabel med fragment ion oplysninger, såsom peptid sekvens, forløber mz, replikere navn, osv.
- Ændre rapportformatet til "pivot" ved igen at klikke på "Visninger" i dokumentgitteret og vælge "Rediger Se" Sådan åbnes vinduet Tilpas visning. Nederst til venstre i vinduet "Tilpas visning", check "Pivot replikere navn" og vælg "Ok" for at lukke vinduet Tilpas visning. Observere at nu vinduet "Dokument gitter: overgangen resultater" tabel har re-arrangeret at gruppere replikere navn, retentionstid, området, baggrund, Peak rang kolonner ved replikere (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
- For peptid "E.LCKVASLRE. T"i tabellen"Dokument gitter: overgangen resultat"finde kolonnen"Forløber Mz", kolonnen"Fragment Ion"og kolonnen 1pct_light_sw1 område (1% succinylation). Observere, at der er to forløber ioner til dette peptid, lys (forløber Mz af 588.30 i de første 8 rækker) og tunge (forløber Mz af 590.32 i de sidste 8 rækker).
- I kolonnen "Fragment Ion" finde de to rækker for y8 fragment ion svarende til lys og tunge forløber ioner. Fra de samme rækker i kolonnen 1pct_light_sw1 området, optage y8 områder for lys (15,820), og tungt (1,426,461).
- I venstre panel mål træet under 588.30 ++ sub node af peptid E.LCKVASLRE. T, klik på y7 differentiere fragment ion
- Ved hjælp af disse peak området værdier, beregne succinylation støkiometrisk, eller andelen ændret efter nedenstående formel og opnå et Støkiometrisk forhold på 0,01 eller 1% succinylation, hvilket svarer til andelen af lys succinylation i dette defineret blanding:
- Beregne Støkiometrisk forhold til 10% succinylation ved hjælp af y8 differentiering fragment ion peak området værdier fra kolonnen 10pct_light_sw1 området, 144,953 (lys) og 1,188,041 (tung), at få et forhold på 0,10 eller 10% succinylation.
- Beregne Støkiometrisk forhold til 100% succinylation ved hjælp af y8 differentiering fragment ion peak området værdier fra kolonnen 100pct_light_sw1 området, 954,513 (lys) og 16,407 (tung), at få et forhold på 0,98 eller 98% succinylation.
- Ligeledes beregne støkiometrisk forholdet til 1% succinylation ved hjælp af b3 differentiering fragment ion peak området værdier fra kolonnen 1pct_light_sw1 området, 55,697 (lys) og 3,149,119 (tung), at få et forhold på 0,01 eller 1% succinylation.
- Fortsætte Støkiometrisk forhold beregninger ved hjælp af formlen for alle differentiering fragmentioner, y og b ioner, at få lysin succinylation støkiometrisk værdier til 1, 10, 50 og 100% succinylation blandinger.
Representative Results
Efter dataopsamling, differentiering MS2 fragmentioner blev bestemt ud fra proteolytiske acylated peptider, efterfølgende udpakkede ion kromatogrammer (XIC) blev behandlet i Skyline, og tilsvarende lys og tunge toparealer blev eksporteret som var Endelig bruges til at beregne site belægning. Figur 2A viser en konceptuel illustration af hvordan forløber-ion XIC kan vises byder både lette og tunge peptid signaler, og figur 2B præsenterer et eksempel på den tilsvarende fragment ion XICs med farvekoder (rød = lys, blå = heavy ) til skelne fragmentioner der indeholder lysin acylation ændringer.
Figur 3 viser data fra en belægningsprocent eksperiment, som beskrevet ovenfor analysere foruddefinerede nøgletal af lys/tunge succinylated BSA genereres internt på 1, 10, 50, eller 100% og bestemmelse af succinylation belægning heraf. Importere DIA belægning data til Skyline muliggør nem visualisering af target træet, visning af peptid sekvenser og fragmentioner både for lette og tunge forløber ioner (figur 3A). Data fra DIA-MS af hver definerede succinylated BSA ratio viste immanently de relative forskelle i forholdet mellem lys-til-tung y7 ion, den højest rangerede differentiering fragment ion fra identificerede peptid-spektre match (angivet med rødt, Figur 3B). Figur 4 viser en oversigt over de forarbejdede resultater fra beregningen MS2 belægning, som bekræftet af succinylation procenter belægning af input protein, her bestående af pre-succinylated BSA. Målte lysin succinylation belægning for 20 proteolytisk succinylated peptider fra kommercielle pre-succinylated BSA, succinylated på definerede procentdele (f.eks.på 0, 1, 10, 50 og 100%) er vist i tabel 2. For hver af de 20 proteolytiske BSA peptider, den højeste rangeret, differentiere MS2 fragment ion blev brugt til at beregne lysin succinylation (Ksucc) belægning, som L/(L+H) i %. Samlet set MS2-baserede kvantificering viste meget god nøjagtighed ved fastsættelsen af acylation belægning selv ved lav stoichiometries.
Figur 1: støkiometrisk arbejdsproces. (A) proteiner er udruget tre gange med eddikesyre anhydrid -d6 til acetylate uforandret lysin restkoncentrationer. Næste, acetyleret proteiner er fordøjet med endoproteinase Glu-C, efterfulgt af HPLC fraktionering af proteolytiske peptider ved hjælp af basic-pH omvendt-fase væskekromatografi. Endelig, peptider er analyseret af LC-MS bruger DIA med variabel forløber vindue bredder. (B) den samme arbejdsproces bruges til at bestemme succinylation støkiometrisk som beskrevet i (A), bortset fra tunge acylation reagens er ændret til ravsyre anhydrid -d4. Figur tilpasset fra Meyer mfl. 4 (J. ændr. Soc. Mass Spectrom., åbne valg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel på mulige data indhentet og støkiometrisk beregninger. (A) lys (L) og tunge (H) MS1 forløber ioner indeholdende en acetyleret lysin afvige 3 masse enheder. XICs genereres til både lette og tunge isotopiske konvolutter angivet i rød og blå, henholdsvis. (B) kvantificering fra MS2 fragment ion XICs fra DIA opkøb kan udføres ved hjælp af 'differentiere' lette og tunge fragmentioner, der indeholder webstedet acetylation angivet i rød og blå. Fælles fragmentioner vises i prikket sort og indeholder ikke webstedet for ændring. Figur tilpasset fra Meyer mfl. 4 (J. ændr. Soc. Mass Spectrom., åbne valg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skyline visualisering af succinylated proteolytiske BSA peptid på forskellige belægning niveauer. (A) Skyline Target træet viser de proteolytiske peptid LCKsuccVASLRE og dets deraf følgende fragment ioner. (B) Skyline udvundet fragment ion kromatogrammer på varierende niveauer af succinylation belægning. Den højeste rangeret differentiering ion, y7, øger i topareal 1, 10, 50 og 100% korrelerede til input procentdelen af pre-succinylated BSA (genereres internt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: vurdering af BSA acylation støkiometrisk af pre-succinylated BSA. Fem forskellige BSA prøver på definerede procenter af tunge modifikation (fx., 0, 1, 10, 50 og 100%) blev udsat for MS2 belægning bestemmelse. Site belægning for 20 succinylated BSA peptider blev bestemt ud fra de højeste rangeret differentiering fragmentioner for fem forskellige BSA prøver på definerede procenter af lys ændring (f.eks.på 0, 1, 10, 50 og 100%). Boks bakkenbart plot viser fordelingen af de 20 succinyl peptider, værdier fra 50% af peptider er i 'boksen' (25% percentil til 75% percentil), den øverste bakkenbart viser værdier fra 75% percentil til maksimum (100%), og den lavere bakkenbart viser værdier fra 25% percentil til minimum (0% percentil). (J. ændr. Soc. Mass Spectrom., åbne valg). Kvantificering af målinger kan findes i tabel 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tid (minutter) | % A | % B |
| 0,00 | 100 | 0 |
| 7.27 | 92 | 8 |
| 45,27 | 73 | 27 |
| 49.27 | 69 | 31 |
| 65.27 | 61 | 39 |
| 72.27 | 40 | 60 |
| 80,00 | 10 | 90 |
| 85,00 | 10 | 90 |
| 86,00 | 100 | 0 |
| 120,00 | 100 | 0 |
| Strømningshastigheden: 0,7 mL/min | ||
| Buffer A: 10 mM ammonium formate i vand, pH 10 | ||
| Buffer B: 10 mM ammonium formate i 90% ACN og 10% vand, pH 10 | ||
| Bemærk: Begge mobile faser pH justeret til 10 med pæn ammoniak | ||
Tabel 1: Gradient til offline basic-pH omvendt fase HPLC fraktionering. Gradient længde: 120 min. Buffer A: 10 mM ammonium formate i vand, pH 10. Buffer B: 10 mM ammonium formate i 90% ACN og 10% vand, pH 10.
| L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % |
| Ksucc 0% | Ksucc 1% | Ksucc 10% | Ksucc 50% | Ksucc 100% |
| 0,2 | 1.7 | 11.1 | 50,9 | 99,2 |
| 1.2 | 2.3 | 12.3 | 49,4 | 97,6 |
| 2.9 | 3.8 | 14 | 48,6 | 99,5 |
| 0,5 | 1.8 | 11.7 | 50,8 | 99,5 |
| 0,2 | 1.7 | 11.1 | 48.3 | 98,2 |
| 0,2 | 1.2 | 11 | 47,5 | 96.1 |
| 0,3 | 1,6 | 12.8 | 51 | 99,2 |
| 3.7 | 5.2 | 14,7 | 51,9 | 89,5 |
| 1.5 | 1.8 | 12.5 | 47.2 | 91.1 |
| 0,8 | 1.5 | 11.3 | 48.4 | 96,8 |
| 0,2 | 1,6 | 13,9 | 49,7 | 98.9 |
| 0,1 | 1.1 | 10.7 | 48.2 | 98,6 |
| 0,2 | 0,9 | 10.3 | 49,4 | 99,4 |
| 0,5 | 2.5 | 17,2 | 52,3 | 97,5 |
| 0,1 | 3.5 | 20,8 mio. | 51 | 99 |
| 0,3 | 1.9 | 10.7 | 49,6 | 98,2 |
| 2 | 1.7 | 10.9 | 47,7 | 96,3 |
| 0,3 | 1.2 | 10 | 53 | 98 |
| 1.1 | 1.8 | 12,9 | 57,9 | 94,1 |
| 0,2 | 1.4 | 11.6 | 48,6 | 98,8 |
Tabel 2: kvantificering af målte BSA lysin succinylation belægning for 20 proteolytisk succinylated peptider. Succinylated peptider fra kommercielle pre-succinylated BSA, succinylated på definerede procentdele (f.eks.på 0, 1, 10, 50 og 100%). For hver af de 20 proteolytiske BSA peptider, den højeste rangeret, differentiere MS2 fragment ion blev brugt til at beregne lysin succinylation (Ksucc) belægning, som L/(L+H) i %.
Discussion
Denne protokol giver en roman og præcis metode til at kvantificere lokationsspecifikke lysin acetylation og succinylation belægning, der kan anvendes på en hel proteomet. Denne metode bygger på måling af endogene lys peptider og eksogen tunge peptider, hvor sidstnævnte er genereret i vitro ved hjælp af kvantitative kemiske acylation af proteiner med deutereret eddikesyre anhydrid -d6 eller ravsyre anhydrid -d4 (figur 1). Lignende metoder har brugt stabil isotopiske mærkning af indfødte umodificeret lysin restkoncentrationer og udført site belægning kvantificering baseret på enten forløber ion-kun12 eller fragment ioner fra DDA erhvervelser13,14. Denne protokol gælder flere trin i forberedelsen til at forbedre acylation effektivitet og udvider den kemiske mærkning til succinylation. Indsamling af data ved hjælp af DIA erhvervelser opnår både forløber ion og MS2 fragment ionintensiteter over den hele påviselige masseinterval, hvorved fragment ion interferenser. Analyse og kvantificering via Skyline og brugerdefinerede scripts udviklet in-house tillade site belægning beregning for peptider der indeholder mere end én lysin rester og mere end én acylation på én lokation.
Der er flere kritiske trin under prøven forberedelsen af denne protokol, der bør følges nøje. Da den hele protokol er afhængig af effektiv kemisk modifikation af alle lysin rester, er dette trin af allerstørste betydning. Anhydrider reagere med frie aminer, så Amin-holdige buffer eller forurenende molekyler i protein lysate skal undgås. Også under trinnet kemiske pr. acylation sikre, at pH-værdien af reaktionsblandingen er justeret tilbage til pH 8 efter hver af de tre inkubationer med eddikesyreanhydrid reagens, som denne reaktion forsurer blandingen, og O-acylation side-reaktioner kan danne. Derudover er fortynding af 8 M urinstof-holdige reaktionsblandingen til omkring 0,8 M urinstof forud for fordøjelsen og kontrol, at pH er inden for det optimale interval vigtige for optimal aktiviteten af endoproteinase Glu-C. Et andet centralt element i vores protokol er data indsamling trin og indførelsen af en DIA arbejdsproces, som overvinder uoverensstemmelser DDA data prøveudtagning og som giver mulighed for kvantificering på MS2 fragment ion plan. En største fordel ved metoden DIA er faldet af interferenser, der typisk er meget mere tilbøjelige og problematisk når kvantificere MS1 forløber ion signal (som nogle af de tidligere publikationer har foreslået).
Flere ændringer til arbejdsprocessen kan foretages, når meget komplekse prøver. Antallet af fraktioner samles efter offline basic-pH omvendt fase HPLC fraktionering kan nedskrives til lavere kompleksitet i de poolede prøver, der vil blive erhvervet af LC/MS. desuden længere kromatografisk forløb kan også bruges under erhvervelse at give mulighed for bedre peptid adskillelse. Alternativt kan flere proteaser bruges hen til udtog prøver for at producere et større udvalg af kløvet peptider og øge dækningen af protein lysin rester. Forsøget løber og optimering kan foretages ved hjælp af kommercielle BSA indeholdende specifikke procenter af acetylation eller succinylation.
En begrænsning i denne protokol er potentielt svag site belægning overvurdering skyldes forsvundet andre lysin ændringer, såsom methylering eller ubiquitination, etc., på det samme websted4. Beregnes ud fra toparealer for lette og tunge acyl ændringer, L/(L+H), er websted belægning baseret på den antagelse, at det samlede niveau af modifikation på en lysin site består af kun endogene 'lys' acylation (L) og kemisk mærket 'tunge' acylation (H). Men den faktiske samlede acylation belægning på et websted i vivo kan omfatte andre ændringer end acetylation og/eller succinylation. Desuden rapporterede isotopiske renheden af indkøbte reagenser eddikesyre anhydrid -d6 (99%) og ravsyre anhydrid -d4 (> 98%) kan bidrage til en lille overvurdering af op til 2% (succinyl) eller 1% (acetyl) af den endogene acylation niveau4. Sammen, disse lille overestimations tilføje at er vanskeligheden at kvantificere websteder med mindre end 1% belægning. Stor overflod forskelle mellem den komplette kemisk acylated peptider og indfødte acylated peptider også bidrage til potentielle site belægning kvantificering fejl, især for lav endogen acylated peptider27. En nylig undersøgelse af Weinert mfl. 27 fundet, at nedsat overflod forskelle mellem færdig pr. acetyleret peptider kan reducere kvantificering fejl27.
Støkiometrisk kvantificeringer indsamlet ved hjælp af denne protokol kan lokalisere vigtige acylation hotspots i et bestemt protein og form hypoteser for biologiske Opfølgning eksperimenter, som site-directed mutagenese af visse steder af interesse. Denne protokol kan også afsløre kombinerede effekter af lav acylation støkiometrisk sites, der kunne udøve indirekte eller subtile påvirkninger på protein strukturelle stabilitet og lokaliseret cellulære miljøer. Derudover ville gennemførelsen af denne protokol til at måle acetylation og succinylation og andre mulige lysin acylation ændringer ud over acetylation unikt give indsigt i de dynamiske acylation virkninger på proteiner under forskellige biologiske forhold.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme NIH-NIDDK give R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM blev støttet af en NIH T32 fellowship (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Forfatterne anerkender støtte fra NIH delt instrumentation grant for TripleTOF 6600 system på instituttets Buck (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
| succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
| sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
| Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
| HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
| HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
| urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
| triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
| anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
| 50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
| LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
| LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
| Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
| Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
| Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
| Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
| Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
| indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
| SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
| Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |
References
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325 (5942), 834-840 (2009).
- Meyer, J. G., et al. Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH). J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).
- Hirschey, M. D., Zhao, Y. Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).
- Wagner, G. R., Payne, R. M. Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix. J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).
- Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).
- Zhang, J., et al. Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli. Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).
- Kuhn, M. L., et al. kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation. PLoS One. 9 (4), e94816 (2014).
- Baeza, J., et al. Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome. J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).
- Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells. J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).
- Nakayasu, E. S., et al. A method to determine lysine acetylation stoichiometries. Int J Proteomics. 2014, 730725 (2014).
- Rardin, M. J., et al. MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).
- Svinkina, T., et al. Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Schilling, B., et al. Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli. Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers. Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., et al. PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data. Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).
- Rost, H. L., et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data. Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).
- Lambert, J. P., et al. Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition. Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).
- Bruderer, R., et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).
- Weinert, B. T., et al. Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).
