Summary
Här presenterar vi objektiv kvantifiering av platsspecifika protein acetylering eller succinylation beläggning (stökiometri) av en hela proteomet genom en proportionerlig analys av endogena ändringar ändringar som införts efter kvantitativa kemiska acylation med stabil isotop-märkt anhydrider. I kombination med känsliga data-oberoende förvärv masspektrometri erhålls korrekt webbplats beläggning mätningar.
Abstract
Posttranslationella modifieringen (PTM) av protein lysin rester av NƐ- acylation inducerar strukturella förändringar som kan dynamiskt reglerar protein funktioner, till exempel genom att ändra enzymatisk aktivitet eller genom att medla interaktioner. Exakt kvantifiering av platsspecifika protein acylation beläggning eller stökiometri, är viktigt för att förstå de funktionella konsekvenserna av både globala lågaktivt stökiometri och enskilda high-level acylation stökiometri av specifika lysin rester. Andra grupper har rapporterat mätning av lysin acetylering stökiometri genom att jämföra förhållandet mellan peptid föregångare isotoperna från kroppsegna, naturliga överflöd acylation och exogena, tunga isotop-märkt acylation infördes efter kvantitativa kemiska acetylering av proteiner med stabil isotop-märkt ättiksyraanhydrid. Det här protokollet beskriver en optimerad strategi med flera förbättringar, inklusive: (1) ökad kemisk acylation effektivitet, (2) förmågan att mäta protein succinylation förutom acetylering, och (3) förbättrad kvantitativ noggrannhet beror på reducerade störningar med fragment ion kvantifiering från data-oberoende förvärv (DIA) i stället för föregångare ion signal från data-beroende förvärv (DDA). Användningen av extraherade peak områden från fragmentet joner för kvantifiering ger också unikt differentiering av webbplatsnivå acylation stökiometri från proteolytiska peptider som innehåller mer än en lysin rester, vilket inte är möjligt med hjälp av föregångare ion signaler för kvantifiering. Datavisualisering i Skyline, en öppen källkod Kvantitativ proteomik miljö, möjliggör bekväm uppgiftskontroll och granskning. Tillsammans, erbjuder detta arbetsflöde opartisk, exakt och korrekt kvantifiering av platsspecifika lysin acetylering och succinylation beläggning av en hela proteomet, vilket kan avslöja och prioritera biologiskt relevanta acylation platser.
Introduction
NƐ- acylation av protein lysin rester är en viktig regulator av proteinfunktion. Lysin acetylering och andra acylations, såsom succinylation, malonylation och glutarylation, tros reglera ämnesomsättning, cell signalering och andra cellulära processer1,2,3,4 , och få konsekvenser i metabola sjukdomar5. Många studier har funnit att lysin acyl ändringar genomgå stora vik-förändringar under olika förhållanden i däggdjur vävnader och cell linjer5,6,7,8 som bakterier9,10,11, dock dessa relativa fold förändringar inte ger insikter i hur stor andel av den totala protein modified. Studier rapportering mätningar av acylation webbplats beläggning är knappa12,13,14, trots betydelsen och behovet av sådana studier eftersom de ger mer detaljerat än relativa vik ändra. Till exempel kunde en 10-faldig förändring representera en webbplats beläggning ökning från 0,01 till 0,1%, 1 till 10% eller ens 10 till 100%. Exakta stökiometri mätningar krävs att tolka biologiska betydelsen av acylation och förutsäga påverkan angående omfattningen av protein strukturella, och möjligen, funktionella förändringar.
En tidigare metoden att kvantifiera webbplats beläggning utnyttjar tung stabil-isotope kemisk märkning av oförändrad lysin rester följt av masspektrometri att mäta förhållandet mellan endogena ”light” acetylering i jämförelse med den exogena, kemiskt-märkt ”tunga” acetyl-lysin använder föregångare ion stödnivåer12. En annan färsk studie av Zhou et al. 13 beskrivs ett liknande tillvägagångssätt för att bedöma lysin acetylering stökiometri som också sysselsatt en fullständig kemisk acetylering av alla omodifierade lysin restprodukter i proteiner med stabil isotop märkning, men används fragment ion stödnivåer mätt som DDA. Nakayasu et al. 14 används ett liknande DDA tillvägagångssätt, men i stället förhållandet mellan lätta och tunga acetyl-lysin immonium joner för kvantifiering. Rapporteringsgräns baserat på fragmentet joner, immonium eller sekvens joner (MS2), i de flesta fall resulterar i mindre signal störningar jämfört med bearbetning intakt peptid föregångare joner (MS1). Kvantifiering av fragmentet joner från DDA-genererade MS/MS spectra kan dock lider stokastiska provtagning brister, där hög-överflöd föregångare jonerna är mer benägna att väljas för MS/MS och således leda till en ensidig och ofullständig provtagning av föregångaren joner.
Denna roman arbetsflöde4 (figur 1) använder begreppsmässigt en stabil isotop kemisk märkning strategi som ursprungligen utvecklades av Baeza et al. 12, men arbetsflödet är därefter tillsammans med DIA att samla både föregångare och flera fragment ion sammansättning över detekterbara massan variera15,16 ger exakta stökiometri beräkningar.
Topp områden från fragment joner som innehåller webbplatsen acylation av intresse, eller 'skilja fragment joner', används för att kvantifiera acylation webbplats beläggning (figur 2). Fragmentet joner som inte innehåller ändringen har identiska lätta och tunga m/z-värden, och används för identifiering av peptid men inte för kvantifiering. Skyline software17 används för att extrahera föregångare och fragment peak områden. Förekomsten av flera fragment joner som innehåller en viss acylation webbplats ger flexibilitet om störningar upptäcks vissa fragment jonerna. Datavisualisering i Skyline möjliggör kritisk inspektion av ljus-till-heavy fragment ion nyckeltal. Förutom manuell dataanalys framkallades en öppen källkod R package skriftligt in-house, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), som använder föregångare ion och fragment ion data som samlas in via DIA och kvantifierar platsspecifika acylation stökiometri från peptider som innehåller flera lysin, en funktion som inte är möjligt med föregångaren endast ion-intensitet mätningar4.
Detta protokoll visar också användningen av endoproteinase Glu-C, som är specifik för C-terminal klyvning på glutaminsyra och asparaginsyra rester, istället för att använda trypsin eller Arg-C proteas, som den senare ofta generera mycket stora och potentiellt multiplicera acylated proteolytiska peptider följd blockeras trypsin klyvning på acylated lysin rester. Kemisk märkning förfarande var också utvidgas till att omfatta användning av succinic anhydride (figur 1), vilket möjliggör kvantifiering av succinylation stökiometri succinylation. Förutom förbättringar av provberedningen, genomförandet av peptid fraktionering av offline, grundläggande pH, minskade omvänd fas (bRP) separation av peptider ytterligare kvantifiering störningar, så att bättre koppla faltning av acylation stökiometri i hela proteomet prover. Tillsammans, denna metod har och belyser flera fördelar: (1) ökad effektivitet av kemiska acylation; (2) mätning av protein succinylation stökiometri förutom acetylering; och (3) förbättrad kvantifiering noggrannhet. Förbättrad kvantifieringen är på grund av minskade störningar i fragment ion signaler från DIA jämfört med DDA föregångare signal, samt genomförandet av off-line peptid före fraktionering av bRP.
Protocol
1. kvantitativt Acetylate eller Succinylate proteiner använda isotop-märkt ättiksyra eller Succinic Anhydride
- Förbered 3 replikat av 100 µg av bovint serumalbumin (BSA) protein prov parallellt, med en koncentration på 1 µg/µL (totalt 100 µL), använda urea och triethylammonium bikarbonat (TEAB) lösning (8 M urea, 200 mM TEAB, pH 8).
Obs: Det är viktigt att använda amine-fri buffert. De protein-prover som används här i avsnittet representativa resultat är BSA, kvantitativt BSA, succinylated och blandningar därav ger BSA prover med definierade succinylation beläggning på 0%, 1%, 10%, 50% och 100%, respektive (varje prov kommer att förberedas i 3 replikat). Detta protokoll har också utförts med protein lysates från Escherichia coli och mus lever4. Protokollet kan också tillämpas på andra cell eller vävnad lysates. - Minska 100 µL av BSA prov (100 µg) med 8 µL av 250 mM Ditiotreitol (DTT) att nå en slutlig koncentration på 20 mM DTT och inkubera provet vid 37 ° C i 30 min med agitation vid 1 400 rpm.
- Alkylatbensin reducerad BSA provet med 21,6 µL av 200 mM iodoacetamide att nå en slutlig koncentration av 40 mM iodoacetamide och inkubera provet mörkt vid rumstemperatur i 30 min.
Obs: Det är viktigt för att ha iodoacetamide koncentrationen något mer än 2 x av DTT koncentrationen att säkerställa att alla reduceras protein tioler är alkylerade. -
Fortsätt med förbereder antingen ättiksyra anhydrid -d6 (steg 1.4.1) eller succinic anhydride -d4 (steg 1.4.2) behövs för kemisk (kvantitativa) acetylering eller succinylation av proverna.
- Bestämma molariteten (M) av 1 g alikvoten av vattenhaltigt ättiksyra anhydrid -d6 lösning från molekylvikt (108.13 g/mol) och densitet (1.143 g/mL vid 25 ° C).
Obs: 1 g paketet innehåller 9,248 µmol av ättiksyra anhydrid -d6 875 µL volym, vilket ger en 10.57 M lösning används för per-acetylering av proverna. - Bered en 5 M succinic anhydride -d4 genom att lösa upp pulvret i vattenfri DMSO omedelbart före reaktionen att undvika hydrolys av reagens. Lös 0.24 g succinic anhydride -d4 i 461 µL av vattenfri DMSO att erhålla en 5 M lösning.
- Bestämma molariteten (M) av 1 g alikvoten av vattenhaltigt ättiksyra anhydrid -d6 lösning från molekylvikt (108.13 g/mol) och densitet (1.143 g/mL vid 25 ° C).
- Utföra kvantitativa kemiska acetylering eller succinylation genom att lägga till 60 µmol av ättiksyra anhydrid -d6 (6 µL 10.57 M lösning) eller succinic anhydride -d4 (12 µL 5 M lösning) respektive och inkubera i provet vid 4 ° C i 20 min på en vortex mixer.
Obs: På grund av surhetsgraden i anhydrider, proteiner kan utlösa. Notera och justera enligt steg 1,6. - Tillsätt 10 µL av 7,25 M NaOH efter inkubering att öka pH till ~ 8 att eliminera några O-acylation side-produkter. Vortex kort och kontrollera provets pH av tubkikare 1 µL på pH-papper.
Obs: Det kan vara nödvändigt att lägga till mer än 10 µL av 7,25 M NaOH till pH 8. Dessutom bör potentiellt utfällda proteiner åter lös. - Upprepa per-acylation och pH justering steg 1,5 och 1,6 för sammanlagt tre gånger. Kontrollera pH-värdena och notera volymen av grundläggande lösning tillsatts per repetition. Arbete snabbt under ovanstående kemiska acylation steg eftersom anhydrider kommer att hydrolysera och förlora reaktivitet.
- Efter slutlig märkning reaktion och pH-justering, tillsätt 10 µL av 50% hydroxylamin lösning att återgå O-acylation sidoreaktioner.
2. Digest reagerade Protein prover med Glu-C Endoproteinase
- Späd urea koncentrationen till 0,8 M med 50 mM TEAB, pH 8 och normalisera provmängder.
- Smälta protein proverna genom att lägga till endoproteinase Glu-C 1:50 proteas till substrat proteinkvot (w/w) och inkubera proverna över natten vid 37 ° C med agitation vid 1 400 rpm.
- Gör filtratet surt och släcka de protein matsmältning proverna genom att lägga till myrsyra till 1% av volymen.
-
Avsalta proverna med hydrofil-lipofila balans fasta fasen extraktion bläckpatroner. Använda en 30 mg sorbent patron per prov, max 5 mg material per patron4,18.
Obs: Det är viktigt att hålla sorbenten inuti kassetten våt under hela denna avsaltning process. Vid behov stänga av vakuumpump långsammare passage av vätska eller prov genom patronen.- Sätt i bläckpatronerna i eller portarna på 24-port glas block vakuum grenröret och slå på vakuumpumpen. Lämna oanvända port(ar) utjämnade. Lämna en eller två portar un-capped att upprätthålla lägre tryck på vakuum mätaren vid behov.
- Fukta varje patron två gånger med 800 µL av 80% acetonitril (ACN)/0.2% myrsyra acid/19.8% vatten. Säkerställa lösningsmedel nivå förblir 2 – 3 mm ovanför sorbent. Kontrollera vakuum mätaren på grenröret ger 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 i Hg).
- Temperera varje patron tre gånger med 800 µL av 0,2% myrsyra i vatten. Kontrollera vakuum mätaren på grenröret ger 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 i Hg).
- Ladda peptid proverna vidare till patronen. Kontrollera vakuum mätaren på grenröret läser 6,77 – 8,47 kPa (2 – 2,5 i Hg) och flödet inte överstiger 1 mL/min.
- Tvätta varje patron tre gånger med 800 µL 0,2% myrsyra i vatten. Kontrollera vakuum mätaren på grenröret ger 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 i Hg).
- Ta bort patronen från vakuum grenröret och bosätta sig i en 1,5 mL mikrorör.
- Eluera peptider en gång med 800 µL av 80% ACN/0.2% myrsyra acid/19.8% vatten och låt lösningsmedelsfronten Inkubera med sorbent för 2 – 3 min.
- Använd en pipett till push lösningsmedel genom sorbent lagret inuti kassetten. Upprepa för den andra elueringen 400 µL 80% ACN/0.2% myrsyra acid/19.8% vatten in i det samma 1,5 mL mikroröret.
- Torka eluatet genom vakuum centrifugering (fast centrifugering hastighet vid 268 x g), vanligtvis i 3 h.
Obs: Om det behövs, torkade eluatet prover kan förvaras fryst vid-20 ° C tills det att fortsätta med fraktionering.
3. fractionate peptider med Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
- Återsuspendering de per-acylated och Glu-C rötas prover (beredd enligt beskrivningen i avsnitten 1 och 2) i 200 µL buffert A (10 mM ammonium formate i vatten, pH 10), blanda provet under 10 minuter på en vortex mixer vid 4 ° C och centrifugera 17.500 x g i 10 min på rummet te mperature.
Obs: Det resulterande peptid-provet är redo att vara offline fractionated av högt pH separation19,20. - Programmera offlinemetoden HPLC fraktionering beroende på instrument och programvara som används. Följande metod är specifika för ett binärt HPLC pumpsystem inklusive en spektrofotometer UV-detektor, en autosampler, en bråkdel samlare och en C18 kolumn (4,6 mm x 250 mm, 5 µm partikelstorlek) som tål pH 10.
- Samla in 40 bråk varje 2.1 min per fraktion och kombinera varje fjärde bråkdel, vilket resulterar i fyra slutliga poolade fraktionerna4. Ett större antal poolade fraktioner kan användas för att ytterligare minska prov komplexitet på bekostnad av masspektrometri data collection tid.
- Torka de poolade fraktionerna i en lyophilizer, återsuspendering torkade peptid proverna i 1 mL 50% ACN och 1% myrsyra i vatten och överföra till en mindre provbehållaren. Torka överförda provet via vakuum centrifugering (fast centrifugering hastighet vid 268 x g), typiskt för 1 h.
Obs: Lågt ångtryck av ammonium formate kan försvåra fullständig torkning. Om betydande mängder formate ammoniumsalt kvarstår som salt fällningen efter torkning, upprepa fast fas utvinning. - Återsuspendering proverna i 20 µL av 0,2% myrsyra i vattnet med indexerade retention time (iRT) peptid standard blandningen.
Obs: Prover är nu redo för analys av masspektrometri.
4. DIA analys av fraktionerade peptid prover
-
Analysera proverna med en DIA LC-MS/MS metod, som kan justeras enligt de massa spektrometriska instrument som är tillgängliga. Analysen utfördes med hjälp av en nano-LC 2D HPLC-system online ansluten till en ortogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) masspektrometer.
- Programmera programvaran instrumentet så att peptid blandningar överförs till en C18 före kolumn chip (200 µm x 6 mm C18-CL chip, 3 µm, 300 Å) och tvätta 2 µL/min i 10 min med lastning spädningsvätska (H2O/0.1% myrsyra) för avsaltning.
- Separata peptiderna gaskromatografiskt på ett 75 µm x 15 cm C18-CL chip (3 µm, 300 Å) med en flödeshastighet av 300 nL/min med en 2 h lutning med typiska (och LC-system specifik) vattenlösning och ACN lösningsmedel buffertar4.
- Generera en variabel fönster DIA metod, där massa utbud Fönstren av varierande bredd (5 till 90 m/z) skickas från den Q1 quadrupole in cellen kollision i enskilda steg över hela massa intervallet (m/z 400-1250).
Obs: Cykeltiden 3,2 s innehåller en 250 ms föregångare ion scan följt av 45 ms ackumulering tid för var och en av de 64 SWATH segment21,22.
- Identifiera peptider med en parallell analys av prover av DDA MS och byggnaden av spektralbibliotek eller alternativt peptider kan identifieras direkt från DIA data med hjälp av PIQED programvara23, som hanterar alla tekniska åtgärder för databehandling, identifiering och import till Skyline för efterföljande kvantifiering.
5. exempel Data analys Tutorial
-
Ladda ner programvaran Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) och skapa en PanoramaWeb konto (https://panoramaweb.org).
Obs: För detaljerad handledning som beskriver användning av Skyline med data, se (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Andra Programvarualgoritmer kan användas istället för att extrahera lätta och tunga fragment ion peak områden från DIA förvärven, såsom öppen SWATH24, SWATH 2.0 plugin till PeakView25, och Spectronaut26.- Hämta filen Skyline data för succinylated BSA representativa resultat (figur 3) från Panorama offentliga: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Gå till tabellen ”riktade MS kör” på webbsidan Panorama och hämta filen sky.zip att välja länken på höger sida. Extrahera den nedladdade zip-mappen och dubbelklicka på skyline.sky filen för att öppna det i Skyline. Kontrollera peptid fragment ion måltavlan trädet (till vänster) och de fyra kromatogram från definierade procentandelar av ljus succinylation (rätt panelerna).
- Välj ”Visa” menyn, navigera till ”Peak områden | Replikera jämförelse ”. Panelen ”Peak områden – replikera jämförelse” som innehåller stapeldiagram visas på höger sida av fönstret. I panelen Peak områden, högerklicka och välj ”övergångar | Singeln ”, som visar fragment ion topparean för den valda fragment ion. Slutligen, högerklicka på panelen ”Peak områden” och Välj ”Beställ | Dokumentet ”.
- I målet trädet panelen till vänster i fönstret, högerklicka på peptiden ”E.LCKVASLRE. T | Proportioner till | Oneheavy ”, som beräknar förhållandet mellan ljus ion signal över tunga ion signal, ljus-och Heavy.
Obs: Detta är inte samma som webbplatsen beläggning stökiometri förhållandet mellan Light/(Heavy+Light). - Observera att trädet mål nu rapporterar nyckeltalen L/H till höger om ljus fragment jonerna.
-
Bestäm ”differentiering fragment jonerna” som innehåller webbplatsen acylation av intresse.
Obs: I figur 3visas med detta exakta exempel särskiljande jonerna bestämdes som y7 (högst rankad), y8, b3och b4. Märke att de icke-göra åtskillnad mellan fragment jonerna visar förhållandet 1 i trädet mål.- I den vänstra panel mål trädet, under den 588.30 ++ delnod av Peptid E.LCKVASLRE. T, klicka på y7 differentiera fragment ion
K [y7 ] – 902.49 + (rank1) [5]
Märka den ökande topphöjden och område. - I den vänstra panel mål trädet, under den 588.30 ++ delnod av Peptid E.LCKVASLRE. T, klicka på y5 icke-göra åtskillnad mellan fragment jonen en [y5 ] – 575.31 + (rank 6) [1]. Observera att de y5 fragment ion kromatogram och peak områden förblir i samma intervall för alla prover.
- Målet träd på panelen bläddra igenom andra differentiering (förhållandet än 1) och icke-differentiering (förhållandet mellan 1) fragment joner och märker de förändringar och mönster i toppens bar graph och kromatogram.
- Fastställa de exakta peak områdena för lätta och tunga paren av särskiljande joner för att beräkna stökiometri (för ytterligare detaljer se också Meyer et al. 4). Klicka på den ”Visa | Stödraster för dokument ”och dokumentrutnätet dyker upp. Längst upp till vänster stödraster för dokument, klicka på ”visningar | Övergång resultat ”att se en multi-kolumn tabell fragment ion information, exempelvis peptid sekvens, föregångare mz, replikera namn, osv
- Ändra rapportformatet att ”pivotera” genom igen klicka på ”visningar” i dokumentrutnätet och välja ”Redigera vy” för att öppna fönstret Anpassa vy. Längst ner till vänster i fönstret ”Anpassa vy”, kontrollera ”Pivot replikera namn” och välj ”Ok” för att stänga fönstret Anpassa vy. Observera att nu ”dokumentet rutnät: övergången resultat” i tabellfönstret har åter arrangeras att gruppera replikera namn, retentionstid, område, bakgrund, topp Rank kolumner av replikera (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
- För peptiden ”E.LCKVASLRE. T ”i tabellen” dokumentet rutnät: övergången resultatet ”hitta kolumnen” föregångare Mz ”, kolumnen” Fragment Ion ”och kolumnen 1pct_light_sw1 område (1% succinylation). Observera att det finns två föregångare joner för denna peptid, ljus (föregångare Mz av 588.30 i de första 8 raderna) och tung (föregångare Mz av 590.32 i de sista 8 raderna).
- I kolumnen ”Fragment Ion” hitta två rader för y8 fragment jonen motsvarar ljuset och tunga föregångare jonerna. Från samma rader i kolumnen 1pct_light_sw1 område, spela in områdena y8 för ljuset (15 820), och tungt (1,426,461).
- I den vänstra panel mål trädet, under den 588.30 ++ delnod av Peptid E.LCKVASLRE. T, klicka på y7 differentiera fragment ion
- Med hjälp av dessa topp området värden, beräkna den succinylation stökiometri, eller andelen ändras, enligt formeln nedan och få en stökiometri förhållandet mellan 0,01 eller 1% succinylation, som motsvarar andelen av ljus succinylation i här definieras blandning:
- Beräkna förhållandet stökiometri för 10% succinylation med y8 särskiljande fragment ion peak området värden från kolumnen 10pct_light_sw1-området, 144,953 (ljus) och 1,188,041 (tung), att få ett förhållande på 0,10, eller 10% succinylation.
- Beräkna förhållandet stökiometri för 100% succinylation med y8 särskiljande fragment ion peak området värden från kolumnen 100pct_light_sw1-området, 954,513 (ljus) och 16,407 (tung), att få ett förhållande på 0,98 eller 98% succinylation.
- På samma sätt beräkna förhållandet stökiometri för 1% succinylation med b3 särskiljande fragment ion peak området värden från kolumnen 1pct_light_sw1-området, 55,697 (ljus) och 3,149,119 (tung), att få ett förhållande av 0,01 eller 1% succinylation.
- Fortsätta de stökiometri baserat på beräkningar med hjälp av formeln för alla särskiljande fragment jonerna, både y och b joner, för att erhålla den lysin succinylation stökiometri värden för 1, 10, 50 och 100% succinylation blandningar.
Representative Results
Efter datainsamling, särskiljande MS2 fragment joner bestämdes från de proteolytiska acylated peptiderna, därefter extraherade ion kromatogram (XIC) bearbetades i Skyline, och motsvarande ljus och tung topp områden exporterades som var Slutligen används för att beräkna webbplats beläggning. Figur 2A visar en konceptuell illustration av hur den föregångare-Jon XIC kan visas med både lätta och tunga peptid signaler och figur 2B presenterar ett exempel på motsvarande fragmentet ion XICs med färgkodning (röd = ljus; blå = tung ) för att skilja fragment joner som innehåller lysin acylation ändringar.
Figur 3 visar data från en beläggning experiment, såsom beskrivits ovan analysera fördefinierade förhållanden av ljus-och heavy succinylated BSA genereras internt på 1, 10, 50, eller 100% och bestämning av succinylation beläggning därav. Importera DIA beläggning data till Skyline möjliggör enkel visualisering av målet träd, visning av peptid sekvenser och fragment joner både för lätta och tunga föregångare jonerna (figur 3A). Data från DIA-MS för varje definierad succinylated BSA baserat avslöjade immanently de relativa skillnaderna i förhållandet mellan ljus-till-heavy y7 Jon, den högst rankade särskiljande fragment ion från identifierad peptid-spectra matchen (anges i rött, Figur 3B). Figur 4 visar en översikt över bearbetade resultaten från beräkningen MS2 beläggning som bekräftade succinylation procentsatser beläggningen av ingående protein, här bestående av pre-succinylated BSA. Uppmätta lysin succinylation beläggning för 20 proteolytiska succinylated peptider från kommersiella pre-succinylated BSA, succinylated på definierade procentsatser (t.ex., vid 0, 1, 10, 50 och 100%) visas i tabell 2. För varje av de 20 proteolytiska BSA peptiderna, den högst rankade, differentiera MS2 fragment ion användes för att beräkna lysin succinylation (Ksucc) beläggning, som L/(L+H) i %. Sammantaget visade MS2-baserade kvantifiering mycket god noggrannhet vid fastställandet acylation beläggning även vid låga stoichiometries.
Figur 1: stökiometri arbetsflödet. (A) proteiner inkuberas tre gånger med ättiksyra anhydrid -d6 till acetylate omodifierade lysin rester. Nästa, acetylerade proteiner smälts med endoproteinase Glu-C, följt av HPLC fraktionering av de proteolytiska peptider som använder basic-pH omvänd fas kromatografi. Slutligen, peptider analyseras av LC-MS med DIA med variabel föregångare fönster bredder. (B) samma arbetsflöde används för att bestämma den succinylation stökiometri som beskrivs i (A), utom den tunga acylation reagensen ändras till succinic anhydride -d4. Figur anpassad från Meyer et al. 4 (J. Am. Soc. Mass Spectrom., öppna val). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på möjliga uppgifter som erhållits och stökiometri beräkningar. (A) ljus (L) och tunga (H) MS1 föregångare joner som innehåller en acetylerade lysin skiljer 3 massenheter. XICs genereras för både lätta och tunga isotopiska kuvert anges i rött och blått, respektive. (B) kvantifiering från den MS2 fragment ion XICs från DIA förvärv kan utföras med 'att differentiera' lätta och tunga fragment joner som innehåller webbplatsen acetylering anges i rött och blått. Gemensamma fragment joner visas i Prickig svart och innehåller inte platsen för modifiering. Figur anpassad från Meyer et al. 4 (J. Am. Soc. Mass Spectrom., öppna val). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Skyline visualisering av succinylated proteolytiska BSA peptid på olika beläggning nivåer. (A) Skyline mål träd visar den proteolytiska peptiden LCKsuccVASLRE och dess resulterande fragment joner. (B) silhuett utvinns fragment ion kromatogram på olika nivåer av succinylation beläggning. Den högsta rankade särskiljande ion, y7, ökar i topparea 1, 10, 50 och 100% korrelera med ingående andelen av pre-succinylated BSA (genereras internt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bedömning av BSA acylation stökiometri av pre-succinylated BSA. Fem olika BSA prover på definierade procentsatser av tunga modifiering (t.ex., vid 0, 1, 10, 50 och 100%) utsattes för MS2 beläggning bestämning. Webbplats beläggning för 20 succinylated BSA peptider bestämdes från högsta rankade särskiljande fragment jonerna för fem olika BSA prover på definierade procentsatser av ljus ändring (t.ex., vid 0, 1, 10, 50 och 100%). Box-Whisker tomten visar fördelningen av de 20 succinyl-peptiderna, värden från 50% av peptider som i 'rutan' (25% percentilen till 75% percentilen), den övre morrhår anger värden från 75% percentilen till maximum (100%) och den nedre morrhår indikerar värdena från 25% percentilen till minimum (0% percentilen). (J. Am. Soc. Mass Spectrom., öppna val). Kvantifiering av mätningar kan hittas i tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tid (minuter) | % A | % B |
| 0.00 | 100 | 0 |
| 7.27 | 92 | 8 |
| 45,27 | 73 | 27 |
| 49.27 | 69 | 31 |
| 65.27 | 61 | 39 |
| 72,27 | 40 | 60 |
| 80.00 | 10 | 90 |
| 85.00 | 10 | 90 |
| 86,00 | 100 | 0 |
| 120,00 | 100 | 0 |
| Flödeshastighet: 0,7 mL/min | ||
| Buffert A: 10 mM ammonium formate i vatten, pH 10 | ||
| Buffert B: 10 mM ammonium formate i 90% ACN och 10% vatten, pH 10 | ||
| Obs: Båda mobila faser pH justeras till 10 med snygg ammoniak | ||
Tabell 1: Gradient för offline basic-pH omvänd fas HPLC fraktionering. Gradient längd: 120 min. buffert A: 10 mM ammonium formate i vatten, pH 10. Buffert B: 10 mM ammonium formate i 90% ACN och 10% vatten, pH 10.
| L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % |
| Ksucc 0% | Ksucc 1% | Ksucc 10% | Ksucc 50% | Ksucc 100% |
| 0,2 | 1.7 | 11.1 | 50,9 | 99,2 |
| 1.2 | 2.3 | 12.3 | 49,4 | 97.6 |
| 2,9 | 3.8 | 14 | 48,6 | 99,5 |
| 0,5 | 1.8 | 11,7 | 50,8 | 99,5 |
| 0,2 | 1.7 | 11.1 | 48,3 | 98,2 |
| 0,2 | 1.2 | 11 | 47,5 | 96,1 |
| 0,3 | 1.6 | 12,8 | 51 | 99,2 |
| 3.7 | 5.2 | 14,7 | 51,9 | 89,5 |
| 1.5 | 1.8 | 12.5 | 47,2 | 91,1 |
| 0,8 | 1.5 | 11.3 | 48,4 | 96,8 |
| 0,2 | 1.6 | 13,9 | 49,7 | 98,9 |
| 0,1 | 1.1 | 10,7 | 48,2 | 98,6 |
| 0,2 | 0,9 | 10.3 | 49,4 | 99,4 |
| 0,5 | 2.5 | 17,2 | 52,3 | 97,5 |
| 0,1 | 3.5 | 20,8 | 51 | 99 |
| 0,3 | 1.9 | 10,7 | 49,6 | 98,2 |
| 2 | 1.7 | 10,9 | 47,7 | 96,3 |
| 0,3 | 1.2 | 10 | 53 | 98 |
| 1.1 | 1.8 | 12,9 | 57,9 | 94,1 |
| 0,2 | 1.4 | 11,6 | 48,6 | 98,8 |
Tabell 2: kvantifiering av uppmätta BSA lysin succinylation beläggning för 20 proteolytiska succinylated peptider. Succinylated peptider från kommersiella pre-succinylated BSA, succinylated på definierade procentsatser (t.ex., vid 0, 1, 10, 50 och 100%). För varje av de 20 proteolytiska BSA peptiderna, den högst rankade, differentiera MS2 fragment ion användes för att beräkna lysin succinylation (Ksucc) beläggning, som L/(L+H) i %.
Discussion
Detta protokoll ger en ny och exakt metod för att kvantifiera platsspecifika lysin acetylering och succinylation beläggning som kan tillämpas på en hela proteomet. Denna metod förlitar sig på mätning av endogena ljus peptider och exogena tunga peptider, varav den senare är genererade i vitro med kvantitativa kemiska acylation av proteiner med deutererade ättiksyra anhydrid -d6 eller Succinic anhydride -d4 (figur 1). Liknande metoder har använt stabil isotopiska märkning av infödda omodifierade lysin rester och utfört webbplats beläggning kvantifiering baserat på antingen föregångare ion-bara12 eller fragment joner från DDA förvärv13,14. Detta protokoll gäller flera steg under provberedning acylation effektivitetsförbättringar och utökar det kemiska märkning till succinylation. Datainsamling med DIA förvärv erhåller både föregångare ion och MS2 fragment ion stödnivåer över hela detekterbara massa intervallet, vilket minskar fragment ion störningarna. Analys och kvantifiering via Skyline och anpassade skript egenutvecklade tillåter webbplatsen beläggning beräkningen för peptider som innehåller mer än en lysin rester och mer än en acylation på en plats.
Det finns flera kritiska steg under förberedelsestadiet prov av detta protokoll som bör följas noggrant. Eftersom hela protokollet är beroende av effektiv kemisk modifiering av alla lysin rester, är detta steg av yttersta vikt. Anhydrider reagerar med gratis aminer, så amine-innehållande buffert eller främmande molekyler i proteinet lysate måste undvikas. Också under kemiska per-acylation steg, se till att pH-värdet i reaktionsblandningen justeras tillbaka till pH 8 efter varje av de tre inkubationer med ättiksyraanhydrid reagens som denna reaktion försurar blandningen, och O-acylation-sidoreaktioner kan bilda. Utspädning av 8 M urea-innehållande reaktionsblandningen att runt 0,8 M urea innan matsmältningen och kontrollera att pH-värdet ligger inom intervallet som optimal är dessutom viktigt för optimal aktiviteten av endoproteinase Glu-C. En annan viktig komponent i våra protokoll är steget data insamling och införandet av ett DIA arbetsflöde, som övervinner inkonsekvenser DDA datasampling och vilket möjliggör kvantifiering på MS2 fragment ion nivå. En huvudsaklig fördel av metoden DIA är minskningen av störningar som vanligtvis är mycket mer benägna och problematiskt när kvantifiera MS1 föregångare ion signalen (som några av de tidigare publikationerna har föreslagit).
Flera ändringar i arbetsflödet kan göras när du förbereder mycket komplexa prover. Antalet fraktioner poolade efter den offline basic-pH omvänd fas HPLC fraktioneringen kan minskas för att sänka komplexiteten i de poolade prover som kommer att förvärvas av LC/MS. dessutom längre kromatografiska övertoningar kan också användas under förvärv som möjliggör bättre peptid separation. Alternativt, flera proteaser kan användas för att smälta prov för att producerar en större mängd klyvs peptider och öka täckningen av protein lysin rester. Trial körs och optimering kan genomföras med hjälp av kommersiella BSA som innehåller specifika procentsatser av acetylering eller succinylation.
En begränsning till detta protokoll är potentiellt liten webbplats beläggning överskattningen beror på oredovisad andra ändringar, lysin, till exempel metylering eller ubikvitinering, etc., på samma plats4. Beräknas från peak områden i lätta och tunga acyl ändringar, L/(L+H), är webbplats beläggningen baserat på antagandet att den totala nivån på modifiering vid en lysin webbplats består av endast endogena 'ljus' acylation (L) och kemiskt märkt 'tung' acylation (H). Dock kan den faktiska totala acylation beläggningen på en webbplats i vivo omfatta andra ändringar utöver acetylering och/eller succinylation. Dessutom rapporterade isotopiska renheten av köpta reagenser ättiksyra anhydrid -d6 (99%) och succinic anhydride -d4 (> 98%) kan bidra till en liten överskattning av upp till 2% (succinyl) eller 1% (acetyl) av den endogena acylation nivå4. Tillsammans, dessa smärre overestimations lägga till svårigheten att kvantifiera platser med mindre än 1% beläggning. Stort överflöd skillnader mellan den kompletta kemiskt acylated peptider och de infödda acylated peptiderna också bidra till potentiella webbplats beläggning kvantifieringsfel, särskilt för låg endogen acylated peptider27. En färsk studie av Weinert et al. 27 funnit att minskad överflöd skillnader mellan komplett per-acetylerade peptider kan minska de kvantifiering fel27.
Stökiometri kvantifieringar samlades använder det här protokollet kan peka ut viktiga acylation hotspots i ett särskilt protein och form hypoteser för biologiska uppföljande experiment, såsom webbplats riktad mutagenes av vissa platser av intresse. Detta protokoll kan också avslöja kombinerade effekterna av låga acylation stökiometri webbplatser som kunde utöva indirekt eller subtila influenser på protein strukturella stabilitet och lokaliserade cellulära miljöer. Dessutom skulle genomförandet av detta protokoll att mäta acetylering och succinylation och andra möjliga lysin acylation ändringar utöver acetylering unikt erbjuda insikter i dynamiska acylation effekter på proteiner under olika biologiska förutsättningar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH nationella institutet för Diabetes och mag- och njur sjukdomar NIH-NIDDK bevilja R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGI stöddes av en NIH T32 fellowship (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Författarna erkänner stöd från NIH gemensamma instrumentation bidrag för TripleTOF 6600 systemet vid Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
| succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
| sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
| Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
| HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
| HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
| urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
| triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
| anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
| 50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
| LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
| LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
| Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
| Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
| Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
| Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
| Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
| indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
| SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
| Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |
References
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325 (5942), 834-840 (2009).
- Meyer, J. G., et al. Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH). J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).
- Hirschey, M. D., Zhao, Y. Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).
- Wagner, G. R., Payne, R. M. Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix. J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).
- Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).
- Zhang, J., et al. Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli. Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).
- Kuhn, M. L., et al. kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation. PLoS One. 9 (4), e94816 (2014).
- Baeza, J., et al. Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome. J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).
- Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells. J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).
- Nakayasu, E. S., et al. A method to determine lysine acetylation stoichiometries. Int J Proteomics. 2014, 730725 (2014).
- Rardin, M. J., et al. MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).
- Svinkina, T., et al. Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Schilling, B., et al. Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli. Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers. Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., et al. PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data. Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).
- Rost, H. L., et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data. Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).
- Lambert, J. P., et al. Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition. Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).
- Bruderer, R., et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).
- Weinert, B. T., et al. Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).
