Summary
Her presenterer vi upartiske kvantifisering av områdespesifikke protein acetylation og/eller succinylation belegget (støkiometri) av en hel proteom gjennom en ratiometric analyse av endogene endringer endringer introdusert etter kvantitative kjemiske acylation med stabil isotop-merket anhydrider i form. I kombinasjon med sensitive data uavhengig oppkjøpet massespektrometri hentes akkurat sted bruk målinger.
Abstract
Post-translasjonell modifikasjon (PTM) av protein lysin rester av NƐ- acylation induserer strukturelle endringer som kan dynamisk regulere protein funksjoner, for eksempel ved å endre enzymatisk aktivitet eller formidling interaksjoner. Presis kvantifisering områdespesifikke protein acylation belegg eller støkiometri, er viktig for å forstå funksjonelle konsekvensene av både globale lavt nivå støkiometri og personlige høyt nivå acylation støkiometri av bestemte lysin rester. Andre grupper har rapportert måling av lysin acetylation støkiometri ved å sammenligne forholdet mellom peptid forløper isotoper fra endogene, naturlige overflod acylation og eksogene, tunge isotop-merket acylation introdusert etter kvantitative kjemiske acetylation proteiner med stabil isotop-merket eddiksyre. Denne protokollen beskriver en optimalisert tilnærming med flere forbedringer, inkludert: (1) økt kjemiske acylation effektivitet, (2) muligheten til å måle protein succinylation i tillegg til acetylation, og (3) forbedret kvantitative nøyaktighet grunn redusert interferens med fragment ion kvantifisering av data-uavhengig oppkjøp (DIA) i stedet for forløper ion signalet fra data-avhengige oppkjøp ("BMH"). Bruk av utdraget peak områder fra fragment ioner for kvantifisering kan også unik differensiering av områdenivå acylation støkiometri fra proteolytisk peptider som inneholder mer enn én lysin rester, som ikke er mulig å bruke forløper ion signaler for kvantifisering. Datavisualisering i silhuett, en åpen kildekode kvantitative Proteomikk miljø, gir praktisk data inspeksjon og gjennomgang. Sammen, tilbyr denne arbeidsflyten upartisk, presis og nøyaktig kvantifisering av områdespesifikke lysin acetylation og succinylation belegg av en hel proteom, som kan avsløre og prioritere biologisk relevante acylation områder.
Introduction
NƐ- acylation av protein lysin rester er en viktig regulator av protein-funksjonen. Lysin acetylation og andre acylations, som succinylation, malonylation og glutarylation, antas å regulere stoffskiftet, celle signalisering og andre cellulære prosesser1,2,3,4 , og har implikasjoner i metabolske forstyrrelser5. Mange studier har funnet at lysin acyl modifikasjoner gjennomgå store fold-endringer under ulike forhold i pattedyr vev og celle linjer5,6,7,8 samt bakterier9,10,11, men endringene relative brett gir innsikt i andelen totale protein endret. Studier målinger av acylation området innkvartering er knappe12,13,14, til tross for relevansen og behov for slike studier som de gir mer detaljert enn relativ fold endre. For eksempel kan en 10 ganger endring representere en nettstedet bruk økning 0,01 0,1%, 1-10% eller selv 10 til 100%. Nøyaktig støkiometri målinger er nødvendig å tolke biologiske betydningen av acylation og forutsi innvirkning om omfanget av protein strukturelle, og muligens funksjonelle endringer.
En tidligere metode å kvantifisere området bruk benytter tunge stabil-isotop kjemiske merking av uforandret lysin rester etterfulgt av massespektrometri å måle forholdet mellom endogen "lys" acetylation i forhold til den ytre, kjemisk-merket "tunge" acetyl-lysine med forløperen ion intensiteter12. En fersk studie av Zhou et al. 13 beskrevet en lignende tilnærming for å vurdere lysin acetylation støkiometri som også ansatt en komplett kjemiske acetylation av alle uforandret lysin rester i proteiner med stabil isotop merking, men brukt fragment ion intensiteter målt ved DDA. Nakayasu et al. 14 brukt en lignende DDA tilnærming, men i stedet brukes forholdet mellom lette og tunge acetyl-lysine immonium ioner for kvantifisering. Kvantifisering basert på fragment ioner, immonium eller sekvens ioner (MS2), i de fleste tilfeller fører til mindre signal forstyrrelser i forhold til behandling intakt peptid forløper ioner (MS1). Imidlertid kan kvantifisering fragment ioner fra DDA generert MS-/ MS spectra lide av Stokastisk sampling mangler, hvor høy-overflod forløper ioner er mer sannsynlig å bli valgt for MS-/ MS og dermed føre til en partisk og ufullstendig utvalg av forløperen ioner.
Denne romanen arbeidsflyt4 (figur 1) bruker konseptuelt en stabil isotop kjemiske merking tilnærming opprinnelig utviklet av Baeza et al. 12, men arbeidsflyten senere kombinert med DIA samle begge forløper og flere fragment ion krillens over synlig massen spenner15,16 gir nøyaktig støkiometri beregninger.
Topp områder fra fragmentere ioner som inneholder acylation stedet av interesse, eller 'skille fragment ioner', er brukt om å kvantifisere acylation nettstedet belegg (figur 2). Fragment ioner som ikke inneholder endringen har identiske lette og tunge m/z-verdier, og brukes for peptid identifikasjon, men ikke for kvantifisering. Skyline programvare17 brukes til å hente forløper og fragment peak områder. Tilstedeværelsen av flere fragment ioner som inneholder et bestemt acylation område gir fleksibilitet hvis det oppdages forstyrrelser i noen av de fragment ionene. Datavisualisering i Skyline gir kritiske inspeksjon av lett-å-tunge fragment ion prosenter. I tillegg til manuell dataanalyse, ble en åpen kildekode R-pakke skrevet internt StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), utviklet, som bruker den forløper ion og fragment ion data samlet inn gjennom DIA og kvantifiserer stedsbestemte acylation støkiometri fra peptider som inneholder flere lysin rester, en funksjon ikke mulig med forløperen ion-bare intensitet målinger4.
Denne protokollen også demonstrerer bruken av endoproteinase Glu-C, som er spesifikk for C-terminalen cleavage på glutamic og aspartic syre rester, istedet for benytter trypsin eller Arg-C protease, sistnevnte ofte generere svært store og potensielt multiplisere acylated proteolytisk peptider fra blokkert trypsin cleavage på acylated lysin rester. Den kjemiske merking prosedyren ble også utvidet til å inkludere bruk av succinic anhydride (figur 1), og dermed gjør kvantifisering av succinylation støkiometri succinylation. I tillegg til forbedringer eksempel forberedelse, gjennomføring av peptid fraksjoneres av frakoblet, grunnleggende pH, redusert reverseres-fase (bRP) utskillelse av peptider ytterligere kvantifisering forstyrrelser, slik at bedre de convolution av acylation støkiometri i hele proteom prøver. Sammen, denne metoden har, og fremhever flere fordeler: (1) effektivisering av kjemiske acylation; (2) måling av protein succinylation støkiometri i tillegg til acetylation; og (3) forbedret kvantifisering nøyaktighet. Forbedret kvantifiseringen er redusert forstyrrelser i fragment ion signaler fra DIA sammenlignet DDA forløper signalet, så vel som implementeringen av off-line peptid før fraksjoneres av bRP.
Protocol
1. kvantitativt Acetylate og/eller Succinylate proteiner med isotop-merket eddiksyre eller Succinic Anhydride
- Forberede 3 gjenskapninger av 100 µg av bovin serum albumin (BSA) protein prøven parallelt, på en konsentrasjon av 1 µg/µL (totalt 100 µL), med urea og triethylammonium bikarbonat (TEAB) løsning (8 M urea, 200 mM TEAB, pH 8).
Merk: Det er viktig å bruke Amin-fri buffer. Protein utvalgene brukt her i representant resultatinndelingen er BSA, kvantitativt succinylated BSA, og blandinger av gir BSA prøver med definert succinylation belegg på 0%, 1%, 10%, 50% og 100%, henholdsvis (hvert utvalg tilberedes i 3 gjentak). Denne protokollen er også utført med protein lysates fra Escherichia coli og mus leveren4. Protokollen kan også brukes til andre celle eller vev lysates. - Redusere 100 µL av BSA utvalg (100 µg) med 8 µL av 250 mM dithiothreitol (DTT) å nå en siste konsentrasjon av 20 mM DTT og ruge prøven på 37 ° C i 30 min med agitering på 1400 rpm.
- Alkylate redusert BSA prøven med 21,6 µL av 200 mM iodoacetamide å nå en siste konsentrasjon av 40 mM iodoacetamide og ruge prøven i mørket ved romtemperatur for 30 min.
Merk: Det er viktig for å ha iodoacetamide konsentrasjonen litt mer enn 2 x DTT konsentrasjon å sikre at alle redusert protein thiols er alkylated. -
Fortsett med å forberede eddiksyre anhydride -d6 (trinn 1.4.1) eller succinic anhydride -d4 (trinn 1.4.2) trengs for kjemiske (kvantitative) acetylation eller succinylation av prøvene.
- Bestemme molarity (M) av 1 g aliquot vandig eddiksyre anhydride -d6 løsning fra molekylvekt (108.13 g/mol) og tetthet (1.143 g/mL ved 25 ° C).
Merk: 1 g pakken inneholder 9,248 µmol eddiksyre anhydride -d6 i 875 µL volum, gir en 10.57 M løsning brukes for per-acetylation av prøvene. - Forbered en 5 M løsning av succinic anhydride -d4 ved å løse opp pulveret i vannfri DMSO umiddelbart før reaksjonen å unngå hydrolyse av reagens. Oppløse 0,24 g succinic anhydride -d4 i 461 µL av vannfri DMSO å få en 5 M løsning.
- Bestemme molarity (M) av 1 g aliquot vandig eddiksyre anhydride -d6 løsning fra molekylvekt (108.13 g/mol) og tetthet (1.143 g/mL ved 25 ° C).
- Utføre kvantitativ kjemiske acetylation eller succinylation ved å legge til 60 µmol av eddiksyre anhydride -d6 (6 µL av 10.57 M løsningen) eller succinic anhydride -d4 (12 µL av 5 M løsningen) henholdsvis og ruge den eksempel på 4 ° C etter 20 min på en vortex mikser.
Merk: På grunn av surheten i anhydrider i form, proteiner kan utløse. Ta oppmerksom på og justere som beskrevet i trinn 1.6. - Legge til 10 µL av 7.25 M NaOH etter inkubasjon å øke pH ~ 8 å eliminere O-acylation side-produkter. Vortex kort og sjekk prøven pH av småblødninger 1 µL på pH papir.
Merk: Det kan være nødvendig å legge mer enn 10 µL av 7.25 M NaOH til pH 8. I tillegg skulle potensielt utfelt proteiner å oppløse. - Gjenta de per-acylation og pH justering 1,5 og 1,6 totalt tre ganger. Når pH-verdier og merke volumet av grunnleggende løsning lagt til repetisjon. Arbeid raskt under ovenfor kjemiske acylation trinn fordi de anhydrider i form vil hydrolyze og miste reaktivitet.
- Etter den endelige merking reaksjon og pH justeringen, Legg 10 µL av 50% hydroksylamin løsning å O-acylation siden reaksjoner.
2. Digest reagerte Protein prøver ved Glu-C Endoproteinase
- Fortynne urea konsentrasjonen 0,8 m med 50 mM TEAB, pH 8 og normalisere eksempel volumene.
- Oversikten protein prøvene ved å legge endoproteinase Glu-C på en 1:50 protease substrat protein forhold (w/w) og Inkuber prøvene overnatting på 37 ° C med agitering på 1400 rpm.
- Syre og slukke protein fordøyelse prøvene ved å legge til maursyre 1% av volumet.
-
Desalt prøver ved hydrofile-lipofile balanse solid-fase utvinning patroner. Bruk en 30 mg absorberende patron per sample, maksimalt 5 mg materiale per kassett4,18.
Merk: Det er viktig å holde den absorberende inni kassetten våt avsalting prosessen. Når det er nødvendig, slå av vakuumpumpe tregere passering av løsemidler eller prøve gjennom kassetten.- Patronen inn porten(e) på 24-porters glass block vakuum manifolden og aktivere vakuumpumpe. La ubrukte port(er) avkortet. Forlate en eller to porter un avkortet å opprettholde lavere press på vakuum måleren om nødvendig.
- Våt hver kassett to ganger med 800 µL av 80% acetonitrile (ACN)/0.2% formic acid/19.8% vann. Påse løsemiddel 2-3 mm over absorberende nivået. Sikre vakuum måleren på manifold leser 16,9-67.7 kPa (5-20 i Hg).
- Equilibrate hver kassett tre ganger med 800 µL av 0,2% maursyre i vann. Sikre vakuum måleren på manifold leser 16,9-67.7 kPa (5-20 i Hg).
- Last peptid prøvene på kassetten. Sikre vakuum måleren på manifold leser 6.77-8.47 kPa (2-2,5 i Hg), og strømningshastighet ikke overstiger 1 mL/min.
- Vask hver kassett tre ganger med 800 µL 0,2% maursyre i vann. Sikre vakuum måleren på manifold leser 16,9-67.7 kPa (5-20 i Hg).
- Fjerne patronen fra vakuum manifolden og bosette seg i en 1,5 mL microtube.
- Elute peptider én gang med 800 µL av 80% ACN/0.2% formic acid/19.8% vann og la løsemiddelet å ruge med absorberende for 2-3 minutter.
- Bruke en pipette til push solvent gjennom absorberende laget inni kassetten. Gjenta for andre tilsettes 400 µL 80% ACN/0.2% formic acid/19.8% vann i den samme 1,5 mL microtube.
- Tørke av eluate ved vakuum sentrifugering (fast sentrifugering 268 x g), typisk for 3t.
Merk: Hvis nødvendig, tørket eluate prøver kan lagres frosset ved 20 ° C til du er klar til å fortsette med fraksjoneres.
3. smuldre vekk peptider ved bruk av frakoblet Basic-pH tilbakeførte HPLC
- Nytt avbryte per-acylated og Glu-C fordøyd eksempler (forberedt som beskrevet i del 1 og 2) 200 µL av Buffer A (10 mM ammonium formiat i vann, pH 10), bland utvalget for 10 min på en vortex mikser på 4 ° C og sentrifuge 17.500 x g i 10 minutter på rommet te mperature.
Merk: Resulterende peptid prøven er klar til å være frakoblet fraksjonert med høy pH separasjon19,20. - Programmet frakoblet HPLC fraksjoneres metoden avhengig av maskinen og programvare som brukes. Følgende er spesifikke for en binær HPLC pumpesystem inkludert en dobbel bølgelengde UV-detektor, en autosampler, en brøkdel samler og en C18 kolonne (4.6 mm x 250 mm, 5 µm partikkelstørrelse) som tåler pH 10.
- Samle 40 fraksjoner hver i 2.1 min per brøk og kombinere hver fjerde fraksjon, resulterer i fire siste grupperte fraksjoner4. Et større antall grupperte fraksjoner kan brukes å redusere utvalget kompleksiteten på bekostning av massespektrometri data samling tid.
- Tørr gruppert fraksjoner i en lyophilizer re suspendere tørket peptid prøvene i 1 mL av 50% ACN og 1% maursyre i vann og overføre til en mindre eksempel beholder. Tørr overførte prøven via vakuum sentrifugering (fast sentrifugering 268 x g), typisk for 1t.
Merk: Det lave damptrykket av ammonium formiat kan gjøre hele tørking vanskelig. Hvis betydelige mengder ammonium formiat salt være som salt bunnfall etter tørking, gjenta solid fase utvinning. - Nytt avbryte prøvene 20 µL av 0,2% maursyre i vann med indekserte oppbevaring tid (iRT) peptid standard blanding.
Merk: Utvalg er nå klar for analyse av massespektrometri.
4. DIA analyse av fraksjonert peptid prøver
-
Analysere prøvene bruke en DIA LC-MS/MS metode, som justeres etter masse spectrometric tilgjengelige instrumenter. Analysen ble utført med en nano-LC 2D HPLC system online koblet til en ortogonale quadrupole tid-av-fly (QqTOF) masse spectrometer.
- Program programmet apparatet slik at peptid blandinger overføres på en C18 før kolonnen chip (200 µm x 6 mm C18-CL chip, 3 µm, 300 Å) og vask på 2 µL/min for 10 min med lasting løsningsmiddel (H2O/0.1% maursyre) for avsalte.
- Skille peptidene chromatographically på en 75 µm x 15 cm C18-CL chip (3 µm, 300 Å) på en strømningshastighet på 300 nL/min med en 2t gradient med typiske (og LC-system-spesifikk) vandige og ACN løsemiddelet bufrer4.
- Generere en variabel vinduet DIA metode, der massen utvalg vinduene variabel bredde (5 90 m/z) sendes fra Q1-quadrupole inn i kollisjon cellen i trinnvise fremgangsmåten over hele massen utvalg (m/z 400-1250).
Merk: Syklustiden av 3.2 s inkluderer en 250 ms forløper ion skanning etterfulgt av 45 ms akkumulering tid for hver av de 64 SKJÆRER segmenter21,22.
- Identifisere peptider ved hjelp av en parallell analyse av prøver av DDA MS og bygging av spectral biblioteker eller eventuelt peptider kan identifiseres direkte fra DIA data ved hjelp av PIQED programvare23, som håndterer alle tekniske tiltak av databehandling, identifikasjon og import i Skyline for påfølgende kvantifisering.
5. eksempel Data analyse Tutorial
-
Last ned programmet Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) og opprette en PanoramaWeb-konto (https://panoramaweb.org).
Merk: For detaljert opplæring som beskriver bruken av Skyline med data, se (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Andre programvare algoritmer kan brukes i stedet å ekstra lette og tunge fragment ion peak områder fra DIA oppkjøp, som åpent SKJÆRER24, SKJÆRER 2.0 plugin i PeakView25og Spectronaut26.- Last ned Skyline datafilen for succinylated BSA representant resultatene (Figur 3) fra Panorama offentlig: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Panorama websiden gå til tabellen "Målrettet MS går", og laste ned filen sky.zip å velge koblingen for nedlasting på høyre side. Pakk ut den nedlastede zip-mappen og dobbeltklikk på skyline.sky filen for å åpne den i Skyline. Sjekk peptid fragment ion mål treet (venstre panel) og de fire chromatograms fra definerte prosenter av lys succinylation (høyre panel).
- Velg "Vis"-menyen, gå til "Peak områder | Replikere sammenligning». "Topp områder – gjenskape sammenligning" panelet inneholder søylediagrammer vises på høyre side av vinduet. I Peak områder panelet, høyreklikk og velg "overganger | Single", som viser fragment ion peak området for den valgte fragment ion. Til slutt, høyreklikk "Peak områder" panelet, og velg "rekkefølge | Dokumentet".
- I målet treet-panelet til venstre i vinduet Høyreklikk peptid "E.LCKVASLRE. T | Å | Oneheavy", som beregner forholdet mellom lys ion signalet over tunge ion signal, lys/Heavy.
Merk: Dette er ikke det samme som området belegg støkiometri forholdet mellom Light/(Heavy+Light). - Legg merke til at målet treet nå rapporterer forholdstallene L/H til høyre for lys fragment ioner.
-
Bestem "differensiering fragment ioner" som inneholder acylation stedet av interesse.
Merk: Som vist i Figur 3, med denne eksakte eksempel distinktiv ioner var bestemt y7 (høyest rangert), y8, b3og b4. Legg merke til at de ikke-differensierende fragment ionene viser forholdet 1 i målet treet.- I venstre panel mål treet under 588.30 ++ sub-noden peptid E.LCKVASLRE. T, klikk på y7 skille fragment ion
K [y7 ]-902.49 + (rank1) [5]
Legg merke til økende toppen høyde og området. - I venstre panel mål treet under 588.30 ++ sub-noden peptid E.LCKVASLRE. T, klikk på y5 ikke-differensierende fragment ion [y5 ]-575.31 + (rangering 6) [1]. Observere at y5 fragment ion chromatograms og topp områder forblir i samme område for alle prøvene.
- Målet treet panelet, bla gjennom andre skille (forholdet enn 1) og ikke-differensierende (forholdet mellom 1) fragmentere ioner og merker endringene og mønstre i peak området graf og chromatograms.
- Finne de nøyaktige topp områdene for lette og tunge parene av de unike ionene for å beregne støkiometri (for mer detaljer se også Meyer et al. 4). Klikk på "Vis | Dokumentstøttelinjer"og dokumentrutenett ville popmusikk opp. I øverste venstre dokumentrutenett, klikk på "visninger | Overgangen resultater"å se en tabell med fragment ion informasjon, for eksempel peptid sekvens, forløperen mz, flere kolonner gjenskape navn, etc.
- Endre rapporten til "pivotere" ved igjen å klikke på "Views" i dokumentrutenettet og velge "redigeringsvisning" for å åpne vinduet Tilpass visning. Nederst til venstre i vinduet "Tilpasse View", sjekk "Pivot gjenskape navn" og velg "Ok" for å lukke vinduet Tilpass visning. Observere at nå "Dokumentet rutenett: overgang resultater" tabell-vinduet har reorganisert gruppere gjenskape navn, tiden, området, bakgrunn, topp rangering kolonner ved gjenskape (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
- For peptid "E.LCKVASLRE. T"i tabellen"Dokumentet rutenett: overgangsresultat"finne kolonnen"Forløper Mz"kolonnen"Fragment Ion"og kolonnen 1pct_light_sw1 området (1% succinylation). Observere at det er to forløper alternativer for denne peptid, lys (forløper Mz av 588.30 i de første 8 radene), og tunge (forløper Mz av 590.32 i de siste 8 radene).
- I kolonnen "Fragment Ion" finne to radene for y8 fragment ion tilsvarer lyset og tunge forløper ioner. Fra de samme radene i kolonnen 1pct_light_sw1 området, kan du registrere y8 områdene for lys (15,820) og tungt (1,426,461).
- I venstre panel mål treet under 588.30 ++ sub-noden peptid E.LCKVASLRE. T, klikk på y7 skille fragment ion
- Bruke disse peak området verdier, beregne succinylation støkiometri eller andelen endret, formelen nedenfor og få støkiometri forholdet 0,01 eller 1% succinylation, som tilsvarer andelen lys succinylation i dette definert blanding:
- Beregne støkiometri forholdet for 10% succinylation bruke y8 unike fragment ion peak området 10pct_light_sw1 område-kolonnen, 144,953 (lys) og 1,188,041 (tung), å få forholdet 0,10 eller 10% succinylation.
- Beregne støkiometri forholdet for 100% succinylation bruke y8 unike fragment ion peak området 100pct_light_sw1 område-kolonnen, 954,513 (lys) og 16,407 (tung), å få forholdet 0,98 eller 98% succinylation.
- Tilsvarende beregne støkiometri forholdet for 1% succinylation bruke b3 unike fragment ion peak området 1pct_light_sw1 område-kolonnen, 55,697 (lys) og 3,149,119 (tung), å få forholdet 0,01 eller 1% succinylation.
- Fortsette de støkiometri forholdet beregningene ved hjelp av formelen for alle de unike fragment ionene, både y og b ioner, å få lysin succinylation støkiometri verdier for 1, 10, 50 og 100% succinylation blandinger.
Representative Results
Etter datainnsamling, unike MS2 fragment ioner var bestemt fra proteolytisk acylated peptidene, senere utdraget ion chromatograms (XIC) ble behandlet i Skyline, og tilsvarende lys og tunge peak områder ble eksportert som var til slutt brukt til å beregne området innkvartering. Figur 2A viser en konseptuelle illustrasjon av hvordan forløper-ion XIC kan vises har både lette og tunge peptid videosignaler, og figur 2B presenterer et eksempel på tilsvarende fragmentet ion XICs med fargekoding (rød = lys, blå = tunge ) for å skille fragment ioner som inneholder lysin acylation endringene.
Figur 3 viser data fra et belegg eksperiment, som beskrevet ovenfor analysere pre-definerte prosenter av lys/heavy succinylated BSA generert internt på 1, 10, 50, eller 100% og fastsettelse av succinylation bruk av disse. Importere DIA bruk data til Skyline kan lett visualisering av målet treet, og viser peptid sekvenser og fragment alternativer både for de lette og tunge forløper ionene (figur 3A). Data fra DIA-MS for hver definerte succinylated BSA forholdet avdekket immanently relative forskjeller i forholdet mellom lett-å-tunge y7 ion, høyest rangerte unike fragment ion fra identifiserte peptid-spectra kampen (merket med rødt, Finne 3B). Figur 4 viser en oversikt over behandlet resultatene fra MS2 belegg beregningen som bekreftet succinylation prosenter belegget av input protein, her bestående av pre-succinylated BSA. Målt lysin succinylation innkvartering i 20 proteolytisk succinylated peptider fra kommersielle pre-succinylated BSA, succinylated på definerte prosenter (f.ekspå 0, 1, 10, 50 og 100%) er vist i tabell 2. For hver av 20 proteolytisk BSA peptider, den høyeste rangerte, skille MS2 fragment ion ble brukt til å beregne lysin succinylation (Ksucc) personer, i L/(L+H) %. Samlet MS2-baserte kvantifiseringen viste svært god nøyaktighet ved acylation occupancy selv på lave stoichiometries.
Figur 1: støkiometri arbeidsflyten. (A) proteiner er ruges tre ganger med eddiksyre anhydride -d6 til acetylate uforandret lysin rester. Neste, acetylated proteiner er fordøyd med endoproteinase Glu-C, etterfulgt av HPLC fraksjoneres av proteolytisk peptider ved hjelp av basic-pH reverseres-fase kromatografi. Til slutt, peptider analyseres av LC-MS DIA med variabel forløper vinduet bredder. (B) samme arbeidsflyten brukes til å bestemme den succinylation støkiometri som beskrevet i (A), bortsett fra den tunge acylation reagensen endres til succinic anhydride -d4. Figur tilpasset fra Meyer et al. 4 (J. er Soc. Mass Spectrom., åpne valg). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel på mulig innhentet og støkiometri beregninger. (A) lys (L) og tunge (H) MS1 forløper ioner som inneholder en acetylated lysin avviker med 3 masse enheter. XICs genereres for både lette og tunge isotopanrikning konvolutter angitt i rødt og blått, henholdsvis. (B) kvantifisering fra MS2 fragment ion XICs fra DIA oppkjøp utføres med "skille" lette og tunge fragment ioner som inneholder webområdet acetylation angitt i rødt og blått. Vanlige fragment ioner vises i prikkete svart og inneholder ikke stedet for endring. Figur tilpasset fra Meyer et al. 4 (J. er Soc. Mass Spectrom., åpne valg). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skyline visualisering av succinylated proteolytisk BSA peptid på forskjellige personer nivåer. (A) Skyline målet treet viser proteolytisk peptid LCKsuccVASLRE og dens resulterer fragmentere ioner. (B) Skyline utdraget fragment ion chromatograms på forskjellig succinylation personer. Den høyeste rangerte unike ion, y7, øker i peak området 1, 10, 50 og 100% samkjøre inn prosenten pre-succinylated BSA (generert internt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vurdere BSA acylation støkiometri av pre-succinylated BSA. Fem forskjellige BSA eksempler på definerte prosenter av tunge modifikasjon (f.eks., på 0, 1, 10, 50 og 100%) ble utsatt for MS2 bruk besluttsomhet. Nettstedet Belegningsgrad for 20 succinylated BSA peptider var bestemt fra de høyeste rangerte unike fragment ionene for fem ulike BSA prøver på definerte prosenter av lett modifisering (f.ekspå 0, 1, 10, 50 og 100%). Box Whisker plott viser fordelingen av 20 succinyl peptider, verdiene fra 50% av peptider er i "boksen" (25% persentil til 75. persentil), den øvre whisker angir verdiene fra 75% persentil til maksimum (100%), og den nedre whisker angir verdiene fra 25% persentil til minimum (0% persentil). (J. er Soc. Mass Spectrom., åpne valg). Kvantifisering av målinger kan finnes i tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tid (minutt) | % A | % B |
| 0,00 | 100 | 0 |
| 7.27 | 92 | 8 |
| 45.27 | 73 | 27 |
| 49.27 | 69 | 31 |
| 65.27 | 61 | 39 |
| 72.27 | 40 | 60 |
| 80,00 | 10 | 90 |
| 85,00 | 10 | 90 |
| 86.00 | 100 | 0 |
| 120,00 | 100 | 0 |
| Infusjonshastigheten: 0,7 mL/min | ||
| Buffer A: 10 mM ammonium formiat i vann, pH 10 | ||
| Buffer B: 10 mM ammonium formiat på 90% ACN og 10% vann, pH 10 | ||
| Merk: pH i begge mobile phases justert til 10 med pen ammoniakk | ||
Tabell 1: Gradient frakoblet basic-pH reverseres-fase HPLC fraksjoneres. Lengden til forløpningsfyll: 120 min. Buffer A: 10 mM ammonium formiat i vann, pH 10. Buffer B: 10 mM ammonium formiat på 90% ACN og 10% vann, pH 10.
| L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % | L / L + H i % |
| Ksucc 0% | Ksucc 1% | Ksucc 10% | Ksucc 50% | Ksucc 100% |
| 0,2 | 1.7 | 11.1 | 50,9 | 99,2 |
| 1.2 | 2.3 | 12.3 | 49.4 | 97.6 |
| 2.9 | 3.8 | 14 | 48.6 | 99,5 |
| 0,5 | 1.8 | 11,7 | 50,8 | 99,5 |
| 0,2 | 1.7 | 11.1 | andel på 48,3 | 98,2 |
| 0,2 | 1.2 | 11 | 47.5 | 96.1 |
| 0,3 | 1.6 | 12,8 | 51 | 99,2 |
| 3.7 | 5.2 | 14.7 | 51,9 | 89.5 |
| 1.5 | 1.8 | 12.5 | 47,2 | 91.1 |
| 0,8 | 1.5 | 11.3 | 48,4 | 96.8 |
| 0,2 | 1.6 | 13,9 | 49.7 | 98,9 |
| 0,1 | 1.1 | 10.7 | 48.2 | 98.6 |
| 0,2 | 0,9 | 10.3 | 49.4 | 99.4 |
| 0,5 | 2.5 | 17.2 | 52,3 | 97,5 |
| 0,1 | 3.5 | 20,8 | 51 | 99 |
| 0,3 | 1.9 | 10.7 | 49.6 | 98,2 |
| 2 | 1.7 | 10.9 | 47,7 | 96.3 |
| 0,3 | 1.2 | 10 | 53 | 98 |
| 1.1 | 1.8 | 12,9 | 57,9 | 94.1 |
| 0,2 | 1.4 | 11.6 | 48.6 | 98,8 |
Tabell 2: kvantifisering av målt BSA lysin succinylation innkvartering i 20 proteolytisk succinylated peptider. Succinylated peptider fra kommersielle pre-succinylated BSA, succinylated på definerte prosenter (f.ekspå 0, 1, 10, 50 og 100%). For hver av 20 proteolytisk BSA peptider, den høyeste rangerte, skille MS2 fragment ion ble brukt til å beregne lysin succinylation (Ksucc) personer, i L/(L+H) %.
Discussion
Denne protokollen gir en roman og nøyaktig metode for å kvantifisere områdespesifikke lysin acetylation og succinylation belegg som kan brukes på en hel proteom. Denne metoden er avhengig av måling av endogene lys peptider og eksogene tunge peptider, som er generert i vitro kvantitative kjemiske acylation proteiner med deuterated eddiksyre anhydride -d6 eller succinic anhydride -d4 (figur 1). Lignende metoder har brukt stabil isotopanrikning merking av innfødte uforandret lysin rester og utført området bruk kvantifisering basert på enten forløper ion-bare12 eller fragment ioner DDA oppkjøp13,14. Denne protokollen gjelder flere trinn under eksempel forberedelse til å forbedre acylation effektivitet og utvider kjemiske merkingen til succinylation. Datainnsamling bruker DIA oppkjøp henter både forløper ion og MS2 fragment ion intensiteter over hele synlig massen utvalg, dermed redusere fragment ion forstyrrelser. Analyse og kvantifisering via Skyline og egendefinerte skript egenutviklede at nettstedet bruk beregningen for peptider som inneholder mer enn én lysin rester og flere acylation på ett sted.
Det er flere viktige trinn under eksempel forberedelsen scene av denne protokollen som bør følges nøye. Siden hele protokollen er avhengig av effektiv kjemisk endring av alle lysin rester, er dette trinnet av største betydning. Anhydrider i form reagerer med gratis aminer, slik som inneholder Amin buffer eller miljøgifter molekyler i protein lysate må unngås. Også under det kjemiske per acylation trinnet, sikre at pH reaksjonsblandingen er justert tilbake til pH 8 etter hver av de tre incubations med anhydride reagenser denne reaksjonen Forsurer blandingen, og O-acylation side-reaksjoner kan danne. Videre er fortynning av 8 M urea inneholder reaksjonsblandingen å rundt 0,8 M urea før fordøyelsen og sjekke at pH er i det optimale området viktig for optimal aktiviteten av endoproteinase Glu-C. En annen viktig del av vår protokollen er datainnsamlingssteg og innføring av en DIA arbeidsflyt, som overvinner alle DDA datastikkprøver inkonsekvenser og gir mulighet for kvantifisering på MS2 fragment ion nivå. En Hovedfordelen av DIA metodikken er reduksjon av forstyrrelser som er vanligvis mye mer utsatt og problematisk når kvantifisere MS1 forløper ion signalet (som noen av de tidligere publikasjonene har foreslått).
Flere endringer i arbeidsflyten kan gjøres når forbereder komplekse eksempler. Antall fraksjoner gruppert etter frakoblede basic-pH reverseres-fase HPLC fraksjoneres kan reduseres for å redusere kompleksiteten i grupperte prøvene som vil bli kjøpt av LC/MS. i tillegg lenger brukt kromatografiske graderinger kan også brukes under oppkjøpet å gi bedre peptid separasjon. Alternativt kan flere proteaser brukes å fordøye prøver å produsere et større utvalg av kløyvde peptider og øke dekning av protein lysin rester. Prøveperioden løper og optimalisering kan utføres ved hjelp av kommersielle BSA som inneholder bestemte prosentandeler av acetylation eller succinylation.
En begrensning til denne protokollen er potensielt svak området bruk overvurdering grunn har nevnt andre lysin endringer, for eksempel metylering eller ubiquitination, etc., på samme sted4. Beregnet fra de høyeste områdene av lette og tunge acyl modifikasjoner, L/(L+H), er området belegget basert på antagelsen at den totale mengden endring hos en lysin består av bare endogene 'lys' acylation (L) og kjemisk merket 'tunge' acylation (H). Men kan faktisk totalt acylation innholdet på et nettsted i vivo inneholde andre endringer utover acetylation og/eller succinylation. I tillegg rapporterte isotopanrikning renheten av innkjøpte reagenser eddiksyre anhydride -d6 (99%) og succinic anhydride -d4 (> 98%) kan bidra til en liten overvurdering av opp til 2% (succinyl) eller 1% (acetyl) av den endogene acylation nivå4. Sammen disse liten overestimations legge til vanskelighetene i kvantifisere nettsteder med mindre enn 1% bruk. Store mengder forskjellene mellom hele kjemisk acylated peptider og innfødte acylated peptidene også bidra til mulige området bruk kvantifisering feil, spesielt for lav endogene acylated peptider27. En fersk studie av Weinert et al. 27 fant at redusert overflod forskjellene mellom fullført per-acetylated peptider kan redusere de kvantifisering feil27.
Støkiometri quantifications samlet ved hjelp av denne protokollen kan finne viktig acylation hotspots i et bestemt protein og skjemaet hypoteser for biologiske oppfølgingseksperimenter, som nettstedet-rettet mutagenese av bestemte områder av interesse. Denne protokollen kunne også avsløre kombinerte effekten av lav acylation støkiometri nettsteder som kan utøve indirekte eller subtile påvirkninger på protein strukturell stabilitet og lokalisert mobilnettet miljøer. I tillegg vil gjennomføringen av denne protokollen til å måle acetylation og succinylation og andre mulige lysin acylation endringer utover acetylation unikt gi innsikt i dynamisk acylation effekter på proteiner under forskjellige biologiske forhold.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH National Institute av Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer NIH-NIDDK gir R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM ble støttet av et NIH T32 fellesskap (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Forfatterne bekrefter støtte fra NIH delt instrumentering stipend for TripleTOF 6600 systemet ved Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
| succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
| sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
| Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
| HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
| HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
| urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
| triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
| anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
| 50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
| LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
| LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
| Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
| Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
| Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
| Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
| Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
| indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
| SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
| Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |
References
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325 (5942), 834-840 (2009).
- Meyer, J. G., et al. Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH). J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).
- Hirschey, M. D., Zhao, Y. Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).
- Wagner, G. R., Payne, R. M. Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix. J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).
- Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).
- Zhang, J., et al. Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli. Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).
- Kuhn, M. L., et al. kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation. PLoS One. 9 (4), e94816 (2014).
- Baeza, J., et al. Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome. J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).
- Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells. J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).
- Nakayasu, E. S., et al. A method to determine lysine acetylation stoichiometries. Int J Proteomics. 2014, 730725 (2014).
- Rardin, M. J., et al. MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).
- Svinkina, T., et al. Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Schilling, B., et al. Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli. Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers. Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., et al. PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data. Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).
- Rost, H. L., et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data. Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).
- Lambert, J. P., et al. Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition. Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).
- Bruderer, R., et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).
- Weinert, B. T., et al. Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).
