Vi præsenterer her, objektiv kvantificering af lokationsspecifikke protein acetylation og/eller succinylation belægning (støkiometrisk) af en hel proteomet gennem en ratiometric analyse af endogene ændringer ændringer indført efter kvantitative kemiske acylation ved hjælp af stabile isotop-mærket anhydrider. I kombination med følsomme data-uafhængig erhvervelse massespektrometri fås nøjagtig site belægning målinger.
Posttranslationel modifikation (PTM) af protein lysin rester af NƐ– acylation inducerer strukturelle ændringer, der kan dynamisk regulere protein funktioner, for eksempel ved at ændre enzymatisk aktivitet eller ved mægle interaktioner. Præcis kvantificering af lokationsspecifikke protein acylation belægning eller støkiometrisk, er afgørende for at forstå de funktionelle konsekvenser af både globale low-level støkiometrisk og enkelte højt niveau acylation støkiometrisk af specifikke lysin restkoncentrationer. Andre grupper har rapporteret måling af lysin acetylation støkiometrisk ved at sammenligne forholdet mellem peptid forløber isotoper fra endogene, naturlige overflod acylation og eksogen, tung isotop-mærket acylation indført efter kvantitative kemiske acetylation af proteiner ved hjælp af stabile isotop-mærket eddikesyreanhydrid. Denne protokol beskriver en optimeret tilgang byder adskillige forbedringer, herunder: (1) øget kemiske acylation effektivitet, (2) evnen til at måle protein succinylation ud over acetylation, og (3) forbedret kvantitative nøjagtighed grund reduceret interferenser bruge fragment ion kvantificering fra data-uafhængig erhvervelser (DIA) i stedet for forløber ion signal fra data-afhængige erhvervelse (DDA). De udtrukne toparealer fra fragmentioner for kvantificering også entydigt giver mulighed for differentiering af site-niveau acylation støkiometrisk fra proteolytiske peptider der indeholder mere end én lysin rester, som ikke er muligt at bruge forløber ion signaler til kvantificering. Datavisualisering i Skyline, en open source kvantitative proteomics miljø, giver mulighed for bekvem data inspektion og revision. Sammen, tilbyder denne arbejdsproces objektiv, præcis og nøjagtig kvantificering af lokationsspecifikke lysin acetylation og succinylation belægning af en hel proteomet, som kan afsløre og prioritere biologisk relevante acylation websteder.
NƐ– acylation af protein lysin rester er en vigtig regulator af protein funktion. Lysin acetylation og andre acylations, såsom succinylation, malonylation og glutarylation, menes at regulere stofskiftet, celle signalering og andre cellulære processer1,2,3,4 , og har konsekvenser i stofskiftesygdomme5. Talrige undersøgelser har fundet at lysin acyl ændringer undergå store fold-ændringer under forskellige betingelser i mammale væv og celler linjer5,6,7,8 samt bakterier9,10,11, men disse relative fold ændringer ikke giver indsigt i andelen af det samlede proteinindhold ændres. Undersøgelser rapportering målinger af acylation site belægning er knappe12,13,14, trods relevansen og behov for sådanne undersøgelser, da de giver mere detaljeret end relative fold ændre. For eksempel, kunne en 10-fold ændring repræsentere et websted belægning stigning fra 0,01 til 0,1%, 1 til 10% eller endda 10 til 100%. Præcise støkiometrisk målinger er forpligtet til at fortolke biologisk betydning af acylation og forudsige konsekvenser med hensyn til omfanget af protein strukturelle, og eventuelt, funktionelle ændringer.
En tidligere metode til at kvantificere site belægning udnytter tunge stabil-isotop kemiske mærkning af umodificerede lysin restkoncentrationer efterfulgt af massespektrometri til at måle forholdet mellem endogene “lys” acetylation i forhold til det eksogene, kemisk mærket “tunge” acetyl-lysin bruge forløber ion intensiteter12. En anden nylig undersøgelse af Zhou mfl. 13 beskrevet en lignende tilgang til at vurdere lysin acetylation støkiometrisk, der også ansat en komplet kemiske acetylation af alle umodificeret lysin reststoffer i proteiner med stabil isotop mærkning, men anvendes fragment ionintensiteter som målt ved DDA. Nakayasu mfl. 14 brugt en lignende DDA tilgang, men i stedet bruges forholdet mellem lette og tunge acetyl-lysin immonium ioner til kvantificering. Kvantificering baseret på fragmentioner, immonium eller sekvens ioner (MS2), i de fleste tilfælde resulterer i mindre signal interferens i forhold til forarbejdning intakt peptid forløber ioner (MS1). Dog kan kvantificering af fragmentioner fra DDA-genereret MS/MS-spektre lider af stokastiske prøveudtagning mangler, hvor høj-overflod forløber ioner er mere tilbøjelige til at vælges til MS/MS og således føre til en forudindtagede og ufuldstændige prøveudtagning af forløber ioner.
Denne roman arbejdsproces4 (figur 1) bruger begrebsmæssigt en stabil isotop kemiske mærkning tilgang oprindeligt udviklet af Baeza mfl. 12, men arbejdsprocessen er efterfølgende kombineret med DIA at indsamle begge forløber og flere fragment ion mængder over påviselige massen spænder15,16 giver præcise støkiometrisk beregninger.
Toparealer fra fragment ioner, der indeholder acylation site af interesse, eller ‘skelne fragmentioner’, der bruges til at kvantificere acylation site belægning (figur 2). Fragmentioner, der ikke indeholder modifikation har identiske lette og tunge m/z-værdier, og der bruges for peptid identifikation, men ikke for kvantificering. Skyline software17 bruges til at udtrække forløber og fragment toparealer. Tilstedeværelsen af flere fragmentioner indeholdende en given acylation websted giver fleksibilitet, hvis interferenser er fundet i nogle af fragmentioner. Datavisualisering i Skyline giver mulighed for kritisk eftersyn af lys-til-tunge fragment ion nøgletal. Ud over manuel dataanalyse, blev en open source R pakke skrevet in-house, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), udviklet, som bruger den forløber ion og fragment ion data indsamlet gennem DIA og kvantificerer lokationsspecifikke acylation støkiometrisk fra peptider der indeholder flere lysin rester, en funktion ikke muligt med forløber kun ion-intensitet målinger4.
Denne protokol viser også brugen af endoproteinase Glu-C, som er specifikke for C-terminale kavalergang på glutaminsyre og aspartinsyre restkoncentrationer, i stedet for at bruge trypsin eller Arg-C protease, som sidstnævnte ofte generere meget stor og potentielt formere acylated proteolytiske peptider som følge af blokerede trypsin kavalergang på acylated lysin restkoncentrationer. Den kemiske mærkning procedure blev også udvidet til at omfatte brugen af ravsyre anhydrid (figur 1), hvorved kvantificering af succinylation støkiometrisk succinylation. Ud over forbedringer til forberedelsen, gennemførelsen af peptid fraktionering af offline, grundlæggende pH, faldt omvendt-fase (bRP) adskillelse af peptider yderligere kvantificering interferenser, giver bedre nedtrapning foldning af acylation støkiometrisk i hele proteomet prøver. Sammen, denne metode har og fremhæver flere fordele: (1) øget effektivitet af kemiske acylation; (2) måling af protein succinylation støkiometrisk ud over acetylation; og (3) forbedret kvantificering nøjagtighed. Den forbedrede kvantificering skyldes nedsat interferenser i fragment ion signaler fra DIA sammenlignet med DDA forløber signal, samt gennemførelsen af off-line peptid pre fraktionering af bRP.
Denne protokol giver en roman og præcis metode til at kvantificere lokationsspecifikke lysin acetylation og succinylation belægning, der kan anvendes på en hel proteomet. Denne metode bygger på måling af endogene lys peptider og eksogen tunge peptider, hvor sidstnævnte er genereret i vitro ved hjælp af kvantitative kemiske acylation af proteiner med deutereret eddikesyre anhydrid –d6 eller ravsyre anhydrid –d4 (figur 1). Lignende metoder har brugt stabil isotopiske mærkning af indfødte umodificeret lysin restkoncentrationer og udført site belægning kvantificering baseret på enten forløber ion-kun12 eller fragment ioner fra DDA erhvervelser13,14. Denne protokol gælder flere trin i forberedelsen til at forbedre acylation effektivitet og udvider den kemiske mærkning til succinylation. Indsamling af data ved hjælp af DIA erhvervelser opnår både forløber ion og MS2 fragment ionintensiteter over den hele påviselige masseinterval, hvorved fragment ion interferenser. Analyse og kvantificering via Skyline og brugerdefinerede scripts udviklet in-house tillade site belægning beregning for peptider der indeholder mere end én lysin rester og mere end én acylation på én lokation.
Der er flere kritiske trin under prøven forberedelsen af denne protokol, der bør følges nøje. Da den hele protokol er afhængig af effektiv kemisk modifikation af alle lysin rester, er dette trin af allerstørste betydning. Anhydrider reagere med frie aminer, så Amin-holdige buffer eller forurenende molekyler i protein lysate skal undgås. Også under trinnet kemiske pr. acylation sikre, at pH-værdien af reaktionsblandingen er justeret tilbage til pH 8 efter hver af de tre inkubationer med eddikesyreanhydrid reagens, som denne reaktion forsurer blandingen, og O-acylation side-reaktioner kan danne. Derudover er fortynding af 8 M urinstof-holdige reaktionsblandingen til omkring 0,8 M urinstof forud for fordøjelsen og kontrol, at pH er inden for det optimale interval vigtige for optimal aktiviteten af endoproteinase Glu-C. Et andet centralt element i vores protokol er data indsamling trin og indførelsen af en DIA arbejdsproces, som overvinder uoverensstemmelser DDA data prøveudtagning og som giver mulighed for kvantificering på MS2 fragment ion plan. En største fordel ved metoden DIA er faldet af interferenser, der typisk er meget mere tilbøjelige og problematisk når kvantificere MS1 forløber ion signal (som nogle af de tidligere publikationer har foreslået).
Flere ændringer til arbejdsprocessen kan foretages, når meget komplekse prøver. Antallet af fraktioner samles efter offline basic-pH omvendt fase HPLC fraktionering kan nedskrives til lavere kompleksitet i de poolede prøver, der vil blive erhvervet af LC/MS. desuden længere kromatografisk forløb kan også bruges under erhvervelse at give mulighed for bedre peptid adskillelse. Alternativt kan flere proteaser bruges hen til udtog prøver for at producere et større udvalg af kløvet peptider og øge dækningen af protein lysin rester. Forsøget løber og optimering kan foretages ved hjælp af kommercielle BSA indeholdende specifikke procenter af acetylation eller succinylation.
En begrænsning i denne protokol er potentielt svag site belægning overvurdering skyldes forsvundet andre lysin ændringer, såsom methylering eller ubiquitination, etc., på det samme websted4. Beregnes ud fra toparealer for lette og tunge acyl ændringer, L/(L+H), er websted belægning baseret på den antagelse, at det samlede niveau af modifikation på en lysin site består af kun endogene ‘lys’ acylation (L) og kemisk mærket ‘tunge’ acylation (H). Men den faktiske samlede acylation belægning på et websted i vivo kan omfatte andre ændringer end acetylation og/eller succinylation. Desuden rapporterede isotopiske renheden af indkøbte reagenser eddikesyre anhydrid –d6 (99%) og ravsyre anhydrid –d4 (> 98%) kan bidrage til en lille overvurdering af op til 2% (succinyl) eller 1% (acetyl) af den endogene acylation niveau4. Sammen, disse lille overestimations tilføje at er vanskeligheden at kvantificere websteder med mindre end 1% belægning. Stor overflod forskelle mellem den komplette kemisk acylated peptider og indfødte acylated peptider også bidrage til potentielle site belægning kvantificering fejl, især for lav endogen acylated peptider27. En nylig undersøgelse af Weinert mfl. 27 fundet, at nedsat overflod forskelle mellem færdig pr. acetyleret peptider kan reducere kvantificering fejl27.
Støkiometrisk kvantificeringer indsamlet ved hjælp af denne protokol kan lokalisere vigtige acylation hotspots i et bestemt protein og form hypoteser for biologiske Opfølgning eksperimenter, som site-directed mutagenese af visse steder af interesse. Denne protokol kan også afsløre kombinerede effekter af lav acylation støkiometrisk sites, der kunne udøve indirekte eller subtile påvirkninger på protein strukturelle stabilitet og lokaliseret cellulære miljøer. Derudover ville gennemførelsen af denne protokol til at måle acetylation og succinylation og andre mulige lysin acylation ændringer ud over acetylation unikt give indsigt i de dynamiske acylation virkninger på proteiner under forskellige biologiske forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme NIH-NIDDK give R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM blev støttet af en NIH T32 fellowship (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Forfatterne anerkender støtte fra NIH delt instrumentation grant for TripleTOF 6600 system på instituttets Buck (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |