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Developmental Biology

Pax7 और Laminin एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कंकाल मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं की पहचान

doi: 10.3791/57212 Published: April 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

सैटेलाइट कोशिकाओं की सटीक पहचान विभिन्न शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत उनके कार्यों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । इस लेख इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित धुंधला द्वारा वयस्क कंकाल की मांसपेशी वर्गों पर उपग्रह कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ।

Abstract

इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक प्रभावी तरीका है कि ऊतक वर्गों पर विभिन्न कोशिका प्रकार की पहचान करने में मदद करता है. आदेश में वांछित सेल जनसंख्या का अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट सेल मार्कर के लिए एंटीबॉडी ऊतक वर्गों पर लागू कर रहे हैं. वयस्क कंकाल की मांसपेशी में, उपग्रह कोशिकाओं (SCs) स्टेम कोशिकाओं है कि मांसपेशियों की मरंमत और पुनर्जनन में योगदान कर रहे हैं । इसलिए, यह कल्पना और विभिंन शारीरिक स्थितियों के तहत उपग्रह कोशिका जनसंख्या का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । कंकाल की मांसपेशी आराम में, SCs बेसल लेमिना और myofiber प्लाज्मा झिल्ली के बीच रहते हैं । myofibers पर या कोशिका संस्कृति में SCs की पहचान के लिए एक आम तौर पर इस्तेमाल मार्कर युग्मित बॉक्स प्रोटीन Pax7 है । इस अनुच्छेद में, कंकाल की मांसपेशी वर्गों पर एक अनुकूलित Pax7 इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है कि गैर विशिष्ट धुंधला और पृष्ठभूमि को कम करता है । बेसल लेमिना के एक प्रोटीन (laminin) को पहचानता एक अन्य एंटीबॉडी भी SCs की पहचान करने में मदद करने के लिए जोड़ा गया था । इसी तरह के प्रोटोकॉल भी ब्याज के अतिरिक्त प्रोटीन के लिए Pax7 और एंटीबॉडी के साथ डबल या ट्रिपल लेबल प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

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कंकाल की मांसपेशी multinucleated मांसपेशी कोशिकाओं से बना है, myotubes बुलाया, myofibers, जो संकुचन के माध्यम से बल और आंदोलनों उत्पन्न में आयोजित किया । सबसे कंकाल की मांसपेशियों, कुछ craniofacial मांसपेशियों को छोड़कर, एक अस्थाई भ्रूण संरचना से प्राप्त कर रहे है एक somite1कहा जाता है । Myogenic अग्रदूत कोशिकाओं उपकला somite से myoblasts बनने के लिए फाड़ना । Myoblasts आगे myocytes में अंतर है कि फ्यूज बहु nucleated myofibers बनाने के लिए myotubes बनने के लिए । इसके बाद के संस्करण की प्रक्रिया myogenesis कहा जाता है और जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी विनियमित नियंत्रण की विशेषता है. Myogenic पुरोगामी व्यक्ती Pax3 आणि Pax7, जबकि myoblasts व्यक्ती MyoD आणि/या Myf5 आणि myocytes व्यक्ती myogenin आणि myosins,. मांसपेशियों की वृद्धि एक प्रक्रिया है जिसमें myofibers मौजूदा तंतुओं (हाइपरप्लासिया) में और अधिक myonuclei को शामिल करके और मांसपेशी फाइबर आकार (अतिवृद्धि) में वृद्धि से बड़ा हो जाता है4. मांसपेशियों की वृद्धि के दौरान, वहां myogenic कोशिकाओं है कि वे अंतर और स्वयं को नवीनीकृत कर सकते है में सेल गुण स्टेम है की एक स्थाई स्रोत है । इन कोशिकाओं को sarcolemma (myofiber की कोशिका झिल्ली) और बेसल लेमिना5के बीच उनके भौतिक स्थान के आधार पर उपग्रह कोशिकाओं को पद है । SCs तेजी से किशोर अवस्था (जन्मोत्तर चूहों के पहले 2-3 सप्ताह) में मांसपेशियों की वृद्धि करने के लिए योगदान है, लेकिन वयस्क मांसपेशियों6आराम में quiescent हो जाते हैं । उल्लेखनीय, वे फिर से मांसपेशियों को घायलों के जवाब में सक्रिय किया जा सकता है और नई मांसपेशी कोशिकाओं में अंतर करने के लिए क्षतिग्रस्त मांसपेशी की मरंमत7

स्टेम सेल गुण दोनों बुनियादी मांसपेशी जीवविज्ञान और मांसपेशियों की बीमारियों के उपचार के लिए प्रासंगिक SCs का अध्ययन करते हैं8. नतीजतन, यह पिछले दशकों में गहन जांच का क्षेत्र रहा है । SCs,१०की आनुवंशिकी और epigenetics को विदारक करने में जबर्दस्त प्रगति हुई है. सीटू में SCs को अलग और पहचानने में शामिल तकनीक विकसित की गई और11तरह से साथ अनुकूलित किया गया । Immunofluorescent धुंधला Pax7 के लिए सहित विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से SCs की पहचान की अनुमति देता है । हालांकि, कमी और SCs के छोटे आकार के एक मजबूत ऑटो प्रतिदीप्ति वयस्क कंकाल मांसपेशी ऊतक के साथ संयुक्त दृश्य चुनौतीपूर्ण प्रदान करते हैं । यहां, हम एक immunofluorescent धुंधला Pax7 के लिए माउस मांसपेशी ऊतक के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन और zebrafish मांसपेशी12के लिए एक मौजूदा पद्धति पर आधारित है । इसके अलावा, एक Laminin एंटीबॉडी एक विशिष्ट fluorophore के साथ लेबल को बेसल लेमिना जिसके तहत SCs स्थित है की पहचान करने के लिए कार्यरत है । यह प्रोटोकॉल लगातार सभी परीक्षण शारीरिक स्थितियों और विकासात्मक चरणों के तहत Pax7-सकारात्मक SCs और myogenic अग्रदूतों के दृश्य की अनुमति देता है ।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल में, वयस्क चूहों के पूर्वकाल हिंद अंग मांसपेशियों (2-6 महीने), tibialis पूर्वकाल (टा) और प्रसारक digitorum लंग्स (EDL), उनके इम्यूनोफ्लोरेसेंस पर दाग SCs प्रदर्शन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में कार्यरत थे । चूहों और मांसपेशियों ऊतक विच्छेदों से निपटने के सभी कदम पशु देखभाल और NIAMS/NIH के उपयोग समिति (ACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. काटना द टा/EDL मांसपेशी से माउस हिंद अंग

  1. Euthanize के ACUC के दिशानिर्देशों के तहत एक कं2 भर इच्छामृत्यु चैंबर में माउस को NIH । यदि जरूरत हो तो सर्वाइकल विस्थापन करें ।
  2. किसी विच्छेदन पैड (लापरवाह) पर माउस फ़ेस-अप रखें । अपने पेट की त्वचा पर ७०% इथेनॉल स्प्रे । कट एक 1-2 सेमी क्षैतिज माउस पेट त्वचा के केंद्र पर खोलने, तो माउस पैर की ओर खोलने खींच द्वारा माउस त्वचा । माउस हिंद अंग के एक तरफ बेनकाब ।
  3. दो तेज संदंश का प्रयोग करें: एक का प्रयोग करें tendons कि टा संलग्न करने के लिए पकड़/EDL, और एक दूसरे का उपयोग करने के लिए तोड़ने के लिए और टा/EDL को कवर प्रावरणी कतरनी । एक बार प्रावरणी से खुली है, संदंश के तेज टिप का उपयोग करें टा/EDL टिबिया हड्डी से टीए/EDL मांसपेशी के नीचे टिप चलाकर अलग ।
  4. कैंची से टखने tendons काट जबकि अभी भी उंहें संदंश के साथ पकड़े । टा/EDL टखने से घुटने के लिए अनुदैर्ध्य लाइन के साथ कैंची के साथ मांसपेशी ट्रिम कर दीजिए, जबकि संदंश के साथ टखने की ओर से EDL उठाने/ कट घुटने साइड tendons को अलग करने के लिए पूरे टा/EDL से टिबिया ।

2. क्रायो-टा/EDL मांसपेशी की embedding

  1. एक कंटेनर में एक तरल नाइट्रोजन स्नान तैयार करें, जैसे, एक तरल नाइट्रोजन देवर कुप्पी । एक छोटे प्लास्टिक चोंच (लगभग 20 मिलीलीटर) आधा-भरा में methylbutane डालो । फिर इसे फ्रीज करने के लिए लिक्विड नाइट्रोजन बाथ में चोंच डाल दें । कुछ मिनटों के बाद जांच लें कि methylbutane जम गया है ।
    नोट: तरल नाइट्रोजन सूखी बर्फ की एक बाल्टी से बदला जा सकता है, लेकिन ठंड समय धीमी है ।
  2. एक छोटे प्लास्टिक सिरिंज गोताख़ोर के समतल सतह पर EDL के लिए विच्छेदित टा/ पूरी तरह से टा/EDL इष्टतम काटने तापमान (O.C.T.) यौगिक (ठंड मध्यम) की कुछ बूंदों के साथ कवर ।
  3. तरल नाइट्रोजन स्नान के बाहर methylbutane चोंच ले लो और एक गर्म वस्तु के साथ सतह गल (उदा, कैंची का हैंडल) । जल्दी से O.C.T. कवर टा/EDL में गोताख़ोर पर पिघल methylbutane के लिए स्नैप-फ्रीज ऊतक डुबकी ।
  4. गोताख़ोर से संदंश के साथ एंबेडेड ऊतक अलग, और यह एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में डाल दिया । तरल नाइट्रोजन में ट्यूब प्लेस करने के लिए यह दुकान जबकि अधिक नमूनों की हैंडलिंग ।
    नोट: एंबेडेड ऊतक अल्पावधि (6 महीने) के लिए लंबी अवधि (2 साल) या-20 डिग्री सेल्सियस के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

3. Cryostat खोदी

  1. एक cryostat का एक नमूना धारक के केंद्र पर O.C.T. यौगिक की एक बूंद जोड़ें । O.C.T. यौगिक लगभग जम जाता है जब तक प्रतीक्षा करें । जल्दी से O.C.T. यौगिक के लिए एंबेडेड टा EDL छड़ी, सीधा टखने के साथ-साथ नीचे और घुटने के ऊपर की ओर ।
  2. एक cryostat पर नमूना धारक माउंट, 10 µm अंतराल पर ऊतक में कटौती, और एक स्लाइड पर 4-8 वर्गों के साथ ठंढ लेपित स्लाइडों पर क्रायो-वर्गों इकट्ठा ।
  3. कमरे के तापमान पर वर्गों को रात भर के लिए कम से 3 घंटे के लिए सूखी ।
    नोट: हालांकि रात भर के लिए फ्रीजर में वर्गों सुखाने या अब स्वीकार्य है, यह अनिवार्य रूप से autofluorescence वृद्धि होगी । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, ०.५ h के लिए अनुभागों को सुखाएं, फिर निर्धारण और दाग-धब्बों के साथ तुरंत आगे बढ़ें ।
  4. किसी स्लाइड बॉक्स में स्लाइड् स संग्रहीत करें और उंहें तुरंत उपयोग करे, या बाद में उपयोग के लिए स्लाइड् स-८० ° या-20 ° c को संग्रहीत करे ।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए रिएजेंट की तैयारी

  1. बफ़र्स तैयार करें:
    1. 10x पंजाब से 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 2 एल तैयार करें ।
    2. 1x पंजाब में 16% पीएफए से 4% paraformaldehyde (पीएफए) की ४० मिलीलीटर तैयार करें ।
    3. ०.१% ट्राइटन-१०० के साथ PBST के 2 एल: 1x पंजाबियों तैयार करें ।
    4. PBST-B: PBST 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    5. PBST-B-G के 10 मिलीलीटर तैयार करें: PBST 2% BSA और 5% सामान्य बकरी सीरम के साथ ।
    6. समाधान अवरुद्ध की 1 मिलीलीटर तैयार करते हैं । PBST-बी में AffiniPure फैब टुकड़ा बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) (1:10) पतला
    7. 1x साइट्रेट बफर के २०० मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
      ध्यान दें: ऊपर दिए गए समाधानों की मात्रा कम 5 स्लाइड्स के लिए पर्याप्त हैं । खंड स्लाइड्स की संख्या और स्लाइड कंटेनर के आकार के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
  2. एंटीबॉडी दाग तैयार करें:
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी (कार्य एकाग्रता): तैयार १.२ मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण से कमजोर Pax7 मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी (IgG1) (1-5 µ g/ml) + Laminin polyclonal खरगोश एंटीबॉडी (0.5-2 µ g/ml) + MF20 मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी (IgG2b) (0.5-2.5 µ g/ एमएल) में PBST-बी-जी.
      नोट: MF20 मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी (IgG2b) वैकल्पिक है ।
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी (काम एकाग्रता): कमजोर बकरी विरोधी माउस IgG1 द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के १.२ मिलीलीटर तैयार पार adsorbed माध्यमिक एंटीबॉडी, Alexa Fluor ४८८ (0.5-2 µ जी/एमएल) + बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) अत्यधिक पार-adsorbed माध्यमिक एंटीबॉडी, एलेक्सा Fluor Plus ५५५ (0.5-2 µ g/ml) + बकरी एंटी-माउस IgG2बी क्रॉस-adsorbed सेकंडरी एंटीबॉडी, alexa Fluor ६४७ (0.5-2 µ ग्राम/एमएल) में PBST-बी-जी.
      नोट: Alexa Fluor ६४७ वैकल्पिक है ।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला कदम

  1. reहाइड्रेट और पीएफए के साथ क्रायो-वर्गों को ठीक ।
    1. स्लाइड बॉक्स से टा/EDL क्रायो-अनुभाग स्लाइड के कुछ निकालें । कमरे के तापमान पर स्लाइड-होल्डिंग ट्रे में स्लाइड को गर्म करना ।
    2. स्लाइड पर सभी क्रायो-अनुभागों को शामिल करने वाले क्षेत्र को आरेखित करने के लिए लिक्विड ब्लॉकर पेन (पीएपी पेन) का उपयोग करें. इस सर्कल के समाधान स्लाइड बंद बहने से रोक देगा ।
    3. एक प्रयोगशाला धुएं डाकू को ट्रे ले लो । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वर्गों को ठीक करने के लिए वृत्तीय क्षेत्र के भीतर स्लाइड पर 4% पीएफए के 300-500 µ एल जोड़ें. एक स्लाइड कंटेनर में कम से कम 3x 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के साथ पीएफए बाहर धो लो ।
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त और एक खतरनाक अपशिष्ट है; यह देखभाल के साथ संचालित किया जाना चाहिए और एक खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में निपटारा ।
  2. Antigen पुनर्प्राप्ति
    1. २०० मिलीलीटर की साइट्रेट बफ़र के साथ एक और स्लाइड कंटेनर भरें ।
    2. स्लाइड कंटेनर में स्थानांतरित । 10 मिनट के लिए उच्च दबाव मोड में स्लाइड पकाने के लिए एक दबाव कुकर के लिए स्लाइड के साथ कंटेनर स्थानांतरण ।
    3. 10 मिनट के लिए पानी draining के साथ कंटेनर शांत हो जाओ सभी स्लाइड PBST (२०० एमएल) के साथ एक नए कंटेनर के लिए स्थानांतरण, कम से PBST के लिए स्लाइड कुल्ला के साथ ंयूनतम 3x 5 मिनट ।
  3. अवरुद्ध
    1. स्लाइडों के सूखने से बचने के लिए नम वातावरण बनाने के लिए स्लाइड् स धारण करने वाली ट्रे को पानी से भिगोया हुआ kimwipes जोड़ें ।
    2. स्लाइड को वापस ट्रे में ले जाएं, और प्रत्येक स्लाइड पर समाधान ब्लॉकिंग के २०० µ l जोड़ें । एक टोपी के साथ ट्रे को कवर और अवरुद्ध 30 मिनट के लिए विकसित करते हैं ।
      नोट: Pax7 एंटीबॉडी एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है, तो माउस मांसपेशी ऊतकों कि उच्च पृष्ठभूमि बनाता में माउस आईजीजी के विशिष्ट बंधन है । AffiniPure फैब टुकड़ा बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) का उपयोग माउस को ब्लॉक पर माउस विशिष्ट बाध्यकारी ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें ।
    1. स्लाइड कंटेनर में एक बार PBST के साथ स्लाइड कुल्ला । फिर वापस स्लाइड धुंधला ट्रे को ले जाएं ।
    2. प्रत्येक स्लाइड पर प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के २०० µ एल लागू करें, एक टोपी के साथ ट्रे को कवर, और प्रतिक्रिया 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करते हैं ।
      नोट: 4 ° c पर रातोंरात प्रतिक्रिया सबसे अच्छा परिणाम देता है, हालांकि कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया विकासशील संतोषजनक परिणाम देता है । मायोसिन MF20 एंटीबॉडी मिश्रण में एक ट्रिपल (Pax7, Laminin, MF20) लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए जोड़ा जा सकता है । MF20 दाग मांसपेशी तंतुओं विभेदित । यह कदम भी PBST-B-G के साथ एक और अवरुद्ध कदम के रूप में कार्य करता है निम्न चरण में माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी एंटीबॉडी) से संभावित विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए.
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी लागू करें ।
    1. बाहर PBST के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर कम 3x 5 मिनट में धो लें ।
    2. प्रत्येक स्लाइड करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के २०० µ एल जोड़ें, और प्रतिक्रिया के लिए कमरे के तापमान पर विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए ंयूनतम 1 ज ।
      नोट: Pax7 + Laminin के लिए, बकरी विरोधी माउस IgG1 alexa ४८८ और बकरी विरोधी खरगोश alexa ५५५ का उपयोग करें ।
      Pax7 + Laminin + MF20 के लिए, मिश्रण में बकरी विरोधी माउस IgG2b Alexa ६४७ जोड़ें ।
    3. बाहर PBST के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी धो कम 3x 5min ।
  6. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) काउंटर-दाग और बढ़ते
    1. स्लाइड कंटेनर में PBST में DAPI (1:20000) का पतला होना, उदा., DAPI के 10 µ l को २०० मिलीलीटर में PBST ।
    2. 3 मिनट के लिए DAPI कंटेनर में स्लाइड दाग ।
    3. PBST के साथ DAPI को बाहर धो लो 5 मिनट से कम 5x ।
    4. बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट । coverslips के साथ स्लाइड कवर ।
      चेतावनी: DAPI विषाक्त और खतरनाक है; यह देखभाल के साथ संभाला और खतरनाक अपशिष्ट बोतल में निपटारा किया जाना चाहिए ।

6. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी

नोट: immunofluorescent धुंधला प्रोटोकॉल ऊपर रिपोर्ट या तो एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट या फोकल माइक्रोस्कोप के साथ SCs दृश्य की अनुमति देगा । यह शुरू में SCs की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यहां कुछ अनुशंसित चरण दिए गए हैं, जिनकी मदद की जा सकती है ।

  1. स्लाइड्स पर अनुभागों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए DAPI चैनल और कम आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग करें.
  2. आवर्धन कम से उच्च तक स्विच करें । SCs का निरीक्षण करने के लिए, एक 20X उद्देश्य आवश्यक है) ।
  3. SCs की पहचान करने के लिए एक ही समय में Pax7 और Laminin संकेतों दोनों का पालन करने के लिए ४८८ (FITC)/555 (Rhodamine) के लिए दोहरी फ़िल्टर घन का उपयोग करें । इस सेटिंग के तहत, Pax7 धुंधला के संकेत पृष्ठभूमि शोर करने के लिए एक बेहतर कंट्रास्ट है ।
  4. जल्दी से FITC से DAPI को सही ढंग से SCs की पहचान के लिए चैनल वैकल्पिक । सभी SCs को Pax7/DAPI-positive होना चाहिए ।

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Representative Results

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उपरोक्त चरणों के बाद, SCs सफलतापूर्वक एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत वयस्क आराम मांसपेशी वर्गों में visualized किया जा सकता है (चित्रा 1) । हालांकि वयस्क मांसपेशी ऊतक फाइबर के कुछ प्रकार में मजबूत ऑटो प्रतिदीप्ति है, चमकीले Alexa श्रृंखला रंजक पृष्ठभूमि शोर को दूर कर सकते हैं और संकेत (चित्र 1a, ख; तीर सिर) बाहर खड़ा है. दो फोटॉन फोकल माइक्रोस्कोपी व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 1a) की तुलना में एक अपेक्षाकृत क्लीनर छवि (चित्र 1b) कब्जा । इसी प्रोटोकॉल भी किशोर चूहों (चित्रा 2a), माउस भ्रूण (चित्रा बी2), और घायल वयस्क मांसपेशी ऊतकों (चित्रा 3) की मांसपेशियों के ऊतकों पर अच्छी तरह से काम किया. किशोर और भ्रूण मांसपेशियों के ऊतकों में, वहाँ अधिक सक्रिय SCs (चित्रा 2a, तीर) या Pax7-सकारात्मक myogenic अग्रदूतों (चित्रा बी, तीर) है कि अपेक्षाकृत बड़ा नाभिक है; इसलिए, यह अपेक्षाकृत वयस्क चूहों की तुलना में छोटे चूहों की SCs कल्पना करने के लिए आसान है (चित्रा 2 बनाम चित्रा 1). घायल मांसपेशी ऊतक में, वहां भी अधिक सक्रिय Pax7-सकारात्मक SCs (चित्रा 3) ।

Figure 1
चित्रा 1: Pax7 और Laminin इम्यूनोफ्लोरेसेंस की छवियां माउस वयस्क आराम मांसपेशी ऊतकों पर । EDL वयस्क चूहों की मांसपेशी वर्गों Pax7 (हरे) और Laminin (लाल) एंटीबॉडी के साथ immunostained थे, और काउंटर-DAPI (नीला) के साथ दाग । (a) छवि एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया । (B) एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कैप्चर की गई छवि । स्केल बार्स: ५० µm. तीर: कम autofluorescence के साथ तंतुओं से SCs । ऐरोहेड: उच्च autofluorescence के साथ तंतुओं से SCs. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Pax7 और Laminin या छोटे चूहों की मांसपेशी ऊतकों पर MF20 इम्यूनोफ्लोरेसेंस की छवियाँ. EDL युवा चूहों की मांसपेशी वर्गों Pax7 (हरा) और Laminin (लाल) या MF20 (रानी) एंटीबॉडी के साथ immunostained थे, और काउंटर-DAPI (नीला) के साथ दाग । (a) जन्मोत्तर day 8 (P8) मांसपेशी धारा एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया । () भ्रूण दिवस १७.५ (ई 17.5) मांसपेशी धारा एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया । स्केल पट्टियां = ५० µm. arrows: P8 मांसपेशी खंड (A) में SCs; प्रतिनिधि Pax7 + ई 17.5 मांसपेशी अनुभाग में myogenic पुरोगामी, जबकि वहां छवि () में और अधिक कर रहे हैं । इन दोनों छवियों को भी एक प्रकाशित पेपर13 (एसचित्रा 3 डी) और (एसआंकड़ा 1b), क्रमशः में छवियों उत्पंन कच्चे डेटा से संशोधित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: घायल वयस्क मांसपेशी ऊतकों पर Pax7 और Laminin इम्यूनोफ्लोरेसेंस की एक प्रतिनिधि छवि । TA घायल वयस्क मांसपेशी ऊतकों की EDL मांसपेशी वर्गों (चोट के बाद 7 दिन) Pax7 (हरा) और Laminin (लाल) एंटीबॉडी के साथ immunostained थे, और काउंटर-DAPI (नीला) के साथ दाग । छवि एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया था । स्केल बार = ५० µm । तीर: खंड में SCs । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल Pax7/MF20 की एक विधि पर आधारित था zebrafish कंकाल की मांसपेशी12पर धुंधला । उपयोग किए गए समाधान और ब्लॉकिंग चरण समान या समान हैं । इस्तेमाल किया एंटीबॉडी समान हैं । समायोजित कदम माउस मांसपेशी ऊतक और SCs की सुविधाओं पर आधारित थे । पहले, Laminin एंटीबॉडी मिश्रण में मदद कल्पना और SCs की स्थिति की पुष्टि करने के लिए जोड़ा गया था । यह विशेष रूप से 488/555 के दोहरे फिल्टर घन का उपयोग करते समय माइक्रोस्कोप के तहत SCs की संख्या की गणना करने के लिए उपयोगी था; यह बहुत अनुसूचित जाति-प्राप्त Pax7 संकेत शोर फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि से बाहर खड़ा करने के लिए बढ़ाया । दूसरा, के बाद से Pax7 एंटीबॉडी इस्तेमाल एक माउस एंटीबॉडी है, हम एक माउस-on-माउस अवरुद्ध कदम (चरण ५.३) के लिए माउस आईजीजी के विशिष्ट बंधन से उत्पंन पृष्ठभूमि को कम जोड़ा । तीसरा, antigen पुनर्प्राप्ति चरण (चरण ५.२) पीएफए निश्चित ऊतकों पर Pax7 एंटीबॉडी के साथ धुंधला के लिए महत्वपूर्ण था ।

इसी प्रोटोकॉल छोटे चूहों (पिल्ले और भ्रूण) (चित्रा 2) की मांसपेशियों के ऊतकों पर इस्तेमाल किया गया था । वास्तव में, यह अपेक्षाकृत एक ही प्रोटोकॉल द्वारा वयस्क चूहों की तुलना में पिल्ले में SCs कल्पना करने के लिए आसान था । यह वयस्क मांसपेशी ऊतक के साथ आगे बढ़ने से पहले अनुभव हासिल करने के लिए पिल्ले पर SCs धुंधला के साथ शुरू करने के लिए उपयोगी हो सकता है । प्राथमिक एंटीबॉडी (५.४ कदम) के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण भी हर प्रयोग में आवश्यक है । एक समान प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अतिरिक्त तेल प्रसंस्करण कदम के साथ आयल वर्गों पर इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, आयल वर्गों के लिए एक उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि है, जो SCs है कि अपेक्षाकृत कमजोर Pax7 अभिव्यक्ति है से संकेत नकाबपोश हैं । यदि संभव हो तो आयल सेक्शन के प्रयोग से बचें । एक ही प्रोटोकॉल भी घायल मांसपेशी ऊतकों है कि कई SCs है पर कार्यरत है, और है पिल्ला मांसपेशी ऊतक (चित्रा 3) के साथ प्राप्त उन लोगों के लिए इसी तरह के परिणाम दिया था ।

मांसपेशी ऊतक autofluorescence स्वच्छ इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणाम प्राप्त करने में प्रमुख बाधा का प्रतिनिधित्व करता है14। क्रायो-वर्गों के सुखाने समय को कम करने autofluorescence कम कर सकते हैं और नए सिरे से तैयार क्रायो-वर्गों का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है. अंय प्रोटोकॉल के समान15, पृष्ठभूमि को और कम करने के लिए माउस-ऑन-माउस ब्लॉकिंग चरण की आवश्यकता है ।

जबकि दोनों व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और फोकल माइक्रोस्कोप आंख टुकड़े के माध्यम से SCs दृश्य के लिए प्रभावी थे, फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए उच्च गुणवत्ता वाले चित्र पर कब्जा करने के लिए सिफारिश की है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम माइक्रोस्कोप और तकनीकी मदद प्रदान करने के लिए NIAMS लाइट इमेजिंग अनुभाग धन्यवाद । MF20 और Pax7 एंटीबॉडी विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक के तत्वावधान में विकसित से प्राप्त किया गया और जैव विज्ञान विभाग के द्वारा बनाए रखा, आयोवा विश्वविद्यालय, आयोवा शहर । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के NIAMS के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने समर्थन दिया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

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References

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Pax7 और Laminin एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कंकाल मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं की पहचान
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Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).More

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).

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