Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

doi: 10.3791/57212 Published: April 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Exakt identifiering av satellit celler är viktigt för att studera deras funktioner under olika fysiologiska och patologiska förhållanden. Denna artikel presenterar ett protokoll för att identifiera satellit celler på vuxen skelettmuskulatur sektioner av immunofluorescens-baserade färgning.

Abstract

Immunofluorescens är en effektiv metod som hjälper till att identifiera olika celltyper på vävnadssnitt. För att studera önskad cell befolkningen, appliceras antikroppar för viss cell markörer på vävnadssnitt. I vuxen skelettmuskulatur är satellit celler (SCs) stamceller som bidrar till muskel reparation och förnyelse. Det är därför viktigt att visualisera och spåra satellit cell befolkningen under olika fysiologiska förhållanden. Vilande skelettmuskulatur, bosatta SCs mellan basala lamina och myofiber plasmamembranet. En vanligt förekommande markör för att identifiera SCs på myofibers eller i cellkultur är parade box proteinet Pax7. I den här artikeln presenteras en optimerad Pax7 immunofluorescens protokoll på skelettmuskulaturen sektioner som minimerar icke-specifik färgning och bakgrund. En annan antikropp som känner igen ett protein (laminin) av den basala lamina lades för att identifiera SCs. liknande protokoll kan även användas att utföra dubbel eller trippel märkning med Pax7 och antikroppar för ytterligare proteiner av intresse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skelettmuskulaturen är sammansatt av Multinucleära muskelceller, kallas myotubes, organiserade i myofibers, som genererar kraft och rörelser genom kontraktion. Mest skelettmuskulaturen, utom vissa kraniofaciala muskler, härrör från en tillfällig embryonal struktur som kallas en somite1. Myogenic prekursorceller delaminate från de epiteliala somite att bli myoblasts. Myoblasts ytterligare differentieras till myocyter som säkring till bli myotubes att bilda flera kärnförsedda myofibers. Ovanstående process kallas myogenesis och kännetecknas av temporally-reglerade kontroll av genuttryck. Myogenic prekursorer uttrycka Pax3 och Pax7, medan myoblasts express MyoD och/eller Myf5 och myocyter express myogenin och myosins2,3. Muskeltillväxt är en process där myofibers bli större genom att införliva mer myonuclei i befintliga fibrer (hyperplasi) och genom en ökning av muskel fiber storlek (hypertrofi)4. Under muskeltillväxt finns det en hållbar källa till myogenic celler som har stamceller egenskaper att de kan differentiera och själv förnya. Dessa celler kallas satellit celler baserat på deras fysiska plats mellan sarcolemma (cellmembranet av myofiber) och basala lamina5. SCs kraftigt bidra till muskeltillväxt i den juvenila fasen (de första 2-3 veckorna av postnatal möss), men blivit quiescent i vila vuxen muskel6. Anmärkningsvärt, kan de återaktiveras svar till muskel skadar och differentieras till nya muskelceller att reparera den skadada muskeln7.

Stem Cellegenskaper gör studien av SCs relevanta för både grundläggande muskel biologi och behandlingar av muskel sjukdomar8. Som ett resultat, har det varit ett område med intensiv undersökning under de senaste decennierna. En enorma framsteg har gjorts i dissekera den genetik och epigenetik av SCs9,10. Tekniker som används i isolera och identifiera SCs i situ var utvecklad och optimerad längs väg11. Immunofluorescerande färgning möjliggör identifiering av SCs med hjälp av specifika antikroppar, inklusive som för Pax7. Dock återge liten och liten storlek av SCs kombinerat med en stark auto-fluorescens vuxen skelettmuskulaturen vävnad visualiseringen utmanande. Här beskriver vi ett Immunofluorescerande färgning protokoll optimerad för mus muskelvävnad för Pax7 och baserat på en befintlig metod för zebrafiskar muskel12. Dessutom är en Laminin antikropp märkt med en distinkt fluorophore anställd för att identifiera den basala lamina som SCs är belägna. Detta protokoll kan konsekvent visualisering av Pax7-positiv SCs och myogenic prekursorer under alla testade fysiologiska förhållanden och utvecklingsstadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I detta protokoll användes främre bakbenen musklerna i vuxna möss (2-6 månader), tibialis anterior (TA) och extensor digitorum longus (EDL), som ett exempel att utföra den immunofluorescens färgning på deras SCs. Alla steg hantering av möss och muskel vävnad dissektioner har godkänts av djur vård och användning kommittén (ACUC) av NIAMS/NIH.

1. dissekera TA/EDL muskler från mus bakben

  1. Avliva musen i en CO2 fyllda dödshjälp kammare enligt riktlinjerna i ACUC av NIH. Utföra cervikal dislokation om det behövs.
  2. Sätta att musen ansikte upp på en dissektion pad (liggande). Spray 70% etanol på sin mage hud. Skär en 1-2 cm öppning horisontellt på mitten av musen magen huden, sedan deskin musen genom att dra öppningen mot mus fötter. Exponera en sida av mus bakbenen.
  3. Använda två vassa pincetten: använda en för att hålla senor som fäster den TA/EDL till ankeln och använda annan att bryta och skeva fascian som täcker den TA/EDL. När fascia är skalade bort, använda den skarpa spetsen av tången för att lossa den TA/EDL från tibia benet genom att köra spetsen under TA/EDL muskeln.
  4. Avskurna senor fotled med sax medan du fortfarande håller dem med hjälp av tången. Trimma muskeln med en sax längs den längsgående linjen av den TA/EDL från vristen till knäet samtidigt lyfta den TA/EDL från fotled sida med hjälp av tången. Skär knä-sida senor för att lossa det hela TA/EDL från skenbenet.

2. Cryo-inbäddning av TA/EDL muskeln

  1. Förbereda ett flytande kväve bad i en behållare, t.ex., en flytande kväve Dewar kolv. Häll methylbutane i en liten plast bägare (ca 20 mL) till halvfullt. Lägg sedan bägaren i flytande kväve badet att frysa den. Efter några minuter, kontrollera att methylbutane är fryst.
    Obs: Den flytande kvävgasen kan ersättas av en hink med torris, men frysa tiden är långsammare.
  2. Låg den dissekerade TA/EDL på den plana ytan av en liten plast sprutkolven. Helt täcka den TA/EDL med några droppar av Optimal styckning temperatur (O.C.T.) förening (frysning mediet).
  3. Ta methylbutane bägaren ur flytande kväve badkaret och Tina ytan med en varm objekt (t.ex., handtaget på sax). Dopp i O.C.T. omfattas snabbt TA/EDL kolven till den smält methylbutane till snapin-frysa vävnaden.
  4. Lossa den inbäddade vävnaden från kolven med pincett, och sätta det i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Placera röret i flytande kväve för att lagra den samtidigt hantera fler prover.
    Obs: Inbäddade vävnaden kan lagras vid-80 ° C för långsiktig (2 år) eller -20 ° C på kort sikt (6 månader).

3. kryostaten snittning

  1. Lägg en droppe av O.C.T. sammansatta på mitten av en preparathållaren av en kryostaten. Vänta tills O.C.T. föreningen är nästan stelnat. Snabbt sticka den inbäddade TA/EDL till O.C.T. förening, vinkelrätt med vrist-sidan ner och knä-Sidan upp.
  2. Montera preparathållaren på en kryostaten, skära vävnaden 10 µm mellanrum och samla cryo-avsnitten på frost belagda bilder med om 4-8 sektioner på en bild.
  3. Torka avsnitten i rumstemperatur i minst 3 h till över natten.
    Obs: Även om torkning avsnitten i frysen över natten eller längre är acceptabla, det kommer oundvikligen öka autofluorescens. För bästa resultat, torr avsnitten för 0,5 h, Fortsätt sedan med fixering och färgning steg omedelbart.
  4. Samla in bilder i en bild box och använda dem omedelbart, eller lagra bilderna vid-80 ° C eller -20 ° C för senare användning.

4. beredning av reagens för immunofluorescens färgning

  1. Förbereda buffertar:
    1. Förbered 2 L av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) från 10 x PBS.
    2. Förbereda 40 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS från 16% PFA.
    3. Förbered 2 L av PBST: 1 x PBS med 0,1% Triton-100.
    4. Förbereda 50 mL PBST-B: PBST med 2% bovint serumalbumin (BSA).
    5. Förbereda 10 mL PBST-B-G: PBST med 2% BSA och 5% normalt get Serum.
    6. Laga 1 mL blockering lösning. Späd AffiniPure Fab Fragment get antimus IgG (H + L) (1:10) i PBST-B.
    7. Förbereda 200 mL 1 x citratbuffert.
      Obs: Volymerna av lösningarna ovan är tillräckliga för minst 5 rutschkanor. Volymer ska justeras enligt antalet bilder och storleken på bilden behållarna.
  2. Förbereda antikropp fläckar:
    1. Primära antikroppar (arbetande koncentration): förbereda 1,2 mL av primär antikropp mix genom att späda ut Pax7 monoklonal mus-antikropp (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin polyklonala kanin-antikropp (0,5-2 µg/mL) + MF20 monoklonal mus-antikropp (IgG2b) (0,5-2,5 µg / mL) i PBST-B-G.
      Obs: MF20 monoklonal mus-antikropp (IgG2b) är valfria.
    2. Sekundära antikroppar (arbetande koncentration): förbereda 1,2 mL av sekundär antikropp mix genom att späda ut get antimus IgG1 cross-adsorberat sekundär antikropp, Alexa Fluor 488 (0,5-2 µg/mL) + get anti-kanin IgG (H + L) mycket cross-adsorberat sekundär antikropp, Alexa Fluor Plus 555 (0,5-2 µg/mL) + get antimus IgG2b cross-adsorberat sekundär antikropp, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) i PBST-B-G.
      Obs: Alexa Fluor 647 är valfritt.

5. immunofluorescens färgning steg

  1. Rehydrera och fixa cryo-avsnitten med PFA.
    1. Ta bort några TA/EDL cryo-avsnittet bilder från rutan bild. Varma bilder i ett bildspel-anläggning fack vid rumstemperatur.
    2. Använd en flytande blockerare penna (PAP pen) för att rita ett område som omfattar alla cryo-delar i bilden. Denna cirkel förhindrar lösningar flyter bort i bilden.
    3. Ta facket till dragskåp laboratorium. Tillsätt 300-500 µL av 4% PFA in i bilden inom inringade området fixar avsnitten i rumstemperatur i 10 min. tvätta ut PFA med 1 x PBS minst 3 x 5 min i en bild behållare.
      FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt och farligt avfall; Det bör vara drivs med omsorg och omhändertas i en behållare för farligt avfall.
  2. Antigen retrieval
    1. Fyll en annan bild behållare med 200 mL citratbuffert.
    2. Över bilderna till behållaren. Överföra behållaren med bilderna till en tryckkokare att laga bilder i högtryck läge i 10 min.
    3. Kyla ner behållaren med tömning av vatten i 10 min. överföra alla bilder till en ny behållare med PBST (200 mL), skölj glasen med PBST för minst 3 x 5 min.
  3. Blockering
    1. Lägga till vatten-indränkt kimwipes facket håller bilderna ska skapa en fuktig miljö för att undvika uttorkning av bilderna.
    2. Flytta bilder tillbaka till facket och tillsätt 200 µL blockerande lösning på varje bild. Täck facket med ett lock och låt blockering utveckla för 30 min.
      Obs: Pax7 antikropp är en mus monoklonal antikropp, så det finns ospecifik bindning av mus-IgG i mus muskelvävnad som skapar hög bakgrund. Använda den AffiniPure Fab Fragment get antimus IgG (H + L) blockerar mus-på-mouse ospecifik bindning.
  4. Gäller primära antikroppar.
    1. Skölj glasen med PBST en gång i behållaren bild. Sedan flytta bilderna tillbaka till färgning facket.
    2. Tillsätt 200 µL av primär antikropp mix på varje bild, täcka facket med ett lock och låt reaktionen utvecklar i rumstemperatur i 1 h eller vid 4 ° C för övernattning.
      Obs: Övernattning reaktionen vid 4 ° C ger det bästa resultatet, även om utveckla reaktionen vid rumstemperatur ger tillfredsställande resultat. Myosin MF20 antikroppen kan läggas i mixen för att utföra en trippel (Pax7, Laminin, MF20) märkning. MF20 fläckar differentierade muskelfibrer. Detta steg fungerar också som ett blockerande steg med PBST-B-G att minska potentiella ospecifik bindning från sekundära antikroppar (Get antikroppar) i följande steg.
  5. Tillämpa sekundära antikroppar.
    1. Tvätta ut de primära antikropparna med PBST i rumstemperatur minst 3 x 5 min.
    2. Tillsätt 200 µL av sekundär antikropp mix till varje bild, och reaktionen att utveckla i rumstemperatur i minst 1 h.
      Obs: För Pax7 + Laminin, Använd Get antimus IgG1 Alexa 488 och geten anti-kanin Alexa 555.
      För Pax7 + Laminin + MF20, lägga till get antimus IgG2b Alexa 647 i mixen.
    3. Tvätta ut de sekundära antikropparna med PBST minst 3 x 5min.
  6. DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol) kampen mot fläcken och montering
    1. Späd DAPI (1:20, 000) i PBST i bild behållare, t.ex., 10 µL av DAPI i 200 mL PBST.
    2. Fläcken bilder i behållaren DAPI för 3 min.
    3. Tvätta ur DAPI med PBST för minst 5 x 5 min.
    4. Montera bilder med monteringsmedium. Täcka bilderna med coverslips.
      Varning: DAPI är giftiga och farliga; Det bör hanteras med omsorg och omhändertas i flaskan med farligt avfall.

6. fluorescerande mikroskopi

Obs: Protokollet Immunofluorescerande färgning rapporterade ovan gör att SCs visualisering med antingen ett wide-fältet fluorescerande eller confocal Mikroskop. Kan det inledningsvis svårt att identifiera SCs. Här är några rekommenderade steg som kan vara till hjälp.

  1. Använd DAPI kanal och låg förstoringsgrad för att visualisera avsnitten på bilderna.
  2. Växla förstoringen från låg till hög. För att observera SCs, krävs åtminstone ett 20 X mål).
  3. Använd dubbla filter kuben för 488 (FITC) / 555 (rodamin) att iaktta både Pax7 och Laminin signalerar samtidigt att identifiera SCs. Under denna inställning har signalera av Pax7 färgning en bättre kontrast till bakgrundsljud.
  4. Snabbt växla kanalen från FITC till DAPI att korrekt identifiera SCs. Alla SCs bör Pax7 DAPI-positiva.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter ovanstående steg, SCs kan visualiseras framgångsrikt i adult vilande muskel sektioner i fluorescerande Mikroskop (figur 1). Även vuxna muskelvävnaden har stark auto-fluorescens i viss typ av fibrer, de ljusa Alexa serien färgämnena kan övervinna bakgrundsljud och signalen sticker ut (figur 1A, B; pilen huvuden). De två-photon konfokalmikroskopi fångar en relativt renare bild (figur 1B) än wide-fältet fluorescerande mikroskopet (figur 1A). Samma protokoll också fungerade bra på muskelvävnad juvenil möss (figur 2A), musembryon (figur 2B), och skadade vuxna muskelvävnad (figur 3). I juvenil och embryonala muskelvävnad, det finns mer aktiverade SCs (figur 2A, pilar) eller Pax7-positiv myogenic prekursorer (figur 2B, pilar) som har relativt större kärnor; Det är därför förhållandevis lättare att visualisera SCs yngre möss än vuxna möss (figur 2 kontra figur 1). I skadade muskelvävnaden, det finns också mer aktiveras Pax7-positiv SCs (figur 3).

Figure 1
Figur 1: bilder av Pax7 och Laminin immunofluorescens på mus adult vilande muskelvävnad. TA/EDL muskel delar av vuxna möss var immunostained med Pax7 (grön) och Laminin (röd) antikroppar och kontra fläckade DAPI (blå). (A) bild erövrat i wide-fältet fluorescerande Mikroskop. (B)-bild som tagits under en confocal Mikroskop. Skala barer: 50 µm. pilar: SCs från fibrer med låg autofluorescens. Pilspetsar: SCs från fibrer med hög autofluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: bilder av Pax7 och Laminin eller MF20 immunofluorescens på muskelvävnad yngre möss. TA/EDL muskel sektioner av yngre möss var immunostained med Pax7 (grön) och Laminin (röd) eller MF20 (magenta) antikroppar och kontra fläckade DAPI (blå). (A) Postnatal dag 8 (P8) muskel avsnitt fångas under en confocal Mikroskop. (B) embryonala dag 17,5 (E17.5) muskel avsnitt fångas under en wide-fältet fluorescerande Mikroskop. Skala barer = 50 µm. pilar: SCs i P8 muskel avsnitt (A). representativ Pax7 + myogenic prekursorer i E17.5 muskel avsnitt, medan det finns mer i bilden (B). Dessa två bilder ändrades från rådata som även genererade bilder i ett publicerat papper13 (figur 3Ds) och (sfigur 1B), respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: en representativ bild av Pax7 och Laminin immunofluorescens på skadade vuxna muskelvävnad. TA/EDL muskel sektioner av en skadad vuxen muskelvävnad (7 dagar efter skada) var immunostained med Pax7 (grön) och Laminin (röd) antikroppar och kontra fläckade DAPI (blå). Bilden togs under en confocal Mikroskop. Skalstapeln = 50 µm. pilar: SCs i avsnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det ovannämnda protokollet baserades på en metod för Pax7/MF20 färgning på zebrafiskar skelettmuskulaturen12. Lösningarna används och blockera steg är identiska eller liknande. De antikroppar som används är identiska. Justerade stegen bygger på funktionerna i mus muskelvävnad och SCs. Först lades Laminin antikropp i mixen för att visualisera och bekräfta placeringen av SCs. Det var särskilt bra att räkna antalet SCs under lupp när du använder dubbla filter kuben av 488/555; Detta förbättras avsevärt SC-derived Pax7 signalen att stå ut från bullriga autofluorescent bakgrunden. För det andra, eftersom den Pax7 antikropp används är en mus-antikropp, vi lagt till ett mus-på-mouse blockerande steg (steg 5.3) för att minska bakgrunden följd av ospecifik bindning av musen IgG. Det tredje var steget antigen retrieval (steg 5.2) kritisk för färgning med Pax7 antikropp på PFA fasta vävnader.

Samma protokoll användes på muskelvävnad yngre möss (pups och embryon) (figur 2). I själva verket var det relativt lättare att visualisera SCs i valpar än i vuxna möss av samma protokoll. Det kan vara bra att börja med färgning SCs på valpar att få erfarenhet innan du fortsätter med vuxen muskelvävnad. En negativ kontroll utan primär antikroppar (steg 5,4) är också nödvändigt i varje experiment. En liknande protokoll användes framgångsrikt på paraffin avsnitt med extra paraffin bearbetningssteg. Dock tenderar i paraffin avsnitt att ha en högre autofluorescens bakgrund, som maskerade signaler från SCs som har relativt svagare Pax7 uttryck. Om möjligt, Undvik att använda paraffin avsnitt. Samma protokoll var också anställd på skadad muskelvävnad som har många SCs, och gav liknande resultat som erhålls med den pup muskelvävnad (figur 3).

Muskel vävnad autofluorescens representerar det största hindret att få ren immunofluorescens resultat14. Minskar torktiden cryo-avsnitt kan minska autofluorescens och med nylagade cryo-sektioner rekommenderas varmt. Liknar andra protokoll15, mus-på-mouse blockerande steget krävs för att ytterligare minska bakgrunden.

Medan både wide-fältet fluorescerande Mikroskop och confocal Mikroskop var effektivt för SCs visualisering genom ögonmusslor, rekommenderas användning av confocal Mikroskop fånga bilder av hög kvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar NIAMS Light Imaging avsnittet för att tillhandahålla Mikroskop och teknisk hjälp. MF20 och Pax7 antikropparna erhölls från utvecklande studier Hybridomteknik banken utvecklades under överinseende av NICHD och underhålls av den institutionen för biologiska vetenskaper, The University of Iowa, Iowa City. Detta arbete stöds av den intramurala forskning Program av NIAMS av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (23), 5830-5837 (2017).
  2. Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
  3. Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13, (24), 3171-3178 (1999).
  4. Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22, (6), 479-496 (2016).
  5. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  6. Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14, (2), 82-91 (2008).
  7. Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (2), 127-133 (2011).
  8. Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163, (4), 409-417 (2014).
  9. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, (6), 628-633 (2007).
  10. Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280, (17), 4014-4025 (2013).
  11. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10, (10), 1612-1624 (2015).
  12. Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300, (2), 736-746 (2006).
  13. Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25, (8), 789-794 (2011).
  14. Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22, (2), 180-187 (2004).
  15. Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460, (7255), 627-631 (2009).
Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).More

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter