Summary
ערוץ microfluidic עם ובמכסה deformable מציע בקרת זרימה, טיפול חלקיקים, ערוץ מימד ההתאמה האישית, אחרים reconfigurations במהלך השימוש. אנו מתארים שיטה בדיית ערוץ microfluidic עם מהמשטחים של מערך של סיכות המאפשר לשנות את צורתם.
Abstract
רכיבים Microfluidic צריך להיות צורות שונות כדי לממש פונקציות microfluidic מפתח שונים כגון ערבוב, הפרדה, חלקיק השמנה או תגובות. ערוץ microfluidic מתעוות גם לאחר ייצור תוך שמירה על צורת הערוץ מאפשר reconfigurability ייתכן גבוהה. Reconfigurability הזה נדרש בפונקציות microfluidic מפתח כזה שקשה להשיג במערכות קיימות microfluidic "reconfigurable" או "משולב". נתאר שיטת הזיוף של ערוץ microfluidic עם sidewall deformable המורכב מערך מיושר רוחבית של הקצוות של הסיכות מלבני. הגורמים הפינים בכיוונים האורך שלהם משנה עמדות הקצה של הפינים, וכך, את הצורה של ערוץ discretized ובמכסה. פערים pin יכול לגרום דליפה לא רצויים או הדבקה על סיכות סמוכים הנגרמת על ידי כוחות מניסקוס. כדי לסגור את הפערים pin, יש לנו הציג מלוי הפער ההשעיה מבוססת פחמימן-fluoropolymer בליווי מכשול אלסטומריים. מכשיר reconfigurable microfluidic זה יכול ליצור זרימה חזקה הזמנית בערוץ, או לעצור את זרימת בכל אזור של הערוץ. תכונה זו יקל, לפי דרישה, הטיפול של תאים, ברגים, בועות גז, ללא נוזלים, אפילו אם קיומה או אופן הפעולה שלהם אינו ידוע בזמנו של ייצור.
Introduction
Microfluidic התקני - מיקרו בגודל לשלוט כמויות קטנות של נוזלים וזורמת שלהם - מציעים המזעור של נהלים ביו לפורמט "צ'יפ", ניידות, לעתים קרובות, כל אחד מהחדרים מכיל. כפי שמתואר זה התבצעה סקירה1, רכיבים שונים של microfluidic, המורכב רווחים ותכונות חיוביות פותחו כדי לממש פונקציות fluidic basic ו מפתח כמו ערבוב, הפרדה, חלקיק השמנה או תגובות.
בזמן הפעולה של התקנים microfluidic רבים נקבע בשלבי התכנון, סוגים מסוימים של microfluidic התקנים מאפשרים ייצור שלאחר שינויי מבנה או ההתנהגות שלהם. כאן אנחנו קוראים לתכונה זו "reconfigurability". Reconfigurability של מערכות microfluidic בדרך כלל מפחית את זמן ועלות הנדרשים לעצב מכשיר, ו/או מאפשר התאמה אישית של הפריסה microfluidic או פונקציות לאורך זמן.
שתואר קודם לכן microfluidic reconfigurable התקני נחלקים לשלוש הקטגוריות הבאות. הראשון, דפורמציה של ערוצי אלסטומריים מאפשר זרימה המחירים וכיוונים להשתנות במהלך השימוש. כדי לזכות reconfigurability, ערוצי אלסטומריים הפאלונים מעוותים על ידי כוחות חיצוניים, לשליטה שונים כגון לחץ פנאומטי מקורות2, ברייל מפעילים3או דחיסה איטום4. בשלב השני, התקנים reconfigurable להסתמך על עיצובים מודולרי, כגון חיבורים מעגלים fluidic רב שכבתית, ערוצים מודולרית עם מגנטי, המבוסס על אבובים מיקרופלואידיקה5. השלישי, המכשיר עצמו הוא לא reconfigurable, אבל microdroplet תחבורה על אלקטרודה מערכים (המכונה לעתים קרובות מיקרופלואידיקה דיגיטלי)6,7 ותלוי microfluidic מבוססי טיפה התקנים8 לאפשר לפי דרישה מיתוג של הזרם או התוואי של נוזל.
למרות זאת, רבים של האלה reconfigurations מוגבלים ברמות טופולוגי, מאקרוסקופית. לדוגמה, התקנים משולבים microfluidic רבים לעצור זרימת או לשנות את כיוון הזרימה על-ידי כיווץ microchannels באזורים מוגדרים מראש. עם זאת, המיקום ואת מספר אזורי תהיה מכווצת אינם reconfigurable. למרות מיקרופלואידיקה דיגיטלי יש מגוון רחב של נוזל טיפול יכולות, זורם אפשרי צריך להיות במידה רבה מוגבל על ידי הנפח לכל droplet. בנוסף, כאשר תאים מתורבתים ב כזה טיפות תא תרבות המדיה, נדרש מאמץ נוסף כדי למנוע אידוי, פיזור גז של טיפות ולהימנע osmolality הלם ושינוי פתאומי pH.
להבין ערוץ תכונה ברמת reconfigurability, הצענו מכשיר microfluidic בעל מטלטלין ובמכסה שכלל מערכים של רכיבי מחשב להגדיר באופן דינאמי מחדש אותן בתצוגה שימוש9. כדי ליצור deformable sidewall, סיכות מלבני קטן היו מוכנים כך בשני הקצוות של הסיכות שהוגדרו קטע sidewall הזזה הפינים מותר להרכב של sidewall שאיפשר תחבורה או המתבנת של תאים, בועות חלקיקים בתוך הערוץ. כדי למזער את נפח מת ולמקסם את reconfigurability, המרחק בין הפינים סמוכים היה צריך להיות ממוזער. עם זאת, נימיות חזקה על הקטנים הפערים בין סיכות חיבור מבפנים וגורם מחוץ microchannel דליפה של נוזל כלשהו הזנת הפער pin, גרימת מדיה אידוי, זיהום חיידקי או ציטוטוקסיות, ובסופו של דבר תא . מוות. לכן, פיתחנו ערוצים reconfigurable microfluidic ללא דליפה discretized sidewall מסוג לעמוד pin מחזורית פעולות תרבות תא לטווח ארוך10.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול לבנות microfluidic תא תרבות מכשיר עם sidewall discretized זה יכול לקבוע מחדש את תצורת בעקבות עלייה הדרגתית אזור התרבות תאים. Airtightness של בקירות הצדדיים ערוץ בדיד נבדק באמצעות קרינה פלואורסצנטית הדמיה. את התאימות של תרבות התא ואת היכולת של התא המתבנת יוערכו באמצעות תרבית תאים על שבב.
מערכת microfluidic זו מתאימה בכל פעם עיצוב הערוץ המתאים לא יכול להיות מראש ויש לשנות על פי דרישה. לדוגמה, מערכת זו ניתן להשתמש כדי להתאים את רוחב הערוץ וקצב זרימת המבוססת על צמיחת תאים או ההעברה, נמטודות פעיל זרימה או השמנה או חפצים קטנים אחרים, המתנהגים באופן בלתי צפוי בתעלה, או כדי לקבל דוגמאות raw שונים או bioproducts את זה לא עדיין נוצרת בזמנו של עיצוב.
Protocol
1. תחריט של סיכות (איור 2א)
- Degrease סיכות מלבני על ידי טבילה אצטון.
- Passivate את הסיכות על ידי אנו ממליצים 4 מיליליטר 10% חומצה חנקתית, ואז מחממים את הפתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור.
- Sonicate את הסיכות במים יונים למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות חומצה, לייבש במגבת נייר. לטבול הפינים ב- 0.5 מ של סוכן שחרור עובש 2 h.Sonicate הפינים במים יונים למשך 5 דקות.
- לפברק צלחת איכול (איור 2C).
- צייר או לחרוט שני קווים מקבילים עם פער 4 מ מ על משטח זכוכית בעזרת סרגל.
- להחיל על-עמיד כימי, חתך מלבני צמיגות נמוכה דבק למשטח אחד של שני coverglasses.
- בונד את coverglasses לחתוך שתי בשקופית זכוכית-פער של 4 מ מ. השתמש הקו המקביל כמדריך.
- לוותר על שתי שורות של דבק סיליקון על המנה איכול (ראה איור 2C את המיקום ואת הגודל של קו המתאר).
הערה: תבנית תלת-ממד מודפס (קובץ דגם STL כלולה כחומר משלים) תסייע לצייר קווים בקלות ובדייקנות. - לשים את הסיכות על המנה איכול כך הטיפים מ מ באורך 2 הקצוות שלהם ישר שקועים בתוך התבנית קו אגד. לוותר על הדבק שוב כדי להבטיח כי הפינים מכוסים לחלוטין וכדי לצייר מתאר. להעביר את המנה תחריט fermenter humidified מחומם ל- 38 מעלות צלזיוס. חכה כאן הלילה כדי לרפא את הדבק.
- להוסיף 0.2 מ ל חומצה חנקתית 0.5 M 0.2 מ ל 5.0 M חומצה הידרוכלורית באיטיות בתוך בקבוקון זכוכית.
זהירות: התערובת, הידוע גם בשם Aqua regia, היא מאד קורוזיבי ועוד פוטנציאל נפץ. ללבוש כפפות גומי חומצה-הוכחה ומשקפת בטיחות, בזהירות בעת טיפול חומצות. אף פעם לא לאחסן את הפתרון. להפחית חומצה חנקתית ככל האפשר כדי להקטין את התוקפנות שלה. - לשים את הצלחת חריטה על גזייה מחומם ל 65 ° C. שופכים 0.4 מ של התערובת חומצה באזור חשפו הפינים. חכה 10 דקות ולהעביר את החומצה גביע.
- לנטרל כל החומצה הנותרים כולל באזור חרוט פינים עם 5 מ של 0.8 מ' הפתרון סודיום ביקרבונט במים יונים.
- הסר את הסיכות המנה תחריט מאת למשוך את הפין longitudinally עם פינצטה. Sonicate את הסיכות במים יונים למשך 5 דקות ולאחריו sonication ב אצטון במשך 5 דקות.
- Passivate האזור חרוט הפינים כמו שלב 1.2.
- בדוק את הרוחב של הפינים חרוט עם מיקרוסקופ חנות עם reticle. שינוי משך הזמן איכול שמתואר 1.7 כך הרוחב של אזור חרוט הוא 0.2 ± מ מ 0.02 נקודות.
- להעביר את הסיכות בקבוקון זכוכית המכיל 5 מ של 70% אתנול. להביא את המבחנה ברדס למינריות. לאסוף את הסיכות הבקבוקון ולאפשר להם להתייבש.
2. ייצור של סיליקון סלאב מאגרים ורווח פינים.
- לפברק תבנית עבור מרחב סיכות, sidewall קבוע של התהליכים ליטוגרפית טיפוסי.
- המעיל שקופית degreased זכוכית עם 1 מ"ל של אפוקסי שלילי photoresist בעזרת coater ספין של 1,000 סל ד. יבש photoresist על פלטה 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות חזור על שלב זה פעם אחת.
- ספין המעיל השכבה השלישית של photoresist אותו ב- 2,000 סל ד בשקופית זכוכית עם photoresist מצופה. יבש את photoresist על גזייה 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לחשוף השכבה photoresist mJ/ס מ 4502 של 365-nm אור אולטרה סגול UV ממקור אור ספוט דרך סרט photoplotted. אופים photoresist חשופות על גזייה 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפתח את photoresist על ידי התזת ממיס (2-מתוקסי-1-methylethyl אצטט) באמצעות תרמיליים, מייבשת עם גז חנקן.
- מקם את השקופית זכוכית עם photoresist בדוגמת בתחתית צלחת פלסטיק.
- יוצקים prepolymer של polydimethylsiloxane (PDMS) אל העובש ועד לעובי של 3 מ מ. Debubble את prepolymer PDMS ב desiccator ואקום ב-800 kPa עבור 10 דקות.
- לרפא את prepolymer PDMS בתנור ב 65 ° C עבור ה 1 Demold המתים PDMS חלקית נרפא באמצעות אזמל. מלא לרפא את PDMS בתנור ב 120° C עבור 1 h.
- לאורך התבנית מנחה, חתוך קצוות לא סדיר הרחק מן המתים PDMS עם האזמל אותו. להפוך גם מדויק ונקי חתך ככל האפשר, במיוחד על פני השטח המגדיר חריץ הכניסה (ראה איור 1) עבור הפינים.
- לנקב חורים 2 מ מ קוטר כניסה/יציאה אל קצות התעלה המרכזית של לוח PDMS באמצעות ביופסיה אגרופים. באופן דומה, לנקב חורים 1 מ מ- dimeter בקצוות של הערוץ פתח אוויר. ראה איור 1א' ערוץ ובפריסה המיקום של החורים האלה.
3. הרכבה של ההתקן עם מקום ייצור של מילוי הפער ומכשול.
- לפברק אסיפה microchannel.
- לטבול את 10 × 20 מ מ מס ' 4 coverglass בפתרון ניקוי מחוממת עד 60 ° צלזיוס למשך 10 דקות.
- שוטפים את coverglasses עם מים יונים פעמיים ומייבשים ב 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- פלזמה-בונד המתים PDMS ל coverglass:
- הכנס לשכת ואקום coater לרעוד. להוציא המתים PDMS (ערוץ תכונה בצד למעלה), את נקי 10 × 20 מ מ מס ' 4 coverglass.
- להתחיל שאיבה למטה לחדר כדי 60 אבא ליצור אוויר ואקום פלזמה (20 מא) ב-30 s.
- מיד לפרוק את התא. בונד לצד התכונה הערוץ של PDMS סלאב כדי coverglass עם קצוות שלהם מיושר.
- מקם את השכבות בונדד בתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להביא את השכבות בונדד ברדס למינריות באמצעות מיכל סטרילי. לעקר אותם עם אור UV למשך 30 דקות.
- בשכונה למינריות, להכניס את הסיכות לחריץ כך הקצוות שלהם יוצרים sidewall אחרים של microchannel. סיכות סמוכים צריך להיות שונה אורך להימנע ממגע של שני הקצוות אנכי (ראה איור 1B). מרווח גדול בין הקצוות האנכיים עדיפה. מרחב של (N-1) × (רוחב pin) אפשרית כאשר N מיני סיכות באורכים שונים pin (L איור 2א) מוכנים.
- לפברק בסיס ( איור 2B).
- לבצע או קריאת קובץ חלק של הבסיס ולבצע את שני הקבצים בקרת נומרית (NC) (המכיל "שבילים" מסובכים; כלול כחומר משלים) באמצעות תוכנות CAD/CAM. קובץ ה-NC משלימה הראשון משתמש של 4 מ מ קוטר סוף מיל והשני מ מקוטר 1 לסיים מיל.
- תהדק את לוח מ מ בעובי 3 ברור polymethylmethacrylate (PMMA) על גבי טחנה CNC.
- פתח את קובץ ה-NC הראשון בבקר של טחנה NC (CNC) המחשב. התקנת טחנה סוף 4 מ מ לטחנה CNC ואתר חלק אפס על-ידי נגיעה הטחנה הקצה ללוח PMMA. הפעל את הקוד NC כדי לחתוך את הלוח.
הערה: לעתים לפוצץ את הטיפ מיל סיום עם אוויר דחוס להסרת השבב וקירור. - חזור על 3.2.3 באמצעות הקובץ השני NC וטחנה קצה 1 מ מ.
- Degrease את החלקים במכונה עם חומר ניקוי ויבש עם מגבת נייר. לרסס את החלקים עם 70% אתנול ולהביא אותם ברדס למינריות.
- לפברק מילוי הפער pin ומכשול אלסטומריים:
הערה: השלבים 3.3.1 - 3.3.7 צריכה להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית בשכונה למינריות.- מכינים מילוי הפער על ידי ערבוב וזלין לבן ואבקת טפלון בבית 2:1 יחס לפי משקל. Homogenize את התערובת בעזרת מהמגן אולטרה סאונד.
- שופכים הפער מלוי לתוך מזרק מנפק. להוסיף בוכנה ודחף אותו כך שימלא את קצה המזרק. לצרף מחט, לדחוף שוב על הבוכנה עד קצה המחט הוא מלא. באופן דומה, להכין מזרק מנפק עם פומפה, מחט, ומלא עם דבק סיליקון.
- להתחבר כל מזרק מתקן פנאומטיים באמצעות שפופרת של מתאם. התאם את הלחצים dispense דבק סיליקון, מלוי 250 kPa ו 280 kPa.
- לוותר על דבק סיליקון לקצה של כיס של הבסיס. המקום של 10 × 20 מ מ מספר 4 coverglass על הכיס ולחץ בחוזקה כדי להתחבר.
- לוותר על דבק סיליקון עד לעומק של-1 מ מ כדי לצייר שני מקטעים לאורך שני החריצים החיצוני של הבסיס. לוותר על מילוי הפער עד לעומק של 1 מ מ, כדי לצייר מקטעים לאורך החריץ אחרים.
- לוותר על דבק סיליקון לקצה של כיס נוסף. מקום אסיפה microchannel (3.1) על הכיס ולחץ בחוזקה כדי להתחבר.
- חזור על 3.3.5 להבטחת מילוי הפער והן דבק סיליקון מלא להטביע את הסיכות על שיש פתח ב חריצי.
- לשים את המכשיר במיכל סטרילי כגון תיבת נירוסטה עם מכסה. העברת המכולה fermenter humidified מחומם ל- 38 מעלות צלזיוס. בשכונה למינריות, לרפא את מחסום אלסטומריים ליום אחד.
- להזיז כל אחד להצמיד עד 1 מ מ לאורך סיכות סמוכים כדי לשחרר את הסיכות המכשול אלסטומריים נרפא.
- לחטא את ההתקן עם אור UV למשך 30 דקות.
4. הערכה של המכשיר Microfluidic
- לזהות דליפות באמצעות קרינה פלואורסצנטית
- פתח את microchannel באמצעות כלי בסדר או רובוט בשולחן העבודה. להפוך את רוחב הערוץ כמו עקבי לאורך כל התעלה ככל האפשר.
- לדלל צבע ניאון ירוק עם מים יונים-10 מיקרומטר, כדי להפוך את פתרון זריחה.
- להוסיף אחת מהיציאות קצה של microchannel עם micropipettor קרינה פלואורסצנטית פתרון. שלב זה ימלא את הערוץ עם הפתרון.
- לשים את המכשיר microfluidic שתי פיסות של נייר סופג רטוב עם יונים מים בצלחת פלסטיק גדולים. דגירה המנה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפחות 24 שעות.
- שיא פלורסצנטיות ירוק תמונות של microchannel עם מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה עם מצלמת מיקרוסקופ.
- לפתוח את התמונות פלורסנט עם תוכנה ניתוח התמונה המתאימה ואשר שיש זליגת (זריחה ירוק)-הממשק של המילוי הפער וסיכות.
- תאי הזרע כדי microchannel.
- להכין כלי התרבות התא המכיל תאים confluent 70-80% (תלוי סוגי תאים). ניתוק, להשעות את התאים מדיום הגידול.
- Centrifuge התאים (המהירות ואת הזמן לסמוך על סוגי תאים), האחות של המדיום.
- Resuspend התאים עם כמות קטנה של מדיום. לספור את התאים עם מונה תא ולהתאים את צפיפות תא 1.5 × 106 × 107 1.5 תאים/מ.
- פתח את microchannel באמצעות כלי בסדר או רובוט בשולחן העבודה (איור 1B) כדי להפוך ערוץ ישר 400-מיקרומטר-wide. להתאים את עמדות pin כדי להפוך sidewall כמו שטוח לאורך התעלה ככל האפשר. להוסיף אחד של יציאת קצה של microchannel ההשעיה תא ולמלא את הערוץ.
- אתר אחד המגדיר sidewall של האזור להתחיל תרבות. תחת מיקרוסקופ הפוכה, סגור את שני פינים סמוכים כדי להקיף את התאים באזור התרבות תאים.
- סגור את כל הפינים מן סדר מן הפנימית כדי החיצוני לגרש את כל התאים מן התעלה. בעדינות תשאף השעיה מן היציאות סוף, וכן להוסיף בינוני אליהם.
- דגירה המכשיר כפי שמתואר 4.1.4. כאשר תאים הם כ- 70-80% confluent, לאט פתח pin כדי להרחיב את אזור התרבות.
Representative Results
הקמת microchannel reconfigurable מוצג באיור1. סיכות מלבני מרובים הונחו על מצע זכוכית, היו מוכנים כך הצד הארוך של הפינים היו במגע. גיליון PDMS עם חורים מנוקבים, הפסקה של עומק אותו כמו גובה ה-pin כיסה את הקצוות של הסיכות להקים ערוץ כניסה/יציאה המאגרים ערוץ התקרה, sidewall אחר מול הקיר ערוץ כללה הסיכות. האזור מוקף סיכות, קיר (אחד מהפנים של הגיליון PDMS) ואת המצע זכוכית בצורת ערוץ microfluidic אחד.
כפי שתואר קודם לכן, reconfigurability של המערכת המוצעת microfluidic מושגת על ידי סיכות קטנות רבות הניח במקביל עם פערים קטן אך שאינו אפס. הבעיה בדוחות קודמים היה זרם חזק שנוצר באמצעות הפערים על ידי ההשפעה נימי. כדי להתגבר על בעיה זו, הפערים הראשונים היו מלאים המילוי הפער. ב פרוטוקול זה, תערובת disperse של פחמימנים צמיגה ואבקת fluoropolymer שימש המילוי הפער. עם זאת, המילוי הפער עצמו כפוף גם האפקט נימי. לכן, כפי שמוצג באיור1, microchannel reconfigurable וכתוצאה מכך יש מילוי הפער פחמימן/fluoropolymer והן מחסום אלסטומריים סביב ההיקף החיצוני של המילוי הפער. דליל באמצע פינים יש צורך להכיל כמות מספקת של הפער המילוי כדי להבטיח את עובי והעוצמה של המחסום אלסטומריים. בין שני פינים.
איור 2 A מציג ציור של סיכה המהווה פלח sidewall. כיתה נירוסטה 316L נבחר את החומר בשל שלה עמידים בפני קורוזיה נמוך שטיפת מאפיינים. אולם, תהליך פסיבציה נוסף היה נדרש לבצע תרבית תאים סיכות תואם. סיכה יש טיפ בדיוק מלבני מבלי הזיזים להקים בהצלחה קטע sidewall. בנוסף, מספר זיהוי אישי חייב להיות "אחיזה" כך ניתן להעביר את ה-pin בקלות על ידי דחיפת הידית. כי כל סיכה יש אמצע הצרה, העובי של אלסטומר בין הפינים היה מספיק כדי לעמוד הטיה הנגרמת על ידי תנועת ה-pin. בניגוד חלקים אחרים הכוללת את המכשיר, הזיוף של סיכות, למעט דילול האמצעי, אמורה להיות מסודרת מחברה המתמחה פריקה חשמל עיבוד שבבי (EDM) כי זו אחת השיטות הכי מדויקת וחסכונית של עיבוד שבבי קטן חלקים העשויים מתכות קשות. ביצוע דליל האמצעי על ידי תצריב עצמך מפחית את עלות עיבוד שבבי הסיכון של כיפוף או שבירת במהלך עיבוד שבבי.
כדי לוודא כי המילוי הפער, המכשול אלסטומריים, ובסופו של דבר את watertightness של microchannel reconfigurable מתפקד כראוי, שימש דליפת הזיהוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית. איור 3 מראה תמונת זריחה של האזור ליד הקצה של המכשול אלסטומריים 3 ימים לאחר microchannel היה מלא מים המכילים צבען מעקב פלורסנט. בתמונה זריחה מראה כי הנוזל ממלא את הערוץ הגיע לעומק של-200 מיקרומטר מהקצה גלוי של המכשול אלסטומריים. עם זאת, הנוזל לא הגיע הפער מלוי. בנוסף, אין נזילה של מילוי הפער דרך המחסום אלסטומריים נצפתה. התבוננות זו מציינת כי צר בין באמצע צר של סיכות, מחסום אלסטומריים למנוע את ההעברה של נוזל דרך פרצות.
לבסוף, אנו לבצע תרבית תאים לטווח ארוך עם האזור תרבות הותאם על ידי הרחבת בהדרגה sidewall של המכשיר reconfigurable microfluidic, כפי שמוצג באיור 4א. -0 d, מספר קטן של תאים הוגבלו בתוך מרחב שווה לאחד תאים pin-רוחב ו אחרים היו aspirated. -2 d, התאים צורפו אל פני השטח התחתון והתחלתי מתרבים. שני פינים היו נסוגים כך כל התאים נראו בבירור, למרות confluency היה עדיין נמוך. ב- 5 d, התאים המשיך להתרבות והגדילה confluency. ב- 6 ו- 9-d, שני פינים אחרים היו נסוגים לשמור את underconfluent תאים. ההשפעה של הרחבה הדרגתית של אזור התרבות מוצג באיור 4B. היו שינויים פתאומיים צפיפות תא ביום ש-pin(s) היו נסוגים. עם זאת, קצב הגידול ספירת נשמר קבוע, בזמן מהחוגים תרבית תאים טיפוסיים היא מעריכית.
איור 1 : Reconfigurable microfluidic מכשיר עם אחד sidewall pin-discretized. (א) חלקי ובנייה של מכשיר reconfigurable microfluidic. למכשיר יש ערוץ אחד ישר עם אחד sidewall הנוצרת על-ידי קצות 10 פינים מנירוסטה מוכנס לתוך התכונות microchannel PDMS/זכוכית. הפער פילר, מחסום אלסטומריים מונעת הנוזל דולף דרך הפערים pin. Coverglasses, הפער פילר, ומכשול elastomer קבועים כדי polymethylmethacrylate (PMMA) הבסיס. (B) אוטומטי pin מניפולטור. אפקטור קצה זני גיליון מתכת קבוע לטובת רובוט שולחן 3-ציר. כדי להעביר סיכה אחת, אפקטור הקצה דוחפת את סופו אנכי. סיכות באורכים שונים ממוקמים במרווח של 3 פעמים רוחב סיכה. מרווח הזמן מבטיחה את קצה אפקטור החברים סיכה אחת בבת אחת עם סיווג מספיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ציור מכני של חלקים במכונה בשימוש בפרוטוקול. יחידות דיור ישנן מילימטרים; R מציין מימד radius; סמלו מרובע (□) מציין תכונות מרובע; t מציין עובי. (א) 316 L פלדת אל-חלד pin כחלק sidewall. יכול להיות הורה, במכונה כמתואר סיכות. דילול של האמצע pin כדי לגרום לצורות עצם דמוי הכלב לא משתקף בציור הזה כי זה לא צווה כחלק עיבוד שבבי אבל בוצע במסגרת הפרוטוקול. (B) polymethylmethacrylate (PMMA) בסיס שמחזיק את coverglasses, מילוי הפער ומכשול אלסטומריים במקום נגד תנועת ה-pin. (ג) איכול צלחת המשמשת לחרוט אמצע סיכות. כדי לבנות צלחת לתחריט, ארבע חתיכות זכוכית מודבקת באמצעות דבק סיליקון. תבנית מיתאר של דבק סיליקון מצויר על מדיח הכלים ולאחריו השמה הפינים על המנה כפי שמוצג בציור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זיהוי קרינה פלואורסצנטית זליגות microchannel reconfigurable דרך פערים pin- קרינה פלואורסצנטית תמונה של הפלורסנט ירוק, ממלא את microchannel reconfigurable הוא בשכבות על תמונה חדות שלב של המבנה החותם, אשר מורכב של המילוי הפער (אטום) ומכשול אלסטומריים (שקוף). קצה של המכשול elastomer גלוי כמו מניסקוס כמו תכונות, זה מסומן על ידי קו מנוקד העליון; הממשק בין מלוי מכשול והפער elastomer מוצג כמו מניסקוס תכונות לפנות אזור שחור ומצוין על ידי הקו המקווקו נמוכה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : צמיחת תאים הדרגתי ומתמשך עם התא משתנה התרבות באזור microchannel reconfigurable. (א) 7-כי צמיחת תאים באזור התרבות התא מוגבל על-ידי הזזת ובמכסה. צמיחה (B) עקומת וזמן האבולוציה של הצפיפות של תאים COS-7 כלוא בתוך תרבות גודל משתנה באזורים microchannel reconfigurable המוצגים ב A). שלושה חצים אנכי מציינות הרחבה של אזור התרבות התא-2, 5 ו- 6 ד', בהתאמה. בנוסף ספירת תאים, תא צפיפויות מוצגים עבור התרבות באותם האזורים, מותאם באופן אינדיבידואלי לכל עקומת הגידול האקספוננציאלי, המשמש להערכת המקומי ההכפלה הזמן (td [h]) המוצגות במסגרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
Microchannel pin-discretized ערוץ microfluidic מלאות, אנו מאמינים כי יש reconfigurability הניכרים במצב ערוץ לעומת בערוצים microfluidic הקיים. פרוטוקול שסיפקנו כאן יאפשר microfluidic התקנים היכולים תרבית תאים עם הרחבת בהדרגה תרבות תא שטח כדי לשמור את התרבויות תחת confluency עבור משך זמן ארוך. המכשיר יספק גם בערוץ המתבנת של תאים ללא תכנים חלבונים על המצע מראש או כל שיקול אחר בזמנו של עיצוב או פבריקציה נוספת. בנוסף, המכשיר הזה reconfigurable microfluidic בקלות יוצר זרימה חזקה בערוץ הזחה, אשר יעזור ליישם טיפול קשה לזרימת החומרים מעט microfluidic קיימים מכשירים יכול להתמודד. משמעות הדבר היא כי האינטראקציה בין התאים של מיקרואורגניזמים אחרים, גזים ונוזלים אחרים שאינם-שניתן להעריך באמצעות התקן זה בלי שינויים גדולים בעיצוב המכשיר.
חשבנו החלה לפלס לחץ או לחץ הידרוסטטי על כניסת אחד של הערוץ כמו שיטות בקרת זרימה חיצוני. לא מומלץ לדחוף נוזלים במבוי סתום כי זה יפיק זרימת לכיוון התעלה בפיזור האוויר באמצעות הפערים בין הפינים הרצפה/התקרה של הערוץ. פעולות נוזלים רבים אינם דורשים פעולות כאלה pin. למשל, ערבוב יכול להתבצע על ידי רסוק נוזלי על ידי סיכה אחת (כלומר, עובר אחד בלבד pin ואחורה מספר פעמים).
החלקים הקריטיים ביותר של המכשיר הם הסיכות. דיוק אורך, ההקבלה, perpendicularity ואיכות פני שטח נדרשים עבור הפינים, כפי הם חייבים ליצור microchannel, עליך להעביר בצורה חלקה, עליך להנחות את התנועה של סיכות סמוכים. לכן, אנו ממליצים כי הפינים אמורה להיות מסודרת מחברה המתמחה דיוק עיבוד שבבי על ידי הגשת ציור דומה איור 2א. ייתכן שחברות דורשות קביעת ממדים גיאומטריות נוספים וכיוונים מפורשת חספוס פני השטח. עם זאת, הפינים הם לשימוש חוזר אם הם שטופלו עם טיפול, מדי פעם passivated עם חומצה חנקנית.
המחסום אלסטומריים הוא תכונה קריטית נוספת ולאחר הקמתו הוא השלב הקריטי ביותר בתהליכי ייצור של המכשיר. יהיה צורך בסיס בדיוק במכונה כדי להשיג תוצאות הדיר ואמין. הצבת את הסיכות על המכשול משומרים הוא גם שלב קריטי. יש לשמור את הפינים מסודרים היטב, ומוטבעים המילוי הפער ואת הגדר ללא בועות אוויר. השלבים הבאים למנוע זליגת באמצעות הסיכות, אשר היא בעיה נפוצה עם התקן זה microfluidic.
בעיות נפוצות אחרות תוך שימוש במכשיר זה הינם סיכות frictionally a) מאופקת, מוות תאי b), ושיעור צמיחה נמוכה. גורם אפשרי עבור אלו) כולל חריטה (ישרים או גליים) לא אחידה של pin האמצעי, מסכן איכות מעופף משטח, מימדי חרוט בין גובה הטיפ pin ואת הגובה של השכבה photoresist על תבנית עבור לוחות סיליקון. ההתאמה של ניסוח etchant, חום ועצבנות עשויים לשפר את תנועת ה-pin. בנוסף, משפט מתאים ללא שימוש בשעווה או דבק תספק רמזים כדי לפתור את הבעיה. האפשר גורמים ב') הן לא מספיקות פסיבציה הפינים, שגיאות מבחר דבקים עבור אלסטומריים מחסומים, ריפוי לא שלם של מהאיכותיים. כמה תאים עשויים לדרוש ציפוי פנימה microchannel עם fibronectin או חלבונים או פולימרים המקדמים הידבקות תאים אחרים. בנוסף, קידום אתרים תא תרבות בפועל כגון trypsinization וצנטריפוגה יקטן תאים מתים, microchannel.
אחת המגבלות של פרוטוקול הציג פבריקציה נוספת היא כי רק באחד בקירות הצדדיים הוא discretized. Reconfigurability של הערוץ תשפר עוד יותר אם בקירות הצדדיים שניהם נבנים על ידי pin מערכים. למרות שזה דורש כמות כפולה של סיכות והשלבים ייצור ארוכים יותר, זה אפשרות טכנית מעשית.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי KAKENHI (20800048, 23700543).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Araci, I. E., Brisk, P. Recent developments in microfluidic large scale integration. Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).
- Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -C., Meiners, J. -C., Takayama, S. Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays. Appl Phys Lett. 90 (3), 033505 (2007).
- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
- Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).
