Summary
En mikrofluid kanal med deformerbare dæksider tilbyder flowkontrol, partikel håndtering, kanal dimension tilpasning og andre rekonfigurationer mens i brug. Vi beskriver en metode til at opdigte en mikrofluid kanal med sidevægge fremstillet af en række knappenåle, der tillader deres form til at ændre.
Abstract
Mikrofluid komponenter skal have forskellige figurer til at indse forskellige centrale mikrofluid funktioner som blanding, adskillelse, partikel diffusering eller reaktioner. En mikrofluid kanal, der deformerer selv efter fabrikation samtidig bevare figuren kanal giver høj spatiotemporelle rekonfigurerbarhed. Denne rekonfigurerbarhed er nødvendig i sådanne centrale mikrofluid funktioner, der er vanskeligt at opnå i eksisterende "omkonfigurerbare" eller "integreret" mikrofluid systemer. Vi beskriver en metode til fremstilling af en mikrofluid kanal med en deformerbare dæksiden bestående af en sideværts justeret vifte af enderne af rektangulære ben. Aktivering af benene i deres langsgående retninger ændrer pins' ende holdninger, og dermed, formen af discretized kanal sidevægge. PIN huller kan forårsage uønskede lækage eller vedhæftning til tilstødende pins forårsaget af menisk styrker. For at lukke pin huller, har vi indført kulbrinte-fluorpolymer suspension-baseret hul fyldstof ledsaget af en elastomere barriere. Omkonfigurerbare mikrofluid enhed kan frembringe stærke tidsmæssige i kanal forskydning flow, eller den kan stoppe strømmen i enhver region i kanalen. Denne funktion vil lette, on-demand, håndtering af celler, tyktflydende væsker, gasbobler og ikke-væsker, selv om deres eksistens eller opførsel er ukendte på tidspunktet for fabrikation.
Introduction
Mikrofluid enheder - mikro-størrelse der styrer små mængder af væske og deres strømme - tilbyde miniaturisering af biomedicinske procedurer i en "chip" format med øget bærbarhed og ofte, overkommelige priser. Som beskrevet i en nylig revision1, er forskellige mikrofluid komponenter bestående af mellemrum og positive træk blevet udviklet til at realisere grundlæggende og centrale fluidic funktioner som blanding, adskillelse, partikel diffusering eller reaktioner.
Mens adfærd af mange mikrofluid enheder er bestemt i projekteringsfasen, tillade nogle slags mikrofluid enheder efter fabrikation ændringer af deres struktur eller adfærd. Her henviser vi til denne funktion som "rekonfigurerbarhed". Rekonfigurerbarhed af mikrofluid systemer generelt reducerer tid og omkostninger, der kræves til at designe en enhed og/eller muliggør tilpasning af mikrofluid layout eller funktioner over tid.
Tidligere beskrevet omkonfigurerbare mikrofluid enheder falder ind under følgende tre kategorier. Første tillader deformation af elastomere kanaler strømningshastigheder og retninger skal ændres under brug. For at få rekonfigurerbarhed, er elastomere kanaler deforme af forskellige eksterne og kontrollerbar kræfter såsom pneumatisk tryk kilder2, Braille aktuatorer3eller forsegling4-komprimering. I andet, omkonfigurerbare enheder afhængige modulære designs, såsom multi-lag fluidic kredsløb, modulære kanaler med magnetisk forbinder, og slanger-baserede mikrofluidik5. I tredje, selve enheden er ikke omkonfigurerbare, men microdroplet transport på elektrode arrays (ofte benævnt digital mikrofluidik)6,7 og hængende drop-baserede mikrofluid enheder8 aktiverer bestillings- Skift af strømmen eller ruten af væske.
Mange af disse rekonfigurationer er dog begrænset på topologiske og makroskopisk plan. For eksempel, mange integrerede mikrofluid anordninger stoppe strømmen eller ændre retningen flow af kollapse microchannels i foruddefinerede regioner. Placering og antallet af regioner skal være skjult er imidlertid ikke omkonfigurerbare. Selv om den digitale mikrofluidik har en bred vifte af væske håndtering evner, begrænset muligt strømme i vid udstrækning af mængden af hver dråbe. Derudover når cellerne er kulturperler i sådanne dråber af celle kultur medier, ekstra indsats er nødvendig for at undgå fordampning og gas varmeafledning fra dråber og undgå osmolalitet chok og pludselige pH ændringen.
For at realisere kanal funktion-niveau rekonfigurerbarhed, foreslog vi en mikrofluid enhed med bevægelige dæksider, som bestod af arrays af maskinen elementer til dynamisk omkonfigurere dem når i brug9. For at danne en deformerbare dæksiden, var små rektangulære ben linet op, så at hver ende af benene defineret et segment af dæksiden. Glidende benene tilladt deformationen af dæksiden som tilladt transport eller mønstre af celler, bobler og partiklerne inde i kanalen. For at minimere dødvolumen og maksimere rekonfigurerbarhed, skulle afstanden mellem de tilstødende ben minimeres. Dog stærk kapillaritet handler på små huller mellem pins forbinder inde og uden for microchannel forårsager lækage af væske at indtaste pin hul, der forårsager media fordampning, bakteriel eller cytotoksiske forurening, og i sidste ende celle død. Derfor har vi udviklet lækage-fri discretized dæksiden-type omkonfigurerbare mikrofluid kanaler, der kunne modstå cyklisk pin handlinger og langsigtede celle kultur10.
I denne artikel leverer vi en protokol for at bygge mikrofluid celle kultur enhed med en discretized dæksiden, der kan omkonfigureres efter den gradvise stigning i området celle kultur. Lufttæthed diskrete kanal dæksider er testet ved hjælp af fluorescens billeddannelse. Cellekultur kompatibilitet og evne til celle mønstre er evalueret ved brug på chip cellekultur.
Dette mikrofluid system er velegnet, når passende kanaldesign kan ikke være forudbestemt og skal ændres efter behov. For eksempel, dette system kan anvendes til at justere kanal bredde og flow baseret på cellevækst eller migration, at flow eller fælde aktive nematoder eller andre små objekter, der opfører sig uventet i den engelske kanal, eller at acceptere forskellige raw-prøver eller bioproducts, var ikke endnu undfanget på tidspunktet for design.
Protocol
1. ætsning af Pins (fig. 2A)
- Affedt rektangulære pins ved nedsænkning i acetone.
- Passivering benene ved at nedsænke i 4 mL 10% salpetersyre, så varme løsning på 65 ° C i 30 min. i ovn.
- Der sonikeres pins i ionbyttet vand i 5 min. til at fjerne resterende syre og tørre med et stykke køkkenrulle. Fordybe til benene i 0,5 mL af mug frigivelse agent for 2 h.Sonicate pins i ionbyttet vand i 5 min.
- Fremstil en Radering parabol (figur 2C).
- Tegne eller indskrives to parallelle linjer med et 4 mm hul på et glas dias ved hjælp af en lineal.
- Anvende et kemikalie-resistent og lav viskositet lim til en overflade af to rektangulære skåret coverglasses.
- Obligation de to cut coverglasses på glas dias på et 4 mm hul. Brug den parallelle linje som en guide.
- Undvære to linjer af silikone klæbestof på ætsning parabol (Se figur 2C for positionen og størrelsen af konturen).
Bemærk: En 3D-trykt skabelon (en STL modelfil er inkluderet som en supplerende materiale) vil hjælpe tegne linjer, nemt og præcist. - Læg benene på ætsning parabol, så de 2 mm lange tips på deres lige ender er nedsænket i den klæbende stregmønster. Undvære den selvklæbende igen for at sikre, at ben er helt dækket og at tegne en kontur. Overføre ætsning parabol til en befugtet fermenteringstanken opvarmet til 38 ° C. Vent natten for at kurere limen.
- Tilføje 0,2 mL 0,5 M salpetersyre til 0,2 mL 5,0 M saltsyre langsomt i et hætteglas.
Advarsel: Blandingen, også kendt som Aqua regia, er meget ætsende og potentielt eksplosive. Bære syrebestandige og syretætte gummihandsker og beskyttelsesbriller, og udvise ekstrem forsigtighed ved håndtering af syrer. Aldrig gemme løsningen. Reducere salpetersyre som muligt for at mindske sin aggressivitet. - Sætte ætsning parabol på en kogeplade, opvarmes til 65 ° C. Hæld 0,4 mL af den syre blanding over regionen afdækket i benene. Vente 10 min og overføre syre til et bægerglas.
- Neutralisere alle de resterende syre, herunder den ætsede region af benene med 5 mL af 0,8 M natriumbikarbonat løsning i ionbyttet vand.
- Fjerne benene fra ætsning skålen ved at trække benene på langs med en pincet. Der sonikeres pins i ionbyttet vand i 5 min. efterfulgt af sonikering i acetone i 5 min.
- Passivering regionen ætset i benene som i trin 1.2.
- Tjek bredden af de ætsede pins med en shop mikroskop med en reticle. Justere ætsning tid beskrives i 1,7, så bredden af regionen ætset er 0,2 ± 0,02 mm.
- Overføre benene til et hætteglas med 5 ml af 70% ethanol. Bringe hætteglasset en laminar hætte. Afhente benene ud af hætteglasset og lad dem tørre.
2. fabrikation af silikone slab med bassiner og en plads til benene.
- Fremstil en støbeform til en plads til benene og en fast dæksiden af typiske Litografisk processer.
- Coat et affedtede glas dias med 1 mL af negative epoxy photoresist ved hjælp af en spin coater ved 1000 rpm. Tør photoresist på en 95 ° C varm tallerken i 15 min. Gentag dette trin en gang.
- Spin coat det tredje lag af den samme photoresist ved 2.000 omdrejninger på glas dias med coated photoresist. Tørre photoresist på 95 ° C kogeplade i 30 min.
- Udsætte photoresist lag til 450 mJ/cm2 af 365-nm ultraviolet lys fra en UV spot lyskilde gennem en photoplotted film. Bage den udsatte photoresist på 95 ° C kogeplade i 15 min. udvikle photoresist ved at spraye et opløsningsmiddel (2-methoxy-1-methylethylacetat) ved hjælp af en hånd sprøjte, og føntørre med nitrogen gas.
- Placer glas dias med mønstrede photoresist nederst i en plastik skål.
- Hæld prepolymer af Polydimethylsiloxan (PDMS) på skimmel til en tykkelse på 3 mm. Debubble PDMS prepolymer i et vakuum ekssikkator på-800 kPa i 10 min.
- Lad PDMS prepolymer i en ovn ved 65 ° C i 1 h. Demold den delvist hærdede PDMS hærde ved hjælp af en skalpel. Fuldt helbrede PDMS i ovnen ved 120° C i 1 time.
- Langs retningslinje mønster, trim væk uregelmæssige kanter fra PDMS pladen med det samme skalpel. Gøre så præcise og rense et snit som muligt, især på den overflade, der definerer indsættelse slot (Se figur 1A) til benene.
- Perforere 2 mm-diameter huller til indløb/udløb i enderne af den vigtigste kanal af PDMS slab bruger biopsi slag. Ligeledes perforere 1 mm-dimeter huller i enderne af luft aftræk kanal. Se figur 1A for kanallayout og placeringen af disse huller.
3. montering af enheden med lokal fabrikation af kløften fyldstof og barriere.
- Fremstil en microchannel forsamling.
- Fordybe en 10 × 20 mm No. 4 daekglas i et rengøringsmiddel, der opvarmes til 60 ° C i 10 min.
- Skyl coverglasses med deioniseret vand to gange og tørre ved 120 ° C i 10 min.
- Plasma-bond PDMS slab til et daekglas:
- Placer PDMS slab (kanal funktion side opad) og de rensede 10 × 20 mm No. 4 daekglas i en sputter coater vakuumkammer.
- Begynde at pumpe ned i salen til 60 Pa. generere luft vakuum plasma (20 mA) til 30 s.
- Straks lufte salen. Bond kanal funktion side af PDMS slab til daekglas med deres kanter justeres.
- Placer de agglomererede lag i en 65 ºC ovn i 10 min.
- Bringe de agglomererede lag til en laminar hood ved hjælp af en steril beholder. Sterilisere dem med UV lys i 30 min.
- I laminar hætten, skal du indsætte benene i stikket, så enderne danne andre dæksiden af microchannel. Tilstødende pins bør være forskellige i længden at undgå kontakt med begge lodret ender (Se figur 1B). Stor afstand mellem lodrette enderne er at foretrække. Et rum af (N-1) × (pin bredde) er muligt når N slags pins med forskellige pin længder (L i figur 2A) er forberedt.
- Fremstil en base ( figur 2B).
- Gøre eller læse en del fil af basen og to numerisk styring (NC) filer (indeholdende værktøjsbaner; inkluderet som supplerende materiale) ved hjælp af CAD/CAM software. Den første supplerende NC fil bruger en 4 mm-diameter ende mill og den anden en 1 mm-diameter ende mill.
- Klemme en 3 mm tyk klart polymethylmethacrylat (PMMA) bord på en CNC mill.
- Åbn filen første NC på en computer NC (CNC) mølle-controlleren. Installere en 4 mm ende mølle til CNC mill og Find del nul ved at røre ved den ende mølle til PMMA bestyrelsen. Kør NC kode for at skære i bestyrelsen.
Bemærk: Blæse lejlighedsvis ende mill tip med komprimeret luft til køling og chip fjernelse. - Gentag 3.2.3 ved hjælp af den anden NC-fil og en 1 mm slutningen mill.
- Affedt de bearbejdede dele med vaske og tørre med et stykke køkkenrulle. Spray delene med 70% ethanol og bringe dem til en laminar hætte.
- Fremstil en pin hul fyldstof og elastomere barriere:
Bemærk: Trin 3.3.1 - 3.3.7 bør udføres under aseptiske forhold i en laminar hætte.- Forberede hullet fyldstof ved at blande hvid petrolatum og polytetrafluorethylen pulver i forholdet 2:1 vægtprocent. Rystes blandingen ved hjælp af en ultralyd homogeniseringsapparat.
- Hæld gap fyldstof i en dispenser sprøjte. Indsæt en stemplet og skubbe det til at fylde spidsen af sprøjten. Vedhæfte en nål og skubbe stemplet igen indtil needle-tip er fyldt. Ligeledes udarbejde en dispenser sprøjte med en stemplet og en nål, og fyld med silikone klæbestof.
- Tilsluttes en pneumatisk dispenser ved hjælp af en adapter tube hver sprøjte. Justere dispensere presset for silikone lim og fyldstof til 250 kPa og 280 kPa.
- Dispensere silikone klæbestof til kanten af et hul i bunden. Placer en 10 × 20 mm No.4 daekglas på lommen og tryk det fast at obligation.
- Dispensere silikone klæbestof til en dybde af ca. 1 mm at tegne to segmenter langs to ydre slots af basen. Dispensere gap fyldstof til en dybde af ca. 1 mm, for at tegne segmenter langs anden slotten.
- Dispensere silikone klæbestof til kanten af en anden lomme. Placer en microchannel Forsamling (3.1) på lommen og tryk det fast at obligation.
- Gentag 3.3.5 for at sikre, at både gap fyldstof og silikone klæbestof fuldt ud integrere benene, og at der ingen åbning på slots.
- Sætte enheden i en steril beholder, såsom en rustfrit stål kasse med låg. Overføre beholderen til en befugtet fermenteringstanken opvarmet til 38 ° C. I laminar hætten, helbrede den elastomere barriere for en dag.
- Flytte hver pin op til 1 mm langs tilstødende ben at frigive benene fra den hærdede elastomere barriere.
- Sterilisere enhed med UV-lys i 30 min.
4. evaluering af den mikrofluid enhed
- Opdage lækage ved hjælp af fluorescens
- Åbn microchannel ved hjælp af et fint værktøj eller en desktop robot. Gøre kanal bredde som konsekvent i hele kanalen som muligt.
- Fortynde en grøn fluorescerende farvestof med deioniseret vand på 10 µM at gøre fluorescens løsning.
- Tilføje fluorescens løsning til en af slutningen portene af microchannel med en micropipettor. Dette trin vil fylde kanal med løsningen.
- Sætte mikrofluid enheden og to stykker af absorberende papir våd med deioniseret vand i en stor plastik fad. Inkuber parabol på 37 ° C og 5% CO2 i mindst 24 timer.
- Optage grøn fluorescens billeder af microchannel med en inverteret fluorescerende mikroskop med et mikroskop kamera.
- Åbn de fluorescerende billeder med et passende billede analyse software og bekræfte ikke siver (grøn fluorescens) på grænsefladen i gap fyldstof og benene.
- Frø celler til microchannel.
- Forberede en celle kultur fartøj med 70-80% sammenflydende celler (afhængigt af celletyper). Frigør og suspendere celler i vækstmediet.
- Centrifugeres celler (hastighed og tid afhænger celletyper), og Opsug mediet.
- Resuspend celler med en lille mængde af medium. Tælle celler med en celle counter og justere celle tæthed fra 1,5 × 106 til 1,5 × 107 celler/mL.
- Åbn microchannel ved hjælp af et fint værktøj eller en desktop robot (figur 1B) for at gøre en lige 400 µm hele kanal. Justere pin positioner for at gøre dæksiden som fladt hele kanalen som muligt. Tilføje cellesuspension til en af havnens slutningen af microchannel og fylde kanalen.
- Find et af benene, der definerer dæksiden i regionen til at starte kultur. Under en inverteret mikroskop, lukke to tilstødende benene for at omslutte celler i regionen celle kultur.
- Luk alle knappenåle fra i rækkefølge fra indre til ydre at udvise alle celler fra kanalen. Forsigtigt Aspirér suspension fra slutningen havne, og tilføje medium til dem.
- Inkuber enheden, som beskrevet i 4.1.4. Når celler er omkring 70-80% sammenflydende, langsomt åbner en pinkode for at udvide området kultur.
Representative Results
Opførelsen af den omkonfigurerbare microchannel er vist i figur 1. Flere rektangulære ben blev placeret på et glas substrat og var linet op, således at den lange side af benene var i kontakt. En PDMS ark med udstansede huller og en fordybning af den samme dybde som pin højde omfattes enderne af pins danner kanal indløb/udløb reservoirer, kanal loft, og en anden dæksiden modsat kanal væggen, der bestod af benene. Regionen omgivet af pins, en mur (en af ansigterne af arket PDMS) og glas substrat danne en mikrofluid kanal.
Som tidligere beskrevet opnås rekonfigurerbarhed af det foreslåede mikrofluid system af mange små ben placeret parallelt med meget små men nul huller. Problem i de tidligere rapporter var stærk strømmen genereres gennem hullerne kapillær virkning. For at løse dette problem, blev hullerne først fyldt med en hul fyldstof. I denne protokol, blev dispergere blanding af tyktflydende kulbrinte og fluorpolymer pulver brugt som en hul fyldstof. Men hullet fyldstof selv er også underlagt de kapillær virkning. Derfor, som vist i figur 1, den resulterende omkonfigurerbare microchannel har både kulbrinte/fluorpolymer gap fyldstof og en elastomere barriere dannet omkring den ydre omkreds af kløften fyldstof. Udtynding i midten af benene er nødvendig for at rumme en tilstrækkelig mængde af kløften fyldstof at sikre tykkelse og styrke af den elastomere barriere mellem to ben.
Figur 2 A viser en tegning af en pin, som danner en dæksiden segment. Rustfrit stål grade 316L blev valgt som materiale på grund af dens korrosionsbestandige og lav udvaskning egenskaber. Men en ekstra passivation proces var forpligtet til at gøre pins cellekulturer kompatible. En PIN-kode skal have et præcist rektangulær tip uden grater at kunne danne en dæksiden segment. Derudover skal en PIN-kode have et "håndtag" så pin let kan flyttes ved at skubbe håndtaget. Fordi hver pin har en smal midten, var tykkelsen af elastomer mellem benene nok til at modstå shear forårsaget af pin bevægelse. I modsætning til andre dele bestående af enheden, skal fabrikation af pins, undtagen midterste udtynding, bestilles fra en virksomhed med speciale i elektrisk udladning bearbejdning (EDM), fordi det er en af de mest nøjagtige og omkostningseffektive metoder til bearbejdning af små dele fremstillet af hårde metaller. Udfører midterste udtynding af ætsning selv reducerer udgifterne til bearbejdning og risikoen for bøje eller bryde under bearbejdning.
For at bekræfte, at kløften fyldstof, elastomere barriere, og til sidst vandtætheden af de omkonfigurerbare microchannel fungerer korrekt, blev lækage afsløring af fluorescens brugt. Figur 3 viser en fluorescens billede af området nær kanten af elastomere barrieren 3 dage efter microchannel var fyldt med vand, der indeholder fluorescerende tracer farvestof. Fluorescens billede viser, at væsken fylder kanalen nået en dybde på omkring 200 µm fra elastomere barrieren synlige kant. Dog nåede væsken ikke kløften fyldstof. Derudover blev ingen lækage af kløften fyldstof gennem elastomere barrieren observeret. Denne observation angiver, at den stramme pasform mellem den smalle midten af pins og elastomere barriere forhindret migration af væske gennem hullerne.
Endelig, vi udførte langsigtede cellekultur med kultur-området af gradvist udvide dæksiden omkonfigurerbare mikrofluid anordning som vist i figur 4A. På 0 d, var et lille antal celler begrænset i et rum, der er lig med en pin-bredde og andre celler var indsugning. På 2 d, cellerne var knyttet til bunden overfladen og begyndte prolifererende. To ben blev trukket tilbage, således at alle celler var klart synlige, selv om confluency var stadig lavt. På 5 d, cellerne fortsatte med at formere sig og at confluency øges. På 6 og 9 d, to andre ben blev trukket tilbage for at holde celler underconfluent. Effekten af gradvis udvidelse af området kultur er vist i figur 4B. Der var pludselige ændringer i celle tæthed på dagen pin(s) blev trukket tilbage. Dog blev vækstrate af celletal holdt konstant, mens det set i typisk cellekultur er eksponentiel.
Figur 1 : Omkonfigurerbare mikrofluid enhed med en pin-discretized dæksiden. (A) dele og opførelse af en omkonfigurerbare mikrofluid enhed. Enheden har en lige kanal med én dæksiden dannes af enderne af 10 rustfrit stål pins indsat i PDMS/glas microchannel funktioner. Kløften fyldstof og en elastomere barriere forhindrer væske siver gennem pin huller. Coverglasses, gap fyldstof og elastomer barriere er fastgjort til en polymethylmethacrylat (PMMA) base. (B) automatiseret pin manipulator. En ende effektor fremstillet af et ark af metal er fastgjort til en 3-akse desktop robot. Hvis du vil flytte en pin, skubber ende effektor sin lodrette ende. Pins med forskellige længder er placeret med et interval på tre gange pin bredden. Intervallet, der sikrer, at slutningen effektor kammerater en pin på én gang med nok frihøjde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mekanisk tegning af bearbejdede dele anvendes i protokollen. Enheder er i millimeter; R angiver en radius dimension; den firkantede symbol (□) angiver kvadratiske funktioner; t angiver tykkelsen. (A) en 316 L rustfrit stål pin som en del af dæksiden. Pins kan bestilles og bearbejdet som beskrevet. Udtynding af pin midten at gøre hunden knogle-lignende figurer afspejles ikke i denne tegning, fordi dette ikke var bestilles som en del af den bearbejdning, men blev udført som en del af protokollen. (B) en polymethylmethacrylat (PMMA) base, der holder coverglasses, gap fyldstof og elastomere barriere på plads mod pin bevægelse. (C) en Radering parabol, der bruges til etch midten af pins. For at opbygge en Radering fad, er fire stykker af glas bundet ved hjælp af silikone klæbestof. Et profilmønster af silikone klæbestof henledes på fadet efterfulgt af placering af benene på parabol som vist på tegningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Fluorescens detektion af lækage fra en omkonfigurerbare microchannel gennem pin huller. Fluorescens billede af grøn fluorescerende farvestof fylde den omkonfigurerbare microchannel er oven på en fase kontrast billede af sæl-struktur, der består af en hul fyldstof (uigennemsigtig) og elastomere barriere (gennemsigtig). En kant af elastomer barriere er synlig som menisk-lignende funktioner og er angivet ved en øvre stiplede linje; grænsefladen mellem elastomer barriere og gap filler er vist som menisk-lignende funktioner, at kontakte den sorte område og er angivet med den lavere stiplede linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Gradvis og kontinuerlig cellevækst med variabel celle kultur område i en omkonfigurerbare microchannel. (A) COS-7 cellevækst i en celle kultur område begrænset ved at flytte sidevægge. (B) vækst kurve og gang udviklingen i tætheden af COS-7 celler er begrænset i variabel størrelse kultur områder i den omkonfigurerbare microchannel vist i A). Tre lodrette pile betegne udvidelse af området celle kultur på 2, 5 og 6 d, henholdsvis. Ud over celletal, er celle tætheder vist for de samme områder, kultur, monteret individuelt til hver eksponentiel vækstkurve, og bruges til at vurdere de lokale fordobling tid (td [h]) vist i rammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den pin-discretized microchannel er en fuld-kendetegnet mikrofluid kanal, og vi mener, det har naturligvis høj rekonfigurerbarhed i kanalform sammenlignet med enhver eksisterende mikrofluid kanaler. Den protokol, vi givet her vil aktiverer mikrofluid enheder i stand til cellekultur med gradvist udvide celle kultur areal for at holde kulturer under confluency for en lang varighed. Enheden vil også levere i kanal mønstre af celler uden mønster proteiner på underlaget på forhånd eller alle andre hensyn på tidspunktet af design eller fabrikation. Derudover genererer denne omkonfigurerbare mikrofluid enhed let stærk i kanal forskydning flow, hvilket ville hjælpe med at gennemføre håndtering af materialerne vanskeligt at flow at meget få eksisterende mikrofluid enheder kan håndtere. Det betyder, at samspillet mellem cellerne og andre mikroorganismer, gasser og andre ikke-væsker kan evalueres ved hjælp af denne enhed uden store ændringer i enhed design.
Vi har overvejes at anvende Laplace pres eller hydrostatisk tryk til en indgang af kanalen som eksterne flow kontrolmetoder. Vi anbefaler ikke at skubbe flydende på en blindgyde, fordi det vil generere strøm mod luft aftræk kanal gennem huller mellem benene og loft/gulv af kanalen. Mange flydende operationer kræver ikke sådan pin operationer. For eksempel, kan blande ske ved mase væske af en pin (dvs. flytte kun en pin frem og tilbage flere gange).
De mest kritiske dele af enheden er benene. Præcision i længde, parallelitet, vinkelrethed og overfladekvalitet er påkrævet for benene, da de skal danne et microchannel, skal flytte gnidningsløst og skal guide bevægelse af tilstødende pins. Vi anbefaler derfor, at benene skal bestilles fra en virksomhed, der har specialiseret sig i præcision bearbejdning ved at sende en tegning svarende til figur 2A. Der kan være virksomheder, der kræver yderligere Geometrisk dimensionering og eksplicit overfladeruhed retninger. Dog kan benene genbruges, hvis de er håndteret med omhu og lejlighedsvis passivated med salpetersyre.
Den elastomere barriere er en anden vigtig funktion, og dens dannelse er den mest afgørende skridt i fabrication processerne for enheden. En netop bearbejdes base vil være nødvendig for at opnå repeterbare og pålidelige resultater. Placere benene på den uhærdede barriere er også et afgørende skridt. Benene skal holdes godt afstemt, og indlejret i kløften fyldstof og barriere uden luftbobler. Disse trin forhindre lækage gennem benene, hvilket er et fælles problem med denne mikrofluid enhed.
Andre almindelige spørgsmål i ved hjælp af denne enhed er en) frictionally beherskede pins, og b) celledød, og lav vækstrate. Mulige årsager til disse i en) omfatter ujævn (koniske eller bølget) ætsning af pin midterste, dårlig kvalitet af den ætsede overflade og dimensionelle misfit mellem pin tip højde og højden af photoresist lag på en form for silikone plader. Justering af TIPkan formulering, temperatur og agitation kan bidrage til at forbedre bevægelsen pin. Derudover vil retssag montering uden brug af voks eller lim give tips til at løse problemet. Mulige faktorer i b) er utilstrækkelig passivation i benene, fejl i udvælgelsen af klæbemidler til elastomere barrierer, og ufuldstændig hærdning af lim. Nogle celler kan kræve belægning inde microchannel med fibronektin eller andre proteiner eller polymerer, der fremmer celle vedhæftning. Derudover vil optimering i celle kultur praksis såsom trypsinization og centrifugering falde døde celler i microchannel.
En af begrænsningerne i præsenteres fabrikation protokol er, at kun én dæksider er discretized. Rekonfigurerbarhed af kanalen vil yderligere forbedre hvis begge dæksider er bygget af pin arrays. Selv om det kræver dobbelt mængde af ben og længere fabrikation trin, er dette en teknisk farbar vej.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af KAKENHI (20800048, 23700543).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Araci, I. E., Brisk, P. Recent developments in microfluidic large scale integration. Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).
- Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -C., Meiners, J. -C., Takayama, S. Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays. Appl Phys Lett. 90 (3), 033505 (2007).
- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
- Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).
