Summary
측 벽 변형 된 미세 채널 흐름 제어, 입자 처리, 채널 차원 사용자 지정 및 사용 하는 동안에 다른 재구성을 제공 합니다. 우리는 그들의 모양을 변경할 수 있는 핀의 배열을 측 벽으로 미세 채널을 조작 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
미세 구성 요소 혼합, 분리, 입자 트랩, 또는 반응 등 다른 주요 미세 기능을 실현 하기 위해 다양 한 도형이 필요 합니다. 미세 채널을 채널 형태를 유지 하면서 제조 후에 변형 높은 spatiotemporal 갖추었을 수 있습니다. 이 갖추었은 기존 "재구성" 또는 "통합" 미세 시스템을 달성 하기 어려운 그런 키 미세 기능에 필요 합니다. 직사각형 핀의 끝의 옆으로 정렬 된 배열 구성 된 변형 측 벽으로 미세 채널 제조 하는 방법을 설명 합니다. 움직이는 그들의 경도 방향에 있는 핀 핀의 끝 위치, 그리고 이렇게, 분할 된 채널 측 벽의 모양을 변경 합니다. 원치 않는 누설 또는 초승달 모양 힘에 의해 발생 하는 인접 한 핀 접착 핀 간격이 발생할 수 있습니다. 핀 간격을 닫으려면, 우리는 탄화수소 중합체 정지-기반 갭 필러는 탄성 장벽에 의해 동반를 도입 했습니다. 이 재구성 가능한 미세 장치 강한 시간에 채널 변위 흐름을 생성할 수 또는 채널의 모든 영역에서 흐름을 중지할 수 있습니다. 이 기능은 촉진 한다, 주문형, 셀, 점성 액체, 가스 거품, 및 비-유체, 처리 경우에 그들의 존재 나 행동 하지 알려져 제조의 때에.
Introduction
미세 소자-마이크로 크기의 장치를 소량의 액체와 그들의 흐름을 제어-휴대성과, 자주, 경제성 "칩" 형식으로 생물 의학 절차의 소형화를 제공 합니다. 최근 검토1에 설명 된 대로 공간 및 긍정적인 기능으로 구성 된 다양 한 미세 구성 요소 기본 키 유체 함수와 혼합, 분리, 입자 트랩, 또는 반응 등을 실현 하기 위해 개발 되었습니다.
디자인 단계에서 많은 미세 소자의 동작을 결정 하는 동안 어떤 종류의 미세 장치 그들의 구조 또는 동작의 사후 제작 변경 수 있습니다. 여기 우리는 "갖추었을"로이 기능을 참조 하십시오. 미세 시스템의 갖추었을 일반적으로 장치를 디자인 하는 데 필요한 비용과 시간을 줄일 수 및/또는 시간이 지남에 미세 레이아웃 또는 기능 사용자 지정을 수 있습니다.
이전에 장치는 다음 세 가지 범주로 재구성 가능한 미세 기술. 첫 번째, 변형 탄성 채널의 흐름 속도 방향으로 사용 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 갖추었을 얻을, 탄성 채널 공 압 압력 소스2, 점자 액추에이터3또는4밀봉 압축 등 다양 한 외부 및 지배할 수 있는 힘에 의해 변형 된다. 두 번째, 재구성 가능한 장치에 의존 모듈 디자인, 멀티 레이어 유체 회로, 자기와 모듈형 채널 상호 연결와 같은 튜브 기반 마이크로5. 세 번째, 장치 자체는 재구성, 하지만 전극 배열 (디지털 마이크로 라고도 함)6,7 , 교수형 드롭 기반 미세 장치8 microdroplet 교통 사용 요청 시 흐름 또는 액체의 경로 전환.
그럼에도 불구 하 고, 이러한 재구성의 많은 토폴로지 및 거시적인 수준에서 제한 됩니다. 예를 들어 많은 통합된 미세 장치 흐름을 중지 하거나 microchannels에서 미리 정의 된 영역을 축소 하 여 흐름 방향을 변경할. 그러나, 위치 및 개수 축소 됩니다 지역 재구성 하지 않습니다. 디지털 마이크로 유체 취급 능력의 다양 한 있지만, 각 작은 물방울의 볼륨에 의해 가능한 흐름을 크게 제한 한다. 또한, 세포 세포 배양의 같은 방울에 교양 때 추가적인 노력이 필요 증발 및 방울에서 가스 소모를 방지 하 고 osmolality 충격과 급격 한 pH 변화를 방지 합니다.
채널 기능 수준 갖추었을 실현, 우리 기계 요소를 동적으로 재구성 사용9에 때 그들의 배열의 구성 되어 움직이는 측 벽과 미세 장치를 제안 했다. 변형 측 벽을 형성 하기 위하여 작은 직사각형 핀이 핀 각 끝 정의 측 벽의 세그먼트 줄지어 있었다. 슬라이딩 핀 전송 허용 되는 측 벽의 변형 또는 셀, 거품, 및 채널 내 입자의 패턴을 허용. 죽은 볼륨을 최소화 하 고 극대화 갖추었을, 인접 한 핀 사이의 거리 최소화 했다. 그러나, 강력한 모 세관 행동에 작은 핀 내부 연결 사이 틈새와 아닌 외부 입력 핀 간격, 미디어 증발, 세균 이나 세포 독성 오염, 그리고 결국 셀을 일으키는 어떤 액체의 누설 원인 죽음입니다. 따라서, 우리는 주기적 핀 작업 및 장기 세포 문화10견딜 누출 무료 분할 된 측 벽 형 재구성 가능한 미세 채널을 개발 했습니다.
이 문서에서는, 우리는 셀 문화 영역에서 점진적 증가 따라 재구성 될 수 있다 분할 된 측 벽으로 미세 세포 배양 장치를 구축 하는 프로토콜을 제공 합니다. 개별 채널 측 벽의 기밀성이 형광 이미징 사용 하 여 테스트 됩니다. 세포 배양 호환성 및 세포 패터 닝의 능력 칩에 세포 배양을 사용 하 여 계산 됩니다.
이 미세 시스템은 적당 한 때마다 적절 한 채널 디자인 미리 결정 될 수 없습니다 요청 시 변경 해야 합니다. 예를 들어이 시스템 세포 성장 또는 마이그레이션, 흐름 또는 트랩 활성 nematodes 또는 채널에 예기치 않게 동작 하는 다른 작은 물체에 따라 채널 폭과 흐름 속도를 조정 하거나 다양 한 원시 샘플 또는 바이오 수락 하도록 사용 될 수 있는 아니 아직 생각 되었다 디자인의 때에.
Protocol
1. 에칭의 핀 (그림 2A)
- 아세톤에 침수에 의해 사각형 핀을 탈지 하십시오.
- 10% 질 산의 4 mL에 immersing 하 여 핀을 passivate 다음 오븐에서 30 분 65 ° C에서 솔루션을 열.
- 잔여 산을 제거 하 고 종이 타월로 건조 5 분 이온된 수에 핀 sonicate 담가 2 h.Sonicate에 대 한 금형 릴리스 에이전트의 0.5 mL에 핀 5 분 이온된 수에 핀.
- 에칭 접시 (그림 2C) 조작.
- 그리기 또는 통치자를 사용 하 여 유리 슬라이드에 4 m m 간격으로 두 개의 평행선을 새 기 면.
- Coverglasses 잘라 두 직사각형의 1 개의 표면에 화학 저항 및 낮은 점도 접착제를 적용 합니다.
- 4 m m 간격에 유리 슬라이드에 두 컷된 coverglasses 본드. 병렬 라인을 사용 하 여 가이드로.
- 에칭 접시에 실리콘 접착제의 두 줄을 분배 (윤곽선의 크기와 위치에 대 한 그림 2C 를 참조).
참고: 3D 인쇄 템플릿 (STL 모델 파일은 보충 자료 포함) 쉽고 정확 하 게 라인을 그릴 데 도움이 됩니다. - 그들의 바로 끝에 2 m m 긴 팁 접착 라인 패턴으로 몰입 하는 핀 에칭 접시에 넣어. 다시 핀 완전히 덮여 있다 고는 윤곽을 그리는 접착제 분배. 38 ° c가 열 습도 fermenter에 에칭 접시를 전송 접착제를 치료 하는 하룻밤을 기다립니다.
- 유리 제 작은 유리병에 천천히 5.0 M 염 산의 0.2 mL에 0.5 M 질 산의 0.2 mL를 추가 합니다.
주의: 혼합로 알려진 또한 아쿠아 레 지아은 매우 부식성 및 잠재적으로 폭발성입니다. 산 증거 고무 장갑과 안전 고글을 착용 하 고 산을 처리 하는 경우 극단적인 주의. 솔루션을 저장 하지. 질소 산의 공격 성 감소를 최대한 줄입니다. - 65 ° c.에가 열 된 열판에 에칭 접시를 넣어 핀의 발견된 지역 산 성 혼합물의 0.4 mL 붓는 다. 10 분을 기다려 하 고 비 커에 염 산을 전송.
- 이온을 제거 된 물에서 0.8 M 탄산 솔루션의 5 mL와 핀의 에칭된 지역을 포함 한 모든 나머지 산을 중화.
- 핀셋으로 경도 핀을 당겨 에칭 접시에서 핀을 제거 합니다. 5 분 뒤에 5 분 동안 아세톤에 쥡니다 이온된 수에 핀 sonicate
- 1.2 단계에서 핀의 에칭된 지역 passivate
- 십자선 상점 현미경 에칭된 핀의 폭을 확인 하십시오. 에칭 영역의 너비는 0.2 ± 1.7에 설명 된 에칭 시간 조절 0.02 m m.
- 70% 에탄올 5 ml를 포함 하는 유리 유리병에 핀을 전송. 층 류 후드에 유리병을가지고. 유리병에서 핀을 선택 하 고 건조 하도록 허용.
2. 저수지와 핀 공간 실리콘 슬 래 브의 제조.
- 전형적인 석판 인쇄 프로세스에 의해 핀을 고정된 측 벽 공간에 대 한 금형을 조작.
- 코트의 부정적인 에폭시 감광 제 1000 rpm 스핀 coater를 사용 하 여 1 mL와 탈지 유리 슬라이드. 한 번 15 분 반복에 대 한 95 ° C 뜨거운 접시에 감광이이 단계 건조.
- 스핀 코트 감광 제 코팅된 된 유리 슬라이드에 2000 rpm에서 동일한 감광의 세 번째 계층. 30 분 동안 95 ° C 열판에 감광 드라이.
- Photoplotted 영화를 통해 UV 반점 빛 소스에서 포토 레지스트 층 450 mJ/cm2 365 nm 자외선의 노출. 손 스프레이 어를 사용 하 여 용 매 (2-methoxy-1-methylethyl 아세테이트)를 분사 하 여 15 분 개발에 대 한 95 ° C 열판에 노출 된 포토 레지스트는 포토 레지스트를 구워 고 질소 가스와 함께 타격 건조.
- 플라스틱 접시의 하단에 포토 레지스트 패턴화 된 유리 슬라이드를 놓습니다.
- Prepolymer입니다 (PDMS)의 3 m m의 두께를 몰드에 붓으십시오. 10 분 동안-800 kPa에서 진공 desiccator에서 PDMS prepolymer debubble
- 치료 1 h. Demold 65 ° C에서 오븐에서 PDMS prepolymer 부분적으로 치료 PDMS 슬 래 브는 메스를 사용 하 여. 오븐에서 1 h 동안 120 ° C에서 PDMS는 완전히 치료.
- 지침 패턴 따라 같은 메스와 PDMS 슬 래 브에서 멀리 불규칙 한 가장자리를 잘라 주세요. 정확 하 고 특히 핀에 대 한 삽입 슬롯(참조 그림 1)를정의 하는 표면에 가능한 상처를 청소.
- 생 검 펀치를 사용 하 여 PDMS 슬 래 브의 주요 채널의 끝에 입구/출구에 대 한 2 m m 직경 구멍 구멍. 마찬가지로, 공기 통풍구 채널의 끝에 1 m m 직경 구멍 구멍. 그림 1A 채널 레이아웃 및 이러한 구멍의 위치에 대 한 참조.
3. 갭 필러 및 방 벽의 장소에서 제조와 소자의 조립.
- 조작 아닌 어셈블리.
- 10 분 동안 60 ° C에가 열 하는 청소 솔루션에 10 × 20 mm 4 coverglass 담가.
- 이온을 제거 된 물으로 coverglasses를 두 번 헹 구 고 10 분 동안 120 ° C에서 건조.
- 플라즈마-본드는 PDMS는 coverglass 슬 래 브:
- PDMS 슬 래 브 (채널 기능 쪽)와 청소 10 × 20 mm 4 coverglass 스퍼터 coater의 진공 챔버에 배치 합니다.
- 60 실바 생성 공기 진공 플라즈마 챔버 내려 펌핑 시작 (20 mA) 30 s.
- 즉시 챔버 환기. 본드는 PDMS의 채널 기능 측면 그들의 가장자리는 coverglass에 슬라브 정렬.
- 10 분 동안 65 ° C 오븐에서 보 세 레이어를 놓습니다.
- 살 균 컨테이너를 사용 하 여 층 류 후드를 보 세 레이어를 가져와. 30 분 동안 자외선과 그들을 소독.
- 층 류 후드 슬롯에 핀은 아닌의 다른 측 벽을 형성 하는 그들의 끝을 삽입 합니다. 인접 한 핀 다른 길이 (참조 그림 1B) 수직 양쪽의 접촉을 피하기 위해 해야 합니다. 큰 간격 수직 끝 낫다입니다. 공간 (N-1) × (핀 폭) 때 다른 핀 길이 ( 그림 2AL )와 핀의 N 종류 준비가 가능 하다.
- ( 그림 2B) 기본 조작.
- 또는 기지의 부품 파일을 읽고 확인 하 고 두 개의 수치 제어 (NC) 파일 (포함 된 공구 경로, 보충 자료로 포함) CAD/CAM 소프트웨어를 사용 하 여. 첫 번째 추가 NC 파일 4 mm 직경 엔드밀 및 1 m m 직경 끝 밀 초 사용 합니다.
- 3 m m 두께 취소 polymethylmethacrylate (PMMA) 보드 CNC 밀링 클램프.
- 컴퓨터 NC (CNC) 밀의 컨트롤러에 첫 번째 NC 파일을 엽니다. 엔드밀 4 m m CNC 선반을 설치 하 고 PMMA 보드 엔드밀 만져 부분 0을 찾습니다. 보드를 잘라 NC 코드를 실행 합니다.
참고: 때때로 끝 밀 팁 냉각 및 칩 제거를 위한 압축 공기를 불어. - 3.2.3 두 번째 NC 파일 및 1mm 엔드밀을 사용 하 여 반복 합니다.
- 세제와 가공된 부품 degrease 고 종이 수건으로 건조. 부품 70% 에탄올 스프레이 하 고 층 류 후드를 갖다.
- 핀 갭 필러와 탄성 장벽 조작:
참고: 단계 3.3.1-3.3.7 박판 모양 후드에서 aseptically 수행 되어야 한다.- 무게에 의해 백색 바 셀 린과 2:1 비율로 소계 분말을 혼합 하 여 갭 필러를 준비 합니다. 초음파 균질 화기를 사용 하 여 혼합 균질
- 디스펜서 주사기에 갭 필러를 부 어. 플런저를 삽입 하 고 주사기의 끝을 채우기 위해 밀어. 바늘을 연결 하 고 다시 바늘 팁 채워질 때까지 플런저를 밀어. 마찬가지로, 플런저와 바늘, 디스펜서 주사기를 준비 하 고 실리콘 접착제로 작성.
- 각 주사기는 어댑터 튜브를 사용 하 여 공기 분배기에 연결 합니다. 실리콘 접착제와 250 kPa와 280 kPa를 위한 디스 펜스 압력을 조정 합니다.
- 기지의 포켓의 가장자리에 실리콘 접착제 분배. 10 × 20 m m No.4 coverglass를 주머니에 놓고 본드로 단단히 누릅니다.
- 기지의 두 외부 슬롯에 따라 두 개의 세그먼트를 그리는 데 약 1 m m의 깊이에 실리콘 접착제 분배. 다른 슬롯에 따라 세그먼트를 그릴에 깊이 약 1 m m의 갭 필러를 분배.
- 다른 포켓의 가장자리에 실리콘 접착제 분배. 주머니에 아닌 어셈블리 (3.1)을 놓고 본드로 단단히 누릅니다.
- 3.3.5 갭 필러와 실리콘 접착제 완전히 핀 포함 하 고 슬롯에 아무 여가를 반복 합니다.
- 뚜껑을 가진 스테인리스 상자와 같은 살 균 컨테이너에 장치를 넣어. 38 ° c 습도 fermenter에 컨테이너 열을 전송 층 류 후드, 탄성 장벽 1 일에 대 한 치료.
- 각 핀 최대 1 mm 인접 한 핀 해제 치료 탄성 장벽에서 핀을 따라 이동 합니다.
- 30 분 동안 UV 빛을 가진 장치를 소독.
4입니다. 미세 소자의 평가
- 형광을 사용 하 여 누설을 감지
- 아닌 훌륭한 도구 또는 데스크탑 로봇을 사용 하 여 엽니다. 가능한 채널에 걸쳐 일관 된 채널 너비를 확인 합니다.
- 녹색 형광 염료 형광 솔루션 10 µ M에서 이온을 제거 된 물으로 희석.
- micropipettor와 아닌의 끝 포트 중 하나에 형광 솔루션을 추가 합니다. 이 단계는 솔루션 채널을 채울 것입니다.
- 미세 장치 및 큰 플라스틱 접시에 이온을 제거 된 물으로 젖은 흡수 성 종이 두 조각을 넣어. 적어도 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.
- 현미경 카메라로 거꾸로 형광 현미경으로 아닌의 녹색 형광 이미지를 기록 합니다.
- 적절 한 이미지 분석 소프트웨어와 형광 이미지를 열고 누설 (그린 형광)는 갭 필러 및 핀의 인터페이스에서 확인 합니다.
- 종자는 아닌 게 셀.
- 70-80% (종류)에 따라 confluent 셀을 포함 하는 셀 문화 선박을 준비 합니다. 분리 하 고 성장 매체에 셀 중단.
- 셀 (속도 시간 셀 형식에 따라), 원심 및 매체를 발음.
- 중간의 작은 양의 셀 resuspend 셀 카운터로 셀 고 셀 밀도 1.5 × 106 에서 1.5 × 107 셀/mL를 조정 합니다.
- 아닌 바로 400 µ m 전체 채널 수 있도록 좋은 도구 또는 데스크탑 로봇 (그림 1B)를 사용 하 여 엽니다. 가능한 채널을 통해 평면으로 측 벽을 핀 위치를 조정 합니다. 세포 현 탁 액은 아닌의 끝 포트 중 하나에 추가 하 고 채널을 채우기.
- 문화를 시작 하는 영역의 측 벽을 정의 하는 핀 중 하나를 찾습니다. 거꾸로 현미경 셀 셀 문화 영역에 포함 하려면 두 개의 인접 한 핀을 닫습니다.
- 순서에 내부 외부 채널에서 모든 셀을 추방 하는에서 모든 핀을 닫습니다. 부드럽게 발음 끝 포트에서 정지 하 고 그들에 게 매체를 추가 합니다.
- 4.1.4에 설명 된 대로 장치를 품 어. 때 세포는 약 70-80 %confluent, 문화 영역을 넓혀 핀을 열고 천천히.
Representative Results
재구성 가능한 아닌의 건설은 그림 1에 표시 됩니다. 여러 개의 직사각형 핀 유리 기판에 배치 했다 고 핀의 긴 측 접촉에서 했다 그래야 줄지어 있었다. PDMS 시트와 펀치 구멍 및 핀 높이 같은 깊이의 쉬는 시간 덮여 채널 입구/출구 저수지, 채널, 천장과 핀 구성 되어 채널 벽 반대 다른 측 벽을 형성 하는 핀의 끝. 핀, 벽 (PDMS 시트의 얼굴 중 하나), 그리고 유리 기판으로 둘러싸인 지역 한 미세 채널을 형성 합니다.
앞에서 설명한 대로 제안 된 미세 시스템의 갖추었은 매우 작지만 0이 아닌 간격으로 병렬로 배치 하는 많은 작은 핀에 의해 이루어집니다. 이전 보고서에서 문제는 격차를 통해 모 세관 효과 의해 생성 하는 강한 흐름을 했다. 이 문제를 해결 하려면 간격 처음 갭 필러와 함께 가득 차 있었다. 이 프로토콜에서 점성 탄화수소와 플라스틱 분말의 분산 혼합 갭 필러로 사용 되었다. 그러나, 갭 필러 자체는 또한 모 세관 효과. 따라서, 그림 1에서 보듯이, 탄화수소/플라스틱 갭 필러와 갭 필러의 외부 둘레의 주위에 형성 하는 탄성 장벽 결과 재구성 가능한 아닌이 있다. 핀의 중간 숱이 충분 한 양의 두께 보장 하기 위해 갭 필러 및 2 개의 핀 사이 탄성 방 벽의 힘을 필요 합니다.
그림 2 A 측 벽 세그먼트를 형성 하는 핀의 그림을 보여줍니다. 스테인레스 스틸 학년 316 L 부식 저항 및 낮은 leaching 속성 자료로 선정 되었다. 그러나, 여분의 패 시 베이 션 과정 호환 핀 세포 배양을 만들 것을 요구 했다. 핀 측 벽 세그먼트를 성공적으로 털 없이 정확 하 게 직사각형 팁을가지고 있어야 합니다. 또한, 핀 핀 핸들을 추진 하 여 쉽게 이동할 수 있도록 "핸들"을가지고 있어야 합니다. 때문에 각 핀에는 좁은 가운데, 핀 사이 고무의 두께 핀 운동으로 인 한 전단 저항 하기 충분 했다. 장치에 구성 된 다른 부분과 달리 전기 방전 (EDM) 작은 가공의 가장 정확 하 고 비용 효율적인 방법 중 하나 이기 때문에 가공 전문 회사에서 중간 숱이 제외 하 고 핀의 제조를 주문 하드 금속 부품입니다. 자신을 에칭에 의해 중간 숱이 수행 가공 비용 및 절곡 하거나 가공 중의 위험을 줄일 수 있습니다.
갭 필러, 탄성 장벽, 그리고 결국 재구성 가능한 아닌의 watertightness 제대로 작동 확인, 누수 탐지 형광에 의해 사용 되었다. 그림 3 에서 3 일 후에 아닌 형광 추적 염료를 포함 하는 물으로 채워졌다 탄성 방 벽의 가장자리 근처의 형광 이미지를 보여준다. 형광 이미지는 탄성 방 벽의 보이는 가장자리에서 약 200 µ m의 깊이 도달 하는 채널을 채우는 액체를 보여줍니다. 그러나, 액체 도달 하지 않았다는 갭 필러. 또한, 탄성 장벽을 통해 갭 필러의 누설은 관찰 되었다. 이 관측은 핀 및 탄성의 좁은 중간 사이 꽉 맞는 격차를 통해 액체의 마이그레이션 방지 나타냅니다.
마지막으로, 우리는 점차적으로 재구성 가능한 미세 장치 그림 4A의 측 벽을 확장 하 여 적응 하는 문화 영역으로 장기 세포 배양을 수행. 0 d, 세포의 작은 수 셀 핀 폭 및 다른 발음 했다 한 공간 내에서 국한 되었다. 2 d 셀 아래쪽 표면에 연결 된 고 확산 시작 했다. confluency은 여전히 낮은 모든 셀은 명확 하 게 볼 수 있도록 두 개의 핀 제거 했다. 5 d, 세포 증식을 계속 하 고는 confluency 증가 합니다. 6 d 9에서 다른 2 개의 핀 셀 underconfluent 유지 하 철회 했다. 문화 영역의 점진적 확장의 효과 그림 4B에 표시 됩니다. 빼낸 철회 했다 하루에 셀 밀도의 급격 한 변화 했다. 그러나 일반 세포 배양에 본 지는, 세포 수의 성장 속도 상수, 유지 되었다.
그림 1 : 한 핀 분할 sidewall 재구성 가능한 미세 장치. (A) 부품 및 재구성 가능한 미세 소자의 건설. 장치 한 스트레이트 채널 10 스테인레스 스틸 핀 PDMS/유리 아닌 기능에 삽입의 끝으로 한 측면 있다. 갭 필러와 탄성 장벽 핀 간격을 통해 새 기에서 액체를 방지 합니다. Coverglasses, 갭 필러와 탄성 장벽 기본 polymethylmethacrylate (PMMA)에 고정 됩니다. (B) 자동 핀 조작 금속 시트에서 만든 엔드 이펙터 3 축 데스크탑 로봇에 고정 됩니다. 하나의 핀을 이동 하려면 엔드 이펙터의 수직 끝을 못 살게 굴지. 다른 길이 핀 핀 폭의 3 배 간격으로 배치 됩니다. 간격 끝 이펙터 동료 한 핀 한 번에 충분 한 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 프로토콜에 사용 되는 가공된 부품의 기계 그림. 단위는 밀리미터; R 나타냅니다 반지름 치수; 사각형 기호 (□) 나타냅니다 평방 기능; t 는 두께 나타냅니다. (A)는 316l 스테인레스 스틸 핀 sidewall의 일환으로. 핀 주문 하 고 설명 된 대로 가공 될 수 있다. 개 뼈 같은 모양 수 있도록 핀 중간의은에 반영 되지이 그림 때문에이 가공 하는의 일환으로 주문 하지는 하지만 프로토콜의 일환으로 수행 되었다. (B) 핀 운동에 대 한 장소에서 coverglasses, 갭 필러와 탄성 장벽 보유 하는 polymethylmethacrylate (PMMA) 기지. (C) 핀의 중간을 식 각 하는 데 사용 되는 에칭 요리. 구축 하기 위해 에칭 접시, 유리의 4 개의 조각 실리콘 접착제를 사용 하 여 보 세는. 실리콘 접착제의 등고선 패턴의 핀 배치 도면에 표시 된 대로 접시에 다음 접시에 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 핀 간격을 통해 재구성 가능한 아닌에서 누설의 형광 탐지. 재구성 가능한 아닌 작성 녹색 형광 염료의 형광 이미지에 갭 필러 (불투명)으로 구성 된 물개 구조 단계 대조 이미지 중첩 및 탄성 (반투명). 고무 방 벽의 가장자리 초승달 모양-같은 기능으로 볼 수 있으며, 위의 점선;로 표시 고무 방 벽 및 갭 필러 간의 인터페이스 문의 검은 지역 초승달 모양-같은 기능으로 표시 되 고 낮은 점선으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 가변 셀 문화 영역 재구성 가능한 아닌 진보와 지속적인 세포 성장. (A) 측 벽을 이동 하 여 갇혀 셀 문화 영역에서 COS-7 세포 성장. (B) 성장 곡선 및 시간 진화의 A에 표시 된 재구성 가능한 아닌에 가변 크기 문화 영역에 COS-7 세포의 밀도). 3 수직 화살표 각각 2, 5, 및 6 d, 셀 문화 영역의 확장을 나타냅니다. 세포 수, 뿐만 아니라 셀 밀도 동일한 문화 영역, 각 지 수 성장 곡선을 개별적으로 장착 하 고 시간을 추정 하는 현지 배로 (td [h])는 프레임에 표시 된 사용에 대 한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
핀 분할 아닌은 갖춘 미세 채널, 그리고 우리는 그것이 분명히 높은 갖추었을 모든 기존 미세 채널 비교 채널 형태로 믿습니다. 우리가 여기 제공 하는 프로토콜에는 점차적으로 오랜 기간 동안 confluency에서 문화를 계속 셀 문화 표면 영역을 확대와 함께 세포 배양의 미세 장치 수 있게 된다. 장치 또한 미리 기판 또는 어떤 다른 시간에 디자인 또는 제조에 단백질 패턴 없이 셀에서 채널 패턴을 제공 합니다. 또한,이 재구성 가능한 미세 장치 쉽게 그러한 어려운 흐름 자료의 처리 장치를 처리할 수 있는 매우 몇몇 기존 미세 구현 하는 것을 도울 것 이다 강한 채널에서 변위 흐름을 생성 합니다. 즉, 세포 및 다른 미생물, 가스, 및 기타 비-유체 간의 상호 작용 장치 디자인에서 큰 수정 없이이 장치를 사용 하 여 평가할 수 있습니다.
우리는 채널의 한 입구 외부 흐름 제어 방법으로 라플라스 압력 또는 액체 정역학 압력 적용 간주 있다. 우리는 핀과 채널의 천장/바닥 사이의 격차를 통해 공기 환기 채널 쪽으로 흐름 생성 됩니다 때문에 죽은 끝에 액체 추진 권장 하지 않습니다. 많은 액체 작업 같은 핀 작업을 필요 하지 않습니다. 예를 들어 혼합 한 핀 (즉, 이동 1 개의 핀만 앞뒤로 여러 번) 액체를 mashing에 의해 수행할 수 있습니다.
장치의 가장 중요 한 부품은 핀입니다. 길이 정밀, 병렬 처리, 직각도 및 표면 품질은 핀, 처럼 그들은 아닌 형성 해야 합니다 원활 하 게 이동 해야 하 고 인접 한 핀의 움직임을 안내 합니다 합니다. 따라서, 핀 그림 2A와 유사한 그림을 제출 하 여 정밀 가공 전문 회사에서 주문 해야 하는 것이 좋습니다. 추가 기하학적 치수를 요구 하는 회사와 명시적 표면 거칠기 방향 수 있습니다. 그러나, 핀 그들은 신중 하 게 처리 하 고 때때로 질소 산 패 하는 경우 다시 사용할 수 있습니다.
탄성 방 벽은 또 다른 중요 한 기능, 그리고 그것의 형성은 소자의 제조 공정에서 가장 중요 한 단계. 정확 하 게 가공 된 자료는 반복 하 고 안정적인 결과를 얻이 필요 합니다. Uncured 장벽에 핀을 배치 또한 중요 한 단계입니다. 핀 잘 정렬 및 갭 필러와 기포 없이 장벽에 포함 된 유지 되어야 한다. 다음이 단계는이 미세 소자와 일반적인 문제는 핀을 통해 누설 방지.
이 장치를 사용 하 여 다른 일반적인 문제는) frictionally 제 핀, 및 b) 세포 죽음, 그리고 낮은 성장 율. 가능한 원인에 대 한 한) 핀 팁 높이 실리콘 석판에 대 한 금형에 포토 레지스트 층의 높이 사이 에칭된, 표면 및 치수 부적합의 핀 중간, 불 쌍 한 품질의 고르지 못한 테이퍼 (물결 모양) 에칭을 포함. Etchant 배합, 온도, 그리고 동요의 조정 핀 운동을 향상 시킬 수 있습니다. 또한, 왁 스 또는 접착제를 사용 하지 않고 피팅 재판 문제를 해결 하기 위해 힌트를 제공 합니다. 가능한 요인 b에서) 핀, 오류 탄성 장벽에 대 한 접착제의 선택에는 접착제의 불완전 한 치료의 부족 한 패 시 베이 션은. 일부 세포는 세포 접착을 홍보 하는 고분자 단백질 또는 다른 fibronectin 아닌 내부 코팅이 필요할 수 있습니다. 또한, 셀 문화 연습 trypsinization 등 원심 분리에에서 최적화는 아닌 죽은 세포를 줄일 것 이다.
제시 제조 프로토콜의 한계 중 하나는 측 벽 중 하나만 분할은 이다.입니다. 채널의 갖추었을 것 두 측 벽 핀 배열에 의해 구축 되어 있으면 더욱 향상 됩니다. 핀 및 더 이상 제조 단계의 금액을 두 번 필요 합니다, 비록 기술적으로 실행 가능한 옵션입니다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 연구는 KAKENHI (20800048, 23700543)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
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