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Bioengineering

पिन-discretized Sidewalls के साथ पुनर्विन्यास Microfluidic चैनल

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/57230
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, Shibaura Institute of Technology

Summary

विकृत sidewalls के साथ एक microfluidic चैनल का उपयोग करते समय प्रवाह नियंत्रण, कण हैंडलिंग, चैनल आयाम अनुकूलन और अन्य पुनर्विन्यास प्रदान करता है. हम पिन है कि उनके आकार को बदलने के लिए अनुमति देता है की एक सरणी के बने sidewalls के साथ एक microfluidic चैनल के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

Microfluidic घटकों विभिंन आकार है जैसे मिश्रण, जुदाई, कण फँसाना, या प्रतिक्रियाओं के रूप में विभिंन कुंजी Microfluidic कार्यों का एहसास है की जरूरत है । चैनल आकार को बनाए रखते हुए निर्माण के बाद भी विकृत करता है कि एक microfluidic चैनल उच्च spatiotemporal पुनर्विन्यास सक्षम बनाता है. इस पुनर्विन्यास में आवश्यक है ऐसे प्रमुख microfluidic फ़ंक्शन जो मौजूदा "पुनर्विन्यास" या "एकीकृत" microfluidic प्रणालियों में प्राप्त करना कठिन है. हम एक विकृत sidewall आयताकार पिंस के सिरों के बाद संरेखित सरणी के साथ मिलकर एक microfluidic चैनल के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन । Actuating उनके अनुदैर्ध्य दिशाओं में पिन ' पिन अंत पदों में परिवर्तन, और इस प्रकार, discretized चैनल sidewalls के आकार. पिन अंतराल meniscus बलों की वजह से आसंन पिन के लिए अवांछित रिसाव या आसंजन पैदा कर सकता है । पिन अंतराल को बंद करने के लिए, हमने हाइड्रोकार्बन-फ्लोरो सस्पेंशन-आधारित गैप भराव को elastomeric बैरियर के साथ पेश किया है । इस पुनर्विन्यास microfluidic डिवाइस मजबूत लौकिक में चैनल विस्थापन प्रवाह उत्पन्न कर सकते हैं, या चैनल के किसी भी क्षेत्र में प्रवाह को रोक सकते हैं । इस सुविधा की मांग पर सुविधा होगी, कोशिकाओं की हैंडलिंग, चिपचिपा तरल पदार्थ, गैस बुलबुले, और गैर तरल पदार्थ, भले ही उनके अस्तित्व या व्यवहार निर्माण के समय अज्ञात है ।

Introduction

Microfluidic उपकरणों-सूक्ष्म आकार के उपकरणों है कि तरल और उनके प्रवाह की छोटी मात्रा में नियंत्रण-एक "चिप" वृद्धि पोर्टेबिलिटी के साथ प्रारूप में जैव चिकित्सा प्रक्रियाओं के miniaturization की पेशकश और, अक्सर, सामर्थ्य । के रूप में हाल ही में एक समीक्षा1में वर्णित है, विभिंन microfluidic रिक्त स्थान और सकारात्मक सुविधाओं से मिलकर घटकों जैसे मिश्रण, जुदाई, कण फँसाने, या प्रतिक्रियाओं के रूप में बुनियादी और प्रमुख द्रवित कार्यों का एहसास विकसित किया गया है ।

जबकि कई microfluidic उपकरणों के व्यवहार डिजाइन चरण में निर्धारित किया जाता है, microfluidic उपकरणों के कुछ प्रकार के बाद उनकी संरचना या व्यवहार के निर्माण परिवर्तन की अनुमति । यहाँ हम "विन्यास" के रूप में इस सुविधा का उल्लेख. microfluidic प्रणालियों की पुनर्विन्यास आम तौर पर समय और एक डिवाइस डिजाइन करने के लिए आवश्यक लागत कम कर देता है, और/या समय के साथ microfluidic लेआउट या कार्यों का अनुकूलन सक्षम बनाता है ।

पहले वर्णित पुनर्विन्यास microfluidic डिवाइस निम्न तीन श्रेणियों में आते हैं । पहले में, elastomeric चैनलों के विरूपण प्रवाह दर और दिशाओं उपयोग के दौरान परिवर्तित करने के लिए अनुमति देता है । पुनः विन्यास प्राप्त करने के लिए, elastomeric चैनलों वायवीय दबाव स्रोतों के रूप में विभिन्न बाहरी और नियंत्रणीय बलों द्वारा विकृत कर रहे हैं2, ब्रेल प्रेरक3, या संपीड़न सील4. दूसरे में, विन्यास उपकरणों ऐसे बहु परत द्रव सर्किट के रूप में मॉड्यूलर डिजाइन, पर भरोसा करते हैं, चुंबकीय संयोजी के साथ मॉड्यूलर चैनल, और टयूबिंग आधारित microfluidics5. तीसरे में, डिवाइस ही पुनर्विन्यास नहीं है, लेकिन इलेक्ट्रोड arrays पर microdroplet परिवहन (अक्सर डिजिटल microfluidics के रूप में जाना जाता है)6,7 और हैंगिंग ड्रॉप आधारित microfluidic उपकरणों पर8 सक्षम मांग प्रवाह या द्रव के मार्ग स्विचन ।

बहरहाल, इन reविंयास के कई टोपोलॉजिकल और macroscopic के स्तर पर सीमित हैं । उदाहरण के लिए, कई एकीकृत microfluidic उपकरणों के प्रवाह को रोकने या पूर्वनिर्धारित क्षेत्रों में microchannels गिर द्वारा प्रवाह की दिशा बदल जाते हैं । हालांकि, स्थिति और ढह जा करने के लिए क्षेत्रों की संख्या पुनर्विन्यास नहीं कर रहे हैं । हालांकि डिजिटल microfluidics द्रव हैंडलिंग क्षमताओं की एक किस्म है, संभव प्रवाह काफी हद तक प्रत्येक छोटी बूंद की मात्रा तक सीमित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, जब सेल संस्कृति मीडिया के इस तरह की बूंदों में संस्कृति रहे हैं, अतिरिक्त प्रयास वाष्पीकरण और बूंदों से गैस अपव्यय को रोकने के लिए और परासरणीयता सदमे और अचानक पीएच परिवर्तन से बचने की जरूरत है ।

चैनल सुविधा स्तर के विन्यास का एहसास करने के लिए, हम चल sidewalls के साथ एक microfluidic डिवाइस का प्रस्ताव किया है कि मशीन तत्वों की arrays शामिल गतिशील उंहें पुनः कॉंफ़िगर जब9का उपयोग करें । एक विकृत sidewall फार्म करने के लिए, छोटे आयताकार पिंस ऊपर लाइन में खड़ा किया गया था कि पिन के प्रत्येक छोर sidewall के एक खंड परिभाषित । पिन फिसलने sidewall जो परिवहन या कोशिकाओं के नमूनों की अनुमति की विकृति की अनुमति दी, बुलबुले, और चैनल के अंदर कणों. मृत मात्रा को कम करने और विन्यास को अधिकतम करने के लिए, आसंन पिन के बीच की दूरी को कम किया जाना था. हालांकि, मजबूत केशिका कार्रवाई microchannel के अंदर और बाहर जोड़ने पिंस के बीच छोटे अंतराल पर अभिनय पिन गैप में प्रवेश करने के किसी भी तरल के रिसाव का कारण बनता है, मीडिया वाष्पीकरण के कारण, बैक्टीरियल या साइटोटोक्सिक संदूषण, और अंततः सेल मौत. इसलिए, हम है कि चक्रीय पिन कार्रवाई और लंबी अवधि के सेल संस्कृति को झेलने के रिसाव मुक्त discretized sidewall-प्रकार विन्यास microfluidic चैनल विकसित किया है10.

इस अनुच्छेद में, हम एक discretized sidewall कि सेल संस्कृति क्षेत्र में क्रमिक वृद्धि के बाद reconfigured किया जा सकता है के साथ microfluidic सेल संस्कृति उपकरण बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । असतत चैनल sidewalls की हवा प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर परीक्षण किया है । कोशिका-संस्कृति की अनुकूलता और कोशिका के नमूनों की क्षमता का उपयोग ऑन-चिप सेल कल्चर का मूल्यांकन किया जाता है.

इस microfluidic प्रणाली उपयुक्त है जब भी उपयुक्त चैनल डिजाइन पूर्व निर्धारित नहीं किया जा सकता है और मांग पर बदला जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, चैनल चौड़ाई और प्रवाह दर कक्ष वृद्धि या माइग्रेशन के आधार पर समायोजित करने के लिए, चैनल में अनपेक्षित रूप से व्यवहार करने वाले सक्रिय सूत्रकृमि या अन्य छोटे ऑब्जेक्ट्स को प्रवाहित या ट्रैप करने के लिए, या विभिन्न अपुष्ट नमूनों या उत्पादों को स्वीकार करने के लिए इस सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है जो डिजाइन के समय अभी तक कल्पना नहीं की गई थी ।

Protocol

1. पिन के नक़्क़ाशी (चित्रा 2एक)

  1. एसीटोन में विसर्जन द्वारा चिकना आयताकार पिंस ।
  2. Passivate 10% नाइट्रिक एसिड के 4 मिलीलीटर में डुबो कर पिन, तो एक ओवन में 30 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्मी ।
  3. Sonicate पानी में पिन 5 मिनट के लिए अवशिष्ट अंल को हटाने के लिए और एक कागज तौलिया के साथ सूखी । 2 ज. Sonicate के लिए मोल्ड रिलीज एजेंट के ०.५ मिलीलीटर में पिन विसर्जित 5 मिनट के लिए जल में पिंस ।
  4. एक नक़्क़ाशी पकवान (चित्रा 2सी) बनाना ।
    1. ड्रा या एक शासक का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर एक 4 मिमी अंतराल के साथ दो समानांतर लाइनें लिख ।
    2. दो आयताकार कट coverglasses की एक सतह के लिए एक रासायनिक प्रतिरोधी और कम चिपचिपापन चिपकने लागू करें ।
    3. बांड एक 4 मिमी के अंतराल पर ग्लास स्लाइड पर दो कट coverglasses । समानांतर रेखा का उपयोग मार्गदर्शिका के रूप में करें ।
  5. खोदना पकवान पर सिलिकॉन चिपकने वाले की दो पंक्तियों को बांटना ( चित्रा 2स्थिति और समोच्च के आकार के लिएसी देखें) ।
    नोट: 3डी-प्रिंटेड टेम्प्लेट (एक STL मॉडल फ़ाइल को पूरक सामग्री के रूप में शामिल किया जाता है) लाइनों को आसानी और सटीकता से आरेखित करने में मदद करेगा.
  6. नक़्क़ाशी पकवान पर पिन रखो ताकि उनके सीधे सिरों पर 2 मिमी लंबे सुझावों चिपकने वाला लाइन पैटर्न में डूबे हुए हैं । चिपकने फिर से वितरण सुनिश्चित करें कि पिन पूरी तरह से कवर कर रहे है और एक समोच्च आकर्षित करने के लिए । एक humidified ३८ ° c करने के लिए गरम किण्वन के लिए नक़्क़ाशी पकवान स्थानांतरण । चिपकने का इलाज करने के लिए रात भर रुको ।
  7. एक गिलास शीशी में ५.० m हाइड्रोक्लोरिक एसिड के ०.२ मिलीलीटर के लिए ०.५ एम नाइट्रिक एसिड की ०.२ मिलीलीटर जोड़ें ।
    चेतावनी: मिश्रण, भी एक्वा regia के रूप में जाना जाता है, बहुत संक्षारक और संभावित विस्फोटक है । एसिड प्रूफ रबड़ के दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहनें, और जब एसिड हैंडलिंग अत्यधिक सावधानी बरतें । कभी भी समाधान की दुकान नहीं । नाइट्रिक एसिड को कम करने के लिए अपनी आक्रामकता में कमी संभव ।
  8. ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम एक चूल्हा पर नक़्क़ाशी पकवान रखो । पिन के उजागर क्षेत्र पर एसिड मिश्रण की ०.४ मिलीलीटर डालो । 10 मिनट रुको और एक चोंच के लिए एसिड हस्तांतरण ।
  9. जल में ०.८ मीटर सोडियम बिकारबोनिट समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ पिन के धंसा क्षेत्र सहित शेष सभी एसिड को बेअसर ।
  10. पिन चिमटी के साथ longitudinally खींच द्वारा नक़्क़ाशी पकवान से पिन निकालें । Sonicate 5 मिनट के लिए एसीटोन में sonication द्वारा पीछा ५ मिनट के लिए जल में पिन ।
  11. पिन के रूप में १.२ चरण में धंसा क्षेत्र Passivate ।
  12. एक लजीला के साथ एक दुकान माइक्रोस्कोप के साथ धंसा पिन की चौड़ाई की जाँच करें । १.७ में वर्णित नक़्क़ाशी समय समायोजित करें ताकि धंसा हुआ क्षेत्र की चौड़ाई ०.२ ± ०.०२ मिमी है ।
  13. एक गिलास ७०% इथेनॉल के 5 मिलीलीटर युक्त शीशी को पिन स्थानांतरण । एक लामिना हूड के लिए शीशी लाओ । शीशी से बाहर पिन उठाओ और उंहें शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।

2. जलाशयों और पिन के लिए एक जगह के साथ सिलिकॉन स्लैब का निर्माण ।

  1. पिन के लिए एक जगह है और ठेठ lithographic प्रक्रियाओं द्वारा एक निश्चित sidewall के लिए एक मोल्ड बनाना ।
    1. कोट नकारात्मक epoxy photoresist के 1 मिलीलीटर के साथ एक चिकना ग्लास स्लाइड १,००० rpm पर एक स्पिन कोट का उपयोग कर । 15 मिनट के लिए एक ९५ डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर photoresist सूखी इस कदम को एक बार दोहराएं ।
    2. स्पिन कोट लेपित photoresist के साथ कांच स्लाइड पर २,००० rpm पर एक ही photoresist की तीसरी परत । 30 मिनट के लिए एक ९५ ° c चूल्हा पर photoresist सूखी ।
    3. एक photoplotted फिल्म के माध्यम से ३६५-एनएम पराबैंगनी प्रकाश एक यूवी स्पॉट प्रकाश स्रोत से ४५०/2 के लिए photoresist परत बेनकाब । 15 मिनट के लिए एक ९५ डिग्री सेल्सियस चूल्हा पर उजागर photoresist बनाओ एक हाथ स्प्रेयर का उपयोग कर एक विलायक (2-methoxy-1-methylethyl एसीटेट) छिड़काव द्वारा photoresist विकसित करने, और नाइट्रोजन गैस के साथ झटका सूखी ।
    4. एक प्लास्टिक डिश के तल पर नमूनों photoresist के साथ कांच स्लाइड प्लेस ।
  2. मोल्ड पर polydimethylsiloxane (PDMS) के 3 मिमी की एक मोटाई के लिए बहुलक डालो । 10 मिनट के लिए-८०० केपीए में एक निर्वात desiccator में PDMS के लिए
  3. 1 घंटे के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS बहुलक इलाज आंशिक रूप से ठीक PDMS स्लैब एक स्केलपेल का उपयोग कर ढालना । पूरी तरह से 1 एच के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS इलाज ।
  4. दिशानिर्देश पैटर्न के साथ, एक ही स्केलपेल के साथ PDMS स्लैब से अनियमित किनारों दूर ट्रिम कर दीजिए । के रूप में सटीक बनाने के लिए और संभव के रूप में एक कट साफ, विशेष रूप से सतह कि प्रविष्टि स्लॉट को परिभाषित करता है पर पिन के लिए ( चित्रा 1एदेखें).
  5. छिद्रित 2 मिमी-प्रवेश के लिए व्यास छेद PDMS स्लैब का मुख्य चैनल के सिरों में आउटलेट का उपयोग कर बायोप्सी घूंसे. इसी प्रकार एयर वेंट चैनल के सिरों पर छिद्रित 1 मिमी-डायमीटर छिद्र हो जाते हैं । चित्रा 1चैनल लेआउट और इन छेद की स्थिति के लिएएक देखें ।

3. अंतर भराव और बैरियर के इन-प्लेस निर्माण के साथ डिवाइस की असेंबली ।

  1. एक microchannel विधानसभा किर ।
    1. 10 मिनट के लिए ६० ° c के लिए गरम एक सफाई समाधान में एक 10 × 20 मिमी No .4 coverglass विसर्जित कर दिया ।
    2. coverglasses कुल्ला पानी के साथ दो बार और शुष्क १२० ° c 10 मिनट के लिए ।
    3. प्लाज्मा-बांड PDMS स्लैब एक coverglass करने के लिए:
      1. PDMS स्लैब प्लेस (चैनल सुविधा की ओर) और साफ 10 × 20 mm No .4 coverglass एक धूम कोट के निर्वात चैंबर में ।
      2. ६० फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए चैंबर नीचे पंपिंग शुरू करो । 30 एस के लिए एयर वैक्यूम प्लाज्मा (20 mA) उत्पन्न
      3. तुरंत चैंबर में भड़ास निकाली । बांड PDMS स्लैब के चैनल सुविधा की ओर उनके किनारों के साथ coverglass को संरेखित ।
      4. 10 मिनट के लिए एक ६५ डिग्री सेल्सियस ओवन में बंधुआ परतों प्लेस ।
    4. एक लामिना हूड एक बाँझ कंटेनर का उपयोग करने के लिए बंधुआ परतों लाओ । उंहें 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ निष्फल ।
    5. लामिना हूड में, पिन स्लॉट में डालें ताकि उनके समाप्त होता है microchannel के अन्य sidewall के रूप में. सन्निकट पिन दोनों ऊर्ध्वाधर सिरों के संपर्क से बचने के लिए लंबाई में अलग होना चाहिए ( चित्रा 1बीदेखें). अनुलंब सिरों के बीच बड़ी रिक्ति बेहतर है । (n-1) × (पिन चौड़ाई) का एक स्थान संभव है जब विभिंन पिन लंबाई के साथ पिन के N प्रकार ( चित्रा 2मेंएक) तैयार कर रहे हैं ।
  2. एक आधार बनाना ( चित्रा 2बी) ।
    1. बनाने या आधार की एक हिस्सा फ़ाइल को पढ़ने और दो संख्यात्मक नियंत्रण (नेकां) फ़ाइलें (युक्त toolpaths; पूरक सामग्री के रूप में शामिल) सीएडी/ पहली पूरक नेकां फ़ाइल एक 4 मिमी व्यास अंत मिल और दूसरा एक 1 मिमी व्यास अंत मिल का उपयोग करता है ।
    2. एक सीएनसी मिल पर एक 3 मिमी मोटी स्पष्ट polymethylmethacrylate (पीएमएमए) बोर्ड दबाना ।
    3. एक कंप्यूटर नेकां (सीएनसी) मिल के नियंत्रक पर पहली नेकां फ़ाइल खोलें । सीएनसी मिल के लिए एक 4 मिमी अंत मिल स्थापित करें और पीएमएमए बोर्ड के लिए अंत मिल को छूने से भाग शून्य का पता लगाने. नेकां कोड को बोर्ड से काट कर चलाएं ।
      नोट: कभी कभार ठंडा और चिप हटाने के लिए संकुचित हवा के साथ अंत मिल टिप झटका ।
    4. दोहराएं 3.2.3 दूसरी नेकां फ़ाइल और एक 1 मिमी अंत मिल का उपयोग कर ।
    5. डिटर्जेंट और एक कागज तौलिया के साथ सूखे के साथ machined भागों चिकना । स्प्रे ७०% इथेनॉल के साथ भागों और उंहें एक लामिना हूड के लिए ले आओ ।
  3. एक पिन गैप भराव और elastomeric बैरियर बनाना:
    नोट: चरण 3.3.1-3.3.7 एक लामिना हूड में aseptically किया जाना चाहिए ।
    1. वजन से एक 2:1 अनुपात में सफेद वेसिलीन और polytetrafluoroethylene पाउडर मिश्रण से गैप भराव तैयार करें । एक अल्ट्रासोनिक homogenizer का उपयोग कर मिश्रण Homogenize ।
    2. एक मशीन सिरिंज में गैप भराव डालो । एक गोताख़ोर डालें और यह सिरिंज की नोक को भरने के लिए धक्का । एक सुई देते हैं और सुई टिप भर जाता है जब तक गोताख़ोर फिर से धक्का. इसी तरह, एक गोताख़ोर और एक सुई के साथ एक मशीन सिरिंज तैयार है, और सिलिकॉन चिपकने के साथ भरें ।
    3. एक वायवीय मशीन के लिए एक सिरिंज एक अनुकूलक ट्यूब का उपयोग कर कनेक्ट करें । २५० केपीए और २८० केपीए के लिए सिलिकॉन चिपकने वाला और भराव के लिए वितरण के दबाव को समायोजित करें ।
    4. आधार की एक जेब के किनारे करने के लिए सिलिकॉन चिपकने का वितरण । जेब पर एक 10 × 20 मिमी No .4 coverglass प्लेस और यह मजबूती से बांड के लिए दबाएँ ।
    5. आधार के दो बाहरी स्लॉट के साथ दो क्षेत्रों को आकर्षित करने के लिए लगभग 1 मिमी की गहराई के लिए सिलिकॉन चिपकने वाले वितरण । अंतर भराव को लगभग 1 मिमी की गहराई तक बांटें, अन्य स्लॉट के साथ सेगमेंट आकर्षित करने के लिए.
    6. एक और जेब के किनारे करने के लिए सिलिकॉन चिपकने का वितरण । जेब पर एक microchannel विधानसभा (३.१) प्लेस और यह मजबूती से बांड के लिए दबाएँ ।
    7. दोहराएं 3.3.5 कि दोनों अंतर भराव और सिलिकॉन चिपकने वाला पूरी तरह से पिन एंबेड और है कि वहां स्लॉट में कोई खोलने है सुनिश्चित करने के लिए ।
    8. इस तरह के ढक्कन के साथ एक स्टेनलेस स्टील बॉक्स के रूप में एक बाँझ कंटेनर में डिवाइस रखो. एक humidified ३८ ° c करने के लिए गरम किण्वन के लिए कंटेनर स्थानांतरण । लामिना हूड में, एक दिन के लिए elastomeric बाधा का इलाज ।
    9. ठीक elastomeric बाधा से पिन जारी करने के लिए आसंन पिन के साथ प्रत्येक पिन अप करने के लिए 1 मिमी ले जाएँ.
    10. 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ डिवाइस निष्फल ।

4. Microfluidic डिवाइस का मूल्यांकन

  1. प्रतिदीप्ति का उपयोग कर रिसाव का पता लगाएं
    1. एक ठीक उपकरण या एक डेस्कटॉप रोबोट का उपयोग कर microchannel खोलो । चैनल के रूप में संभव के रूप में चैनल में लगातार चौड़ाई बनाओ ।
    2. प्रतिदीप्ति समाधान बनाने के लिए 10 µ मीटर पर पानी के साथ एक हरी फ्लोरोसेंट डाई पतला ।
    3. एक micropipettor के साथ microchannel के अंत बंदरगाहों में से एक के लिए प्रतिदीप्ति समाधान जोड़ें । इस चरण में चैनल को समाधान के साथ भरना होगा ।
    4. microfluidic डिवाइस रखो और शोषक कागज के दो टुकड़े एक बड़े प्लास्टिक पकवान में पानी के साथ गीला । ३७ डिग्री सेल्सियस पर पकवान और 5% सह के लिए2 से कम 24 एच मशीन ।
    5. एक खुर्दबीन कैमरा के साथ एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ microchannel के ग्रीन प्रतिदीप्ति छवियों रिकॉर्ड.
    6. एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फ्लोरोसेंट छवियों को खोलने और पुष्टि वहां गैप भराव और पिन के इंटरफेस पर कोई रिसाव (ग्रीन प्रतिदीप्ति) है ।
  2. microchannel करने के लिए बीज कोशिकाओं ।
    1. एक सेल संस्कृति पोत ७०-८०% धाराप्रवाह कोशिकाओं (सेल प्रकार के आधार पर) युक्त तैयार करें । वृद्धि मध्यम में कोशिकाओं को अलग और निलंबित ।
    2. कोशिकाओं के केंद्रापसारक (गति और समय सेल प्रकार पर निर्भर करता है), और मध्यम महाप्राण ।
    3. मध्यम की एक छोटी राशि के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड । एक सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना और १.५ × 106 से १.५ × 107 कोशिकाओं/एमएल से सेल घनत्व समायोजित करें ।
    4. एक सीधे ४००-µm चौड़ा चैनल बनाने के लिए एक ठीक उपकरण या एक डेस्कटॉप रोबोट (चित्रा 1बी) का उपयोग कर microchannel खोलें । संभव के रूप में चैनल भर में फ्लैट के रूप में sidewall बनाने के लिए पिन पदों को समायोजित करें । microchannel के अंत बंदरगाह में से एक के लिए सेल निलंबन जोड़ें और चैनल भरें ।
    5. एक पिन है कि क्षेत्र के sidewall संस्कृति शुरू करने के लिए परिभाषित करता है की स्थिति जानें । एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत, सेल संस्कृति क्षेत्र में कोशिकाओं को बंद करना करने के लिए दो आसंन पिंस करीब ।
    6. अंदर से बाहरी करने के लिए सभी कोशिकाओं को निष्कासित करने के क्रम में से सभी पिन बंद चैनल । धीरे अंत बंदरगाहों से महाप्राण निलंबन, और उन से मध्यम जोड़ें ।
    7. 4.1.4 में वर्णित के रूप में उपकरण मशीन । जब कोशिकाओं के बारे में ७०-८०% धाराप्रवाह हैं, धीरे संस्कृति क्षेत्र को चौड़ा करने के लिए एक पिन खुला ।

Representative Results

पुनर्विन्यास microchannel का निर्माण चित्रा 1में दिखाया गया है । एकाधिक आयताकार पिन एक गिलास सब्सट्रेट पर रखा गया था और इतनी लाइन में खड़ा किया गया था कि पिन के लंबे पक्ष के संपर्क में थे. छिद्रित छेद और पिन ऊंचाई के रूप में एक ही गहराई के एक अवकाश के साथ एक PDMS शीट पिन के सिरों को कवर चैनल प्रवेश/आउटलेट जलाशयों, चैनल की छत, और चैनल दीवार है कि पिन के शामिल विपरीत एक और sidewall के रूप में । पिन से घिरा क्षेत्र, एक दीवार (PDMS शीट के चेहरों में से एक), और गिलास सब्सट्रेट एक microfluidic चैनल के रूप में ।

जैसा कि पहले वर्णित है, प्रस्तावित microfluidic प्रणाली की पुनर्विन्यास कई छोटे बहुत छोटे लेकिन गैर शूंय अंतराल के साथ समानांतर में रखा पिंस द्वारा हासिल की है । पिछले रिपोर्टों में समस्या मजबूत केशिका प्रभाव द्वारा अंतराल के माध्यम से उत्पंन प्रवाह था । इस समस्या को दूर करने के लिए अंतराल पहले गैप भराव से भरे गए थे । इस प्रोटोकॉल में, चिपचिपा हाइड्रोकार्बन और फ्लोरो पाउडर का एक फैलाव मिश्रण एक अंतर भराव के रूप में इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, गैप भराव खुद भी केशिका प्रभाव के अधीन है । इसलिए, जैसा कि आरेख 1में दिखाया गया है, परिणामस्वरूप पुनर्विन्यास योग्य microchannel में हाइड्रोकार्बन/फ्लोरो गैप भराव और अंतर-भराव की बाहरी परिधि के चारों ओर एक elastomeric बाधा बनाई गई है । पिन के बीच thinning की मोटाई और दो पिन के बीच elastomeric बाधा की ताकत सुनिश्चित करने के लिए गैप भराव की एक पर्याप्त राशि को समायोजित करने की जरूरत है.

चित्र 2 a एक sidewall खंड को प्रपत्र वाले किसी pin का आरेखण दिखाता है । स्टेनलेस स्टील ग्रेड 316l अपनी जंग प्रतिरोधी और कम नमकीन पानी के गुणों के कारण सामग्री के रूप में चुना गया था । हालांकि, एक अतिरिक्त passivation प्रक्रिया पिन सेल संस्कृति संगत बनाने के लिए आवश्यक था । एक पिन एक sidewall खंड को सफलतापूर्वक बनाने के लिए burrs के बिना एक सटीक आयताकार टिप होना चाहिए । इसके अलावा, एक पिन एक "संभाल" इतना है कि पिन आसानी से संभाल धक्का द्वारा ले जाया जा सकता है होना चाहिए । क्योंकि प्रत्येक पिन एक संकीर्ण मध्य है, पिन के बीच elastomer की मोटाई के लिए पिन आंदोलन की वजह से कतरनी झेलने के लिए पर्याप्त था. अंय डिवाइस शामिल भागों के विपरीत, पिन के निर्माण, मध्य thinning को छोड़कर, एक बिजली के निर्वहन मशीनिंग (ईडीएम) में विशेषज्ञता कंपनी से आदेश दिया जाना चाहिए क्योंकि यह सबसे सटीक और लागत मशीनिंग के प्रभावी तरीकों में से एक है छोटे कठिन धातुओं के बने पार्ट्स । अपने आप को नक़्क़ाशी से thinning मध्य प्रदर्शन मशीनिंग की लागत और झुकने या मशीनिंग के दौरान तोड़ने के जोखिम को कम कर देता है ।

कि गैप भराव, elastomeric बाधा, और अंततः पुनर्विन्यास microchannel समारोह की निर्विवाद ठीक से पुष्टि करने के लिए, प्रतिदीप्ति द्वारा रिसाव का पता लगाने का इस्तेमाल किया गया था. चित्रा 3 elastomeric बैरियर के किनारे के पास के क्षेत्र के एक प्रतिदीप्ति छवि से पता चलता है 3 दिनों के बाद microchannel फ्लोरोसेंट अनुरेखक डाई युक्त पानी से भर गया था । प्रतिदीप्ति इमेज से पता चलता है कि लिक्विड भरने वाला चैनल elastomeric बैरियर के दिख रहे किनारे से लगभग २०० µm की गहराई तक पहुंच गया । हालांकि, लिक्विड गैप भराव तक नहीं पहुंचा । इसके अतिरिक्त, elastomeric बैरियर के माध्यम से गैप भराव का कोई रिसाव नहीं मनाया गया । इस अवलोकन इंगित करता है कि पिन और elastomeric बाधा के संकीर्ण बीच तंग फिट अंतराल के माध्यम से तरल के प्रवास को रोका ।

अंत में, हमने संस्कृति क्षेत्र के साथ दीर्घकालिक कोशिका संस्कृति का प्रदर्शन किया जो कि चित्रा 4एमें दिखाई गई पुनर्विन्यास microfluidic डिवाइस के sidewall का विस्तार कर रहा है । 0 d पर, कक्षों की एक छोटी संख्या एक पिन-चौड़ाई के बराबर एक रिक्ति के भीतर सीमित हो गई थी और अंय कक्ष aspirated थे । २ डी पर, कोशिकाएँ निचली सतह से जुड़ी हुई थीं और proliferating शुरू हो गई थीं. दो पिन इतनी मुकर गया कि सभी कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, हालांकि अभी भी प्रभावित कम था । 5 डी पर, कोशिकाओं पैदा करना करने के लिए जारी रखा और प्रवाह में वृद्धि हुई । 6 और 9 डी में, दो अंय पिंस कोशिकाओं underconfluent रखने के लिए मुकर गए । संस्कृति क्षेत्र के क्रमिक विस्तार का प्रभाव चित्रा 4बीमें दिखाया गया है । वहां दिन पर सेल घनत्व में अचानक परिवर्तन पिन (ओं) से मुकर गए थे । हालांकि, सेल गिनती की वृद्धि दर लगातार रखा गया था, जबकि ठेठ कोशिका संस्कृति में देखा घातीय है ।

Figure 1
चित्र 1 : एक पिन-discretized sidewall के साथ विन्यास microfluidic डिवाइस. (a) भागों और एक पुनर्विन्यास microfluidic डिवाइस का निर्माण । डिवाइस एक सीधे चैनल 10 स्टेनलेस स्टील PDMS/ग्लास microchannel सुविधाओं में डाला पिंस के सिरों द्वारा गठित sidewall के साथ है । गैप भराव और एक elastomeric बाधा पिन अंतराल के माध्यम से लीक से तरल को रोकता है । Coverglasses, गैप भराव, और elastomer बैरियर एक polymethylmethacrylate (पीएमएमए) आधार के लिए तय कर रहे हैं । (B) स्वचालित पिन हेर-फेर । एक अंत धातु के एक पत्रक से बने प्रभाव एक 3-अक्ष डेस्कटॉप रोबोट के लिए तय हो गई है । एक पिन ले जाने के लिए, अंत प्रभाव अपने ऊर्ध्वाधर अंत धक्का । अलग लंबाई के साथ पिन तीन बार पिन चौड़ाई के अंतराल पर रखा जाता है । अंतराल सुनिश्चित करता है कि अंत प्रभाव पर्याप्त निकासी के साथ एक बार में एक पिन साथी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : मशीन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया भागों की यांत्रिक ड्राइंग। इकाइयों मिलीमीटर में कर रहे हैं; R एक त्रिज्या आयाम को इंगित करता है; स्क्वायर प्रतीक (□) वर्ग सुविधाओं को इंगित करता है; t मोटाई इंगित करता है । (क) sidewall के एक भाग के रूप में एक 316l स्टेनलेस स्टील पिन । पिन का आदेश दिया और मशीन के रूप में वर्णित किया जा सकता है । कुत्ते की हड्डी की तरह आकार बनाने के लिए पिन मध्य के thinning इस ड्राइंग में प्रतिबिंबित नहीं है क्योंकि यह मशीनिंग के भाग के रूप में आदेश नहीं किया गया था, लेकिन प्रोटोकॉल के भाग के रूप में किया गया था । (ख) एक polymethylmethacrylate (पीएमएमए) आधार है कि पिन आंदोलन के खिलाफ जगह में coverglasses, गैप भराव और elastomeric बाधा रखती है । (ग) एक नक़्क़ाशी पकवान है कि पिन के बीच खोदना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक नक़्क़ाशी पकवान बनाने के लिए, कांच के चार टुकड़े सिलिकॉन चिपकने का उपयोग कर बंधुआ हैं । सिलिकॉन चिपकने का एक समोच्च पैटर्न पकवान पर पिन के स्थान के बाद पकवान पर तैयार की है के रूप में ड्राइंग में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : पिन अंतराल के माध्यम से एक पुनर्विन्यास microchannel से रिसाव का पता लगाने प्रतिदीप्ति. हरी फ्लोरोसेंट डाई के प्रतिदीप्ति छवि विन्यास microchannel भरने सील संरचना है, जो एक अंतर भराव (अपारदर्शी) और elastomeric बाधा (पारदर्शी) के होते हैं की एक चरण विपरीत छवि पर मढ़ा है. elastomer बैरियर के एक किनारे meniscus जैसी सुविधाओं के रूप में दिखाई देता है और एक ऊपरी बिंदीदार रेखा से चिह्नित है; elastomer बैरियर और गैप भराव के बीच इंटरफेस meniscus की तरह सुविधाओं है कि काले क्षेत्र से संपर्क करें और निचले बिंदीदार रेखा से संकेत दिया है के रूप में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रगतिशील और सतत कोशिका विकास चर सेल संस्कृति क्षेत्र के साथ एक पुनर्विन्यास microchannel में. (a) क्योंकि-एक सेल संस्कृति क्षेत्र में 7 सेल विकास sidewalls चलती द्वारा सीमित । (ख) विकास वक्र और समय विकास के घनत्व के-7 चर में सीमित कोशिकाओं-विन्यास microchannel में दिखाया गया है आकार संस्कृति क्षेत्रों में एक). तीन ऊर्ध्वाधर तीरों क्रमशः 2, 5, और 6 डी में सेल संस्कृति क्षेत्र के विस्तार को निरूपित । सेल गिनती के अलावा, सेल घनत्व एक ही संस्कृति क्षेत्रों के लिए दिखाए जाते हैं, प्रत्येक घातीय वृद्धि वक्र के लिए व्यक्तिगत रूप से सज्जित, और स्थानीय दोहरीकरण समय (टीडी [एच]) फ्रेम में दिखाया अनुमान के लिए इस्तेमाल किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

पिन-discretized microchannel एक पूर्ण विशेषताओं microfluidic चैनल है, और हम यह स्पष्ट रूप से किसी भी मौजूदा microfluidic चैनलों के साथ तुलना में चैनल आकार में उच्च विन्यास है कि विश्वास करते हैं. प्रोटोकॉल हम यहां प्रदान की microfluidic उपकरणों के साथ सेल संस्कृति के लिए सक्षम हो जाएगा धीरे से सेल संस्कृति सतह क्षेत्र के विस्तार के लिए एक लंबी अवधि के लिए प्रवाह के तहत संस्कृतियों रखो । इस उपकरण में भी प्रदान करेगा में चैनल पैटर्न के बिना कोशिकाओं के नमूनों सब्सट्रेट पहले से या किसी अंय विचार पर डिजाइन या निर्माण के समय में प्रोटीन । इसके अलावा, इस विन्यास microfluidic डिवाइस आसानी से बहुत कुछ मौजूदा microfluidic उपकरणों को संभाल कर सकते हैं कि ऐसी मुश्किल से प्रवाह सामग्री की हैंडलिंग को लागू करने में मदद मिलेगी जो मजबूत में चैनल विस्थापन प्रवाह, उत्पन्न करता है. इसका मतलब यह है कि कोशिकाओं और अन्य सूक्ष्मजीवों, गैसों, और अन्य गैर तरल पदार्थ के बीच बातचीत डिवाइस डिजाइन में बड़े संशोधनों के बिना इस डिवाइस का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है.

हम लाप्लास दबाव या बाहरी प्रवाह नियंत्रण विधियों के रूप में चैनल के एक प्रवेश करने के लिए दबाव हीड्रास्टाटिक लागू करने पर विचार किया है । हम एक मरा हुआ अंत में तरल धक्का की सिफारिश नहीं है क्योंकि यह हवा वेंट चैनल की ओर पिन के बीच अंतराल और छत के माध्यम से प्रवाह उत्पंन करेगा/ कई तरल पदार्थ आपरेशनों इस तरह के पिन आपरेशन की आवश्यकता नहीं है । उदाहरण के लिए, मिश्रण एक पिन द्वारा तरल मसला द्वारा पूरा किया जा सकता है (यानी, आगे और पीछे कई बार केवल एक पिन चलती).

डिवाइस के सबसे महत्वपूर्ण भागों पिन कर रहे हैं. लंबाई में परिशुद्धता, समानता, सीधा और सतह की गुणवत्ता पिन के लिए आवश्यक हैं, के रूप में वे एक microchannel फार्म चाहिए, सुचारू रूप से स्थानांतरित करना चाहिए, और आसंन पिन के आंदोलन का मार्गदर्शन करना चाहिए. इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि पिन एक कंपनी है कि चित्रा 2के समान एक ड्राइंग प्रस्तुत करके परिशुद्धता मशीनिंग में माहिर से आदेश दिया जाना चाहिए. वहां कंपनियों है कि अतिरिक्त ज्यामितीय आयामी और स्पष्ट सतह किसी न किसी दिशाओं की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, पिन पुन: प्रयोज्य है अगर वे देखभाल के साथ नियंत्रित कर रहे है और कभी नाइट्रिक एसिड के साथ passivated ।

elastomeric बैरियर एक और महत्वपूर्ण विशेषता है, और इसके गठन डिवाइस की निर्माण प्रक्रियाओं में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । एक ठीक machined आधार दोहराने और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । खरीदे गए अवरोध पर पिन भी एक महत्वपूर्ण कदम है । पिन अच्छी तरह से रखा जाना चाहिए गठबंधन, और अंतर भराव और हवा के बुलबुले के बिना बाधा में एंबेडेड । इन चरणों में पिन के माध्यम से रिसाव को रोकने, जो इस microfluidic डिवाइस के साथ एक आम समस्या है.

इस उपकरण का उपयोग करने में अंय आम मुद्दों पर एक) घर्षण रोका पिन, और ख) सेल मौत, और कम विकास दर हैं । इन के लिए संभावित कारणों में एक) शामिल असमान (पतला या लहरदार) पिन मध्य, धंसा सतह की खराब गुणवत्ता, और पिन टिप ऊंचाई और सिलिकॉन स्लैब के लिए एक मोल्ड पर photoresist परत की ऊंचाई के बीच आयामी मिसफिट के नक़्क़ाशी । नक़्क़ाशी निर्माण, तापमान, और आंदोलन का समायोजन पिन आंदोलन को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं । इसके अलावा, मोम या चिपकने का उपयोग करने के लिए समस्या को हल करने के लिए संकेत प्रदान करेगा बिना परीक्षण फिटिंग । b में संभावित कारक) पिन के अपर्याप्त passivation हैं, elastomeric अवरोधों के लिए चिपकने वाले के चयन में त्रुटियाँ, और चिपकने का अपूर्ण इलाज. कुछ कोशिकाओं fibronectin या अंय प्रोटीन या पॉलिमर कि सेल आसंजन को बढ़ावा देने के साथ microchannel अंदर कोटिंग की आवश्यकता हो सकती है । इसके अलावा, ऐसे trypsinization और केंद्रापसारक के रूप में सेल संस्कृति अभ्यास में अनुकूलन microchannel में मृत कोशिकाओं में कमी होगी ।

प्रस्तुत निर्माण प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक है कि केवल sidewalls में से एक discretized है । चैनल की पुनर्विन्यास और यदि दोनों sidewalls पिन arrays द्वारा निर्मित कर रहे है सुधार होगा । हालांकि यह पिन और अब निर्माण कदम की दोगुनी राशि की आवश्यकता है, यह एक तकनीकी रूप से व्यवहार्य विकल्प है ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस शोध KAKENHI (२०८०००४८, २३७००५४३) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oven Yonezawa MI-100
10% Nitric Acid Wako Chemicals 149-06845
Stainless steel pins Micro Giken N/A 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM
Mold release agent Fluoro Technology FG-5093SH
Polydimethylsiloxane (PDMS) Shin-Etsu Chemicals KE-106
Negative epoxy photoresist Nippon Kayaku SU-8 3050
Coverglasses (Rectangular) Matsunami Glass 26 x 60mm No.4
Acetone Kanto Chemicals 01060-79
Glass slides (Large) Matsunami Glass 76 x 52mm No.1
Silicone adhesive Shin-Etsu Chemicals KE-41
White petrolatum Nikko Rica Sun White P-1
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder Power House Accele Microfluon II
Clear acrylic plate (3 mm-thick) Various N/A
Pneumatic dispenser Musashi Engineering ML-5000XII
Hydrochloric acid Kanto Chemicals 180768-00
Computer numerical control (CNC) mill Pro Spec Tools PSF240-CNC
End mill (4 mm diameter) Mitsubishi Materials MS2MSD0400
End mill (1 mm diameter) Mitsubishi Materials MS2MSD0100
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) Cotronics Duralco 4460
Borisilicate glass vials Various To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass.
Sodium bicarbonate Kanto Chemicals 37116-00
Ultrasonic cleaner AS ONE AS12GTU
Ultrasonic drill Shinoda Tools SOM-121 Used as a ultrasonic homogenizer.
Spin coater Active ACT-220DII
Hotplate AS ONE ND-1
Photoplotted film (12,700 dpi) Unno Giken N/A Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted.
2-methoxy-1-methylethyl acetate Wako Chemicals 130-10505
UV spot light source Hamamatsu L8327 Ultraviolet source
Nitrogen Various N/A
Vacuum desiccator and pump AS ONE MVD-100, GM-20S
Scalpels Various No.11
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) Kai Medical BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)
Glass engraving pen Various N/A
Cleaning solution Tama Chemicals TMSC Dilute 1:100 with deionized water
Sputter coater San-yu Electron SC-708 For plasma bonding.
Dispenser syringe (5 ml) Musashi Engineering PSY-5E
Plunger Musashi Engineering FLP-5E
Blunt needle (21G) Musashi Engineering PN-21G-B
Adapter tube Musashi Engineering AT-5E
Fermenter Japan Kneader PF100
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) Thermo Fisher A33077
Large plastic dish Greiner bio-one 688161
Absorbent paper Asahi Kasei BEMCOT M-1
Inverted microscope Leica DMi8
Microscope camera Qimaging Retiga 2000R
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) GE Health Care SH30021.01
Antibiotic-antimycotic solution Thermo Fisher 15240-062
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher 25200-056
Phosphate buffered saline (PBS) GE Health Care SH30256.01
Fetal bovine serum (FBS) Biowest S1820
Cell counter FPI OC-C-S02
Cell culture vessel VIOLAMO VTC-D100
15 ml conical tube Corning 352095
Shop microscope PEAK 2034-20
Hand sprayer FURUPLA No.3530
Coverglasses (Rectangular) Matsunami Glass 10 x 20mm No.4
CAD/CAM software Autodesk Inventor HSM
Nitrogen gas pressure regulator AS ONE GF1-2506-RN-V Set to 0.1 MPa

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३४ पुनर्विन्यास Microfluidics Discretized sidewall पिंस जवानों सेल संस्कृति
पिन-discretized Sidewalls के साथ पुनर्विन्यास Microfluidic चैनल
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Futai, N., Fujita, K., Ikuta, W.… More

Futai, N., Fujita, K., Ikuta, W. Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls. J. Vis. Exp. (134), e57230, doi:10.3791/57230 (2018).

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