Summary
Un canal microfluídico con estructuras deformables ofrece control de flujo, manejo de partículas, personalización de la dimensión de canal y otros reconfiguraciones mientras está en uso. Se describe un método para la fabricación de un canal de microfluidos con paredes laterales de un conjunto de pines que permite su forma de cambiar.
Abstract
Los componentes microfluídicos necesitan tener varias formas para realizar microfluídicos clave diferentes funciones tales como mezclado, separación, captura de partículas o reacciones. Un canal de microfluidos que deforma incluso después de la fabricación mientras que conserva la forma del canal permite alta reconfigurabilidad espaciotemporal. Este reconfigurabilidad es necesaria en tales funciones clave microfluídico que son difíciles de alcanzar en los sistemas microfluídicos "reconfigurable" o "integrada". Se describe un método para la fabricación de un canal de microfluidos con un flanco deformable que consiste en una matriz lateralmente alineada de los extremos de los pernos rectangulares. Accionando los pernos en sus direcciones longitudinales cambia posiciones finales de las clavijas y por lo tanto, la forma de los flancos del canal discretizada. PIN vacíos pueden causar fugas no deseadas o adherencia a pernos adyacentes causada por fuerzas de menisco. Para cerrar las brechas de pin, hemos introducido solucionador de problemas basada en la suspensión de fluoropolímero de hidrocarburos acompañados de una barrera elastomérica. Este dispositivo de microfluidos reconfigurable puede generar flujo fuerte temporal en el canal desplazamiento o puede detener el flujo en cualquier región del canal. Esta característica facilitará, en la demanda, la manipulación de células, líquidos viscosos, burbujas de gas y no líquido, aun cuando su existencia o su comportamiento es desconocido en el momento de fabricación.
Introduction
Dispositivos microfluídicos - tamaño micro dispositivos que controlan pequeñas cantidades de líquido y sus flujos - ofrecen miniaturización de procedimientos biomédicos en un formato de "chip" con mayor portabilidad y, con frecuencia, accesibilidad. Como se describe en un reciente informe1, se han desarrollado diversos componentes microfluídicos consisten en espacios y características positivas para realizar las funciones básicas y claves fluídicas como mezclado, separación, captura de partículas o reacciones.
Mientras que el comportamiento de muchos dispositivos de microfluidos se determina en la etapa de diseño, algunos tipos de dispositivos microfluídicos permiten cambios posteriores de fabricación de su estructura o comportamiento. Aquí nos referimos a esta característica como "reconfigurabilidad". La reconfigurabilidad de sistemas microfluídicos generalmente reduce el tiempo y costo requerido para diseñar un dispositivo, y permite la personalización de los microfluidos diseño o funciones en el tiempo.
Descrito previamente reconfigurable microfluídicos dispositivos caen en tres categorías. En la primera, deformación de elastómeros canales permite velocidades de flujo y cómo llegar a ser cambiado durante su uso. Para obtener la reconfigurabilidad, canales elastoméricos son deformados por diversas fuerzas externas y controlables como fuentes de presión neumática2, Braille actuadores3o4del lacre de la compresión. En el segundo, dispositivos reconfigurables dependen de diseños modulares, tales como interconexiones múltiples capas circuitos fluídicos, modulares canales magnética y microfluídica basada en tubos de5. En el tercero, el dispositivo sí mismo no es reconfigurable y transporte microdroplet electrodo matrices (a menudo denominados microfluídica digital)6,7 y microfluídica basada en gota colgante dispositivos8 permitir bajo demanda conmutación de la ruta del fluido o el flujo.
Sin embargo, muchas de estas reconfiguraciones se limitan a nivel macroscópico y topológicas. Por ejemplo, muchos dispositivos microfluídicos integrado detener el flujo o cambian la dirección del flujo por colapso de microcanales en regiones predefinidas. Sin embargo, la posición y el número de regiones a ser derrumbada no son reconfigurables. Aunque la microfluídica digital tiene una variedad de habilidades de manipulación de fluidos, flujos posibles deben ser limitados en gran parte por el volumen de cada gota. Además, cuando las células se cultivan en esas gotitas de medio de cultivo celular, se necesita un esfuerzo adicional para evitar evaporación y disipación del gas de gotitas y osmolalidad golpes y cambios bruscos de pH.
Para realizar la reconfigurabilidad de nivel de función del canal, hemos propuesto un dispositivo microfluídico con paredes móviles que consisten en conjuntos de elementos de la máquina para reconfigurar dinámicamente cuando en uso9. Para formar un flanco deformable, pines rectangulares pequeño estaban alineados para que cada extremo de las clavijas define un segmento de la pared lateral. Deslizando las clavijas permite la deformación de la pared lateral que permite transporte o patrones de las células, las burbujas y las partículas dentro del canal. Para minimizar el volumen muerto y maximizar la reconfigurabilidad, la distancia entre los pernos adyacentes debía reducirse al mínimo. Sin embargo, fuerte capilaridad actúa sobre las pequeñas brechas entre pernos de conexión dentro y fuera de la MCP provoca fuga de cualquier líquido en el boquete de perno, causando la evaporación de los medios de comunicación, contaminación bacteriana o citotóxica y eventualmente células muerte. Por lo tanto, hemos desarrollado canales de microfluidos reconfigurable de fugas discretizada-tipo del flanco que soportar acciones pin cíclicos y a largo plazo de la célula cultura10.
En este artículo, proporciona un protocolo para construir microfluídicos dispositivo de cultura de célula con un flanco discretizada que puede reconfigurarse tras el aumento gradual en el área de cultura de célula. Impermeabilidad de las paredes laterales del canal discreto se prueba usando proyección de imagen de fluorescencia. La compatibilidad de cultivo celular y la capacidad de modelar la célula se evalúan utilizando cultivo de células de la en-viruta.
Este sistema de microfluidos es adecuado siempre que diseño de canal no puede ser predeterminado y debe cambiarse en la demanda. Por ejemplo, este sistema podría ser utilizado para ajustar la velocidad de flujo y anchura de canal basada en el crecimiento de la célula o la migración, flujo o trampa de nematodos activos o otros objetos que se comportan inesperadamente en el canal, o a aceptar varias muestras crudas o bioproductos que no fueron concebidas sin embargo en el momento del diseño.
Protocol
1. grabado de pernos (figura 2A)
- Desengrasar pins rectangulares por inmersión en acetona.
- Apaciguar las clavijas sumergiendo en 4 mL de ácido nítrico al 10%, entonces la solución a 65 ° C por 30 min en un horno de calor.
- Someter a ultrasonidos los pasadores en agua desionizada durante 5 min eliminar el ácido residual y seque con una toalla de papel. Sumerja las clavijas en 0,5 mL de agente desmoldante para h.Sonicate 2 pins en agua desionizada durante 5 minutos.
- Fabricar un plato grabado (figura 2C).
- Dibujar o inscribir dos líneas paralelas con una separación de 4 mm en un portaobjetos de vidrio utilizando una regla.
- Aplique un adhesivo resistente a productos químicos y de baja viscosidad a una superficie de dos rectangular corte coverglasses.
- Enlazar las dos coverglasses corte sobre el portaobjetos de cristal en un espacio de 4 mm. Guíese por la línea paralela.
- Dispensar dos líneas de adhesivo de silicona sobre el plato de la aguafuerte (ver figura 2C para la posición y el tamaño del contorno).
Nota: Una plantilla impresa en 3D (un archivo de modelo STL está incluido como material suplementario) le ayudará a trazar líneas con precisión y fácilmente. - Coloque los pernos en el plato grabado para que las 2 puntas mm de largo en sus extremos rectos están inmersos en el patrón de línea adhesiva. Dispense el adhesivo para asegurar que los pernos están completamente cubiertos y dibujar un contorno. Transferir el plato grabado a un fermentador humidificado calentado a 38 ° C. Esperar la noche para curar el adhesivo.
- Añadir 0,2 mL de ácido nítrico de 0,5 M a 0,2 mL de 5.0 M de ácido clorhídrico lentamente en un frasco de vidrio.
PRECAUCIÓN: La mezcla, también conocido como agua regia, es muy corrosivo y potencialmente explosivos. Use guantes de goma a prueba de ácidos y gafas de seguridad y ejercer extrema precaución al manipular ácidos. Nunca guarde la solución. Reducir el ácido nítrico como sea posible para disminuir su agresividad. - Poner el plato de grabado sobre una placa calentada a 65 ° C. Vierta 0,4 mL de la mezcla ácida sobre la región descubierta de los pernos. Espere 10 min y transferir el ácido en un vaso.
- Neutralizar todo el ácido restante incluyendo la región grabada de los pernos con 5 mL de solución de 0,8 M de bicarbonato de sodio en agua desionizada.
- Retire los pernos del plato grabado los pernos longitudinalmente con las pinzas. Someter a ultrasonidos los pasadores en agua desionizada durante 5 min seguido de sonicación en acetona por 5 minutos.
- Apaciguar la región grabado al agua fuerte las clavijas como en el paso 1.2.
- Compruebe el ancho de las clavijas de grabado al agua fuerte con un microscopio de la tienda con una retícula. Ajustar el tiempo de grabado descrito en 1.7 por lo que el ancho de la región al ácido es 0,2 ± 0,02 mm.
- Transferencia de los pernos a un frasco de vidrio que contiene 5 ml de etanol al 70%. Poner el frasco a una campana laminar. Levante los pasadores de la cubeta y déjelos secar.
2. fabricación de losa de silicona con embalses y un espacio para pernos.
- Fabricar un molde para un espacio para pernos y un flanco fijo por típicos procesos litográficos.
- Capa un portaobjetos de vidrio desengrasado con 1 mL de photoresist negativo epoxi usando a un recubridor spin a 1.000 rpm. Seque la fotoresistencia en una placa de 95 ° C durante 15 minutos repetir este paso una vez.
- La tercera capa de la misma photoresist a 2.000 rpm en el portaobjetos de cristal con fotoresistencia revestido de capa de la vuelta. Seque la fotoresistencia en una placa de 95 ° C durante 30 minutos.
- Exponga la capa de photoresist a 450 mJ/cm2 de luz ultravioleta de 365 nm de una fuente de luz spot UV a través de una película de photoplotted. Hornear el photoresist expuesto en una placa de 95 ° C durante 15 minutos desarrollar la fotoresistencia rociando un solvente (acetato de 2-metoxi-1-metil) utilizando un pulverizador de mano y secar con secador con gas nitrógeno.
- Coloque el portaobjetos de vidrio con fotoresistencia estampado en la parte inferior de un plato de plástico.
- Vierta el prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) sobre el molde en un espesor de 3 mm. Debubble el prepolímero PDMS en un desecador de vacío en kPa-800 durante 10 minutos.
- Curar el prepolímero PDMS en un horno a 65 ° C durante 1 h. Demold la losa parcialmente curada de PDMS con un bisturí. Curar completamente el PDMS en una estufa a 120° C durante 1 hora.
- A lo largo del patrón de pauta, recortar bordes irregulares lejos de la losa PDMS con el mismo bisturí. Hacer lo más preciso y limpiar un corte como sea posible, particularmente en la superficie que define la ranura(ver figura 1)para los pasadores.
- Perfora 2 agujeros de mm de diámetro para la entrada y salida en los extremos del canal principal de la losa PDMS con Punzones de biopsia. Del mismo modo, perforar agujeros de diámetro mm 1 en los extremos del canal de ventilación de aire. Ver figura 1A para el diseño de canales y la posición de estos agujeros.
3. montaje del dispositivo en el lugar de fabricación del solucionador de problemas y la barrera.
- Fabricar una Asamblea de microchannel.
- Sumerja un 10 × 20 mm Nº 4 cubreobjetos en una solución de limpieza calentado a 60 ° C durante 10 minutos.
- Enjuague dos veces el coverglasses con agua desionizada y secar a 120 ° C durante 10 minutos.
- Plasma-bond la losa PDMS un cubreobjetos:
- Colocar la losa PDMS (canal característica lado hacia arriba) y las limpieza 10 × 20 mm Nº 4 cubreobjetos en la cámara de vacío de un recubridor sputter.
- Inicio de bombeo a la cámara a 60 plasma aire vacío PA generar (20 mA) para 30 s.
- Inmediatamente la cámara de ventilación. Enlace al lado de la función de canal de los PDMS de la losa para el cubreobjetos con sus bordes alineados.
- Colocar las capas de servidumbre en un horno de 65 ° C durante 10 minutos.
- Poner las capas de servidumbre a una campana laminar utilizando un recipiente estéril. Esterilizarlas con luz ultravioleta durante 30 minutos.
- En la campana laminar, inserte los pernos en la ranura para que sus extremos formen el otro flanco de la MCP. Pernos adyacentes deben ser diferentes en longitud para evitar el contacto de ambos extremos verticales (ver figura 1B). Gran espacio entre los extremos verticales es preferible. Un espacio de (N-1) × (perno ancho) es posible cuando se prepararon N las clases de pernos con longitudes diferentes pin (L en la figura 2A).
- Fabricar una base ( figura 2B).
- O leer un archivo de parte de la base y dos archivos de control numérico (NC) (que contienen las trayectorias de herramienta, incluido como material suplementario) utilizando software CAD/CAM. El primer archivo suplementario de NC usa un molino de extremo de mm de diámetro y el segundo un 1 mm de diámetro extremo molino 4.
- Abrazadera de un tablero de 3 mm de espesor transparente polimetilmetacrilato (PMMA) en un molino CNC.
- Abra el primer archivo de NC en el controlador de un molino de NC (CNC) de la computadora. Instale una fresa de 4 mm en el molino CNC y localice la parte cero tocando el molino de extremo para el tablero de PMMA. Ejecute el código NC para cortar la tabla.
Nota: Soplar de vez en cuando la punta del molino de extremo con aire comprimido para la eliminación de la refrigeración y chip. - Repita 3.2.3 con el segundo archivo de NC y una fresa de 1 mm.
- Desengrasar las piezas trabajadas a máquina con detergente y seque con una toalla de papel. Rociar las piezas con etanol al 70% y llevarlos a una campana laminar.
- Fabricar una barrera elastomérico y solucionador de problemas de pin:
Nota: Pasos 3.3.1 - 3.3.7 deben realizarse asépticamente en una campana laminar.- Preparar el solucionador de problemas mediante la mezcla de petrolato blanco y polvo de politetrafluoroetileno en una proporción 2:1 en peso. Homogeneizar la mezcla utilizando un homogeneizador de ultrasonidos.
- Vierta el solucionador de problemas en una jeringa dispensador. Inserte un émbolo y empujarlo para llenar la punta de la jeringa. Conecte una aguja y empuje el émbolo otra vez hasta que se llene la punta de la aguja. Asimismo, preparar una jeringa dispensador con un émbolo y una aguja y rellenar con adhesivo de silicona.
- Conecte cada jeringa a un dosificador neumático usando un tubo del adaptador. Ajustar las presiones de descarga para pegamento de silicona y relleno de 280 kPa y 250 kPa.
- Dispense el adhesivo de silicona en el borde de un bolsillo de la base. Coloque un 10 × 20 mm No.4 cubreobjetos en el bolsillo y presione firmemente para enlazar.
- Dispense el adhesivo de silicona a una profundidad de aproximadamente 1 mm a dibujar dos segmentos a lo largo de dos ranuras externas de la base. Dispense el solucionador de problemas a una profundidad de aproximadamente 1 mm, para trazar los segmentos a lo largo de la ranura de la otra.
- Dispense el adhesivo de silicona en el borde del bolsillo de otro. Colocar un montaje de microchannel (3.1) en el bolsillo y presione firmemente para enlazar.
- Repita el 3.3.5 para asegurar que solucionador de problemas y adhesivo de silicona totalmente, incorporar las clavijas y que no hay ninguna apertura en las ranuras.
- Poner el dispositivo en un recipiente estéril como una caja de acero inoxidable con tapa. Trasladar el contenedor a un fermentador humidificado calentado a 38 ° C. En la campana laminar, curar la barrera elastomérica para un día.
- Mueva cada uno perno de hasta 1 mm a lo largo de pernos adyacentes para soltar los pernos de la barrera de elastómero curado.
- Esterilizar el dispositivo con la luz UV durante 30 minutos.
4. evaluación del dispositivo microfluídico
- Detectar fugas usando fluorescencia
- Abrir los microcanales utilizando una herramienta fina o un robot de escritorio. Hacer el ancho de canal como constante a lo largo del canal como sea posible.
- Diluir un colorante fluorescente verde con agua desionizada en 10 μm para hacer solución de fluorescencia.
- Añadir solución de fluorescencia a uno de los puertos de extremo de la MCP con una micropipeta. Este paso llenará el canal con la solución.
- Poner el dispositivo de microfluidos y dos pedazos de papel absorbente mojado con agua desionizada en un plato grande de plástico. Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 24 h.
- Grabación de imágenes de fluorescencia verde de microchannel con un microscopio fluorescente invertido con una cámara de microscopio.
- Abra las imágenes fluorescentes con un software de análisis de imagen adecuada y confirmar que no es ninguna salida (fluorescencia verde) en el interfaz del solucionador de problemas y los pernos.
- Células de la semilla a la MCP.
- Preparar un vaso de cultivo celular que contiene células confluentes de 70-80% (dependiendo del tipo de célula). Soltar y suspender las células en un medio.
- Centrifugar las células (la velocidad y el tiempo dependen de los tipos de células) y aspirar el medio.
- Resuspender las células con una pequeña cantidad de medio. Contar las células con un contador celular y ajustar la densidad de la célula de 1.5 × 106 a 1,5 × 107 células/mL.
- Abrir los microcanales utilizando una herramienta fina o un robot de escritorio (figura 1B) para hacer un canal recto 400 μm de ancho. Ajuste el perno posiciones para hacer el flanco como plano a lo largo del canal como sea posible. Añadir la suspensión celular a uno de los puertos de extremo de la MCP y llenar el canal.
- Localice uno de los pasadores que define la pared lateral de la región para iniciar cultivo. Bajo un microscopio invertido, cerca de los dos pernos adyacentes para incluir las células en la región de la cultura de célula.
- Cerca de todos los pines de la orden de interior a exterior para expulsar a todas las células del canal. Suavemente Aspire suspensión desde los puertos de extremo y añadir medio a ellos.
- Incubar el dispositivo como se describe en 4.1.4. Cuando las células están alrededor del 70-80% confluente, abra lentamente un pin para ampliar el área de cultura.
Representative Results
La construcción de la MCP reconfigurable se muestra en la figura 1. Múltiples pines rectangulares se colocaron en un sustrato de vidrio y estaban alineados para que el lado largo de los pernos estaba en contacto. Una hoja PDMS con perforado agujeros y un receso de la misma profundidad que la altura de perno cubierto los extremos de los pasadores para formar los depósitos de entrada y salida de la canal, canal techo y otro flanco opuesto a la pared del canal que consistió en los pernos. La región rodeada por alfileres, una pared (una de las caras de la hoja PDMS) y el sustrato de vidrio forman un canal microfluídico.
Como se describió anteriormente, se logra la reconfigurabilidad del sistema propuesto microfluídicos muchos pequeños pernos colocados en paralelo con brechas muy pequeñas pero distinto de cero. El problema en los informes anteriores era el fuerte flujo generado a través de los huecos por el efecto capilar. Para superar este problema, los huecos se llenaron primero un solucionador de problemas. En este protocolo, se utilizó una mezcla de dispersión de hidrocarburos viscosos y fluoropolímero polvo como un solucionador de problemas. Sin embargo, el solucionador de problemas sí mismo también está sujeto al efecto capilar. Por lo tanto, como se muestra en la figura 1, el MCP reconfigurable resultante tiene solucionador de problemas de hidrocarburos/fluoropolímero y una barrera elastomérica formado alrededor del perímetro exterior del solucionador de problemas. Adelgazamiento de la mitad de los pines es necesario para dar cabida a una cantidad suficiente de solucionador de problemas para asegurar el espesor y resistencia de la barrera de elastómero entre dos clavijas.
Figura 2 A muestra un dibujo de un alfiler que se forma un segmento de la pared lateral. Acero inoxidable grado 316L fue seleccionado como el material debido a su resistente a la corrosión y bajo propiedades de lixiviación. Sin embargo, un proceso de la estabilización adicional fue necesario para compatibilizar la cultura de célula de pernos. Un perno debe tener una punta precisamente rectangular sin rebabas para formar con éxito un segmento de la pared lateral. Además, un pin debe tener un "mango" para que el pasador se puede mover fácilmente empujando la palanca. Debido a que cada pin tiene un medio estrecho, el espesor del elastómero entre pernos fue suficiente para resistir cortante causado por el movimiento del perno. A diferencia de otras partes que comprende el aparato, debe pedirse la fabricación de pernos, excepto adelgazamiento central, de una empresa especializada en la descarga eléctrica (EDM) de mecanizado ya que es uno de los métodos más precisos y rentables de mecanizado pequeño piezas hechas de metales duros. Realizar reducción media por grabado a sí mismo reduce el coste de mecanizado y el riesgo de doblar o romper durante el mecanizado.
Para confirmar que el solucionador de problemas, la barrera elastomérica y eventualmente la estanqueidad de la MCP reconfigurable funcionan correctamente, se utilizó la detección de fugas por fluorescencia. La figura 3 muestra una imagen de fluorescencia de la zona cerca del borde de la barrera elastomérico 3 días después de la MCP se llenó de agua con colorante trazador fluorescente. La imagen de fluorescencia muestra el líquido llenando el canal alcanzado una profundidad de cerca de 200 μm del borde visible de la barrera elastomérico. Sin embargo, el líquido no llegó a la brecha de relleno. Además, no se observó ninguna salida del solucionador de problemas a través de la barrera elastomérica. Esta observación indica que el ajuste entre el estrecho medio de pernos y de barrera de elastómero impidió la migración de líquido a través de las brechas.
Por último, se realizaron cultivos celulares a largo plazo con el área de cultura adaptado gradualmente ampliando el flanco del dispositivo microfluídico reconfigurable como se muestra en la figura 4A. D 0, un pequeño número de células fueron confinado en un espacio igual a uno ancho de pin y otras células fueron aspiradas. D 2, las células fueron atadas a la superficie inferior y comenzaron a proliferar. Dos pernos fueron retraídos para que todas las células eran claramente visibles, aunque la confluencia era aún bajo. En 5 días, las células continúan proliferando y la confluencia creciente. En 6 y 9 d, otros pasadores se retractaron para mantener la underconfluent de las células. El efecto de la expansión gradual del área cultura se muestra en la figura 4B. Hubo cambios bruscos en la densidad celular en el día que el pasador (es) se retractó. Sin embargo, la tasa de crecimiento de la cuenta de celular se mantuvo constante, mientras que en cultivo celular típico es exponencial.
Figura 1 : Dispositivo de microfluidos reconfigurable con un flanco de discretizar pin. (A) partes y construcción de un dispositivo de microfluidos reconfigurable. El dispositivo tiene un canal recto con una pared formada por los extremos de 10 pernos de acero inoxidable insertados en PDMS/vidrio características de MCP. Solucionador de problemas y una elastómero barrera evita que el líquido se filtre a través de los huecos del perno. Coverglasses, solucionador de problemas y la barrera de elastómero se fijan a una base polimetilmetacrilato (PMMA). (B) automática perno manipulador. Un efector final de una hoja de metal se fija a un robot de 3 ejes de escritorio. Para mover un perno, el efector final empuja su extremo vertical. Pernos con longitudes diferentes se colocan a intervalos de tres veces el ancho del perno. El intervalo asegura de que el efector compañeros un pasador de extremo a la vez con suficiente espacio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Dibujo mecánico de piezas mecanizadas en el protocolo. Las unidades están en milímetros; R indica una dimensión de radio; el símbolo cuadrado (□) indica características de la Plaza; t indica el grosor. (A) un perno de acero inoxidable 316 L como parte de la pared lateral. Pernos pueden ordenados y trabajado a máquina como se describe. Adelgazamiento de la mitad de pin para hacer figuras en forma de hueso perro no se refleja en este plano porque esto no se ordenó como parte de la mecanización se realizó como parte del protocolo. (B) una base de polimetilmetacrilato (PMMA) que sostiene el coverglasses, el solucionador de problemas y la barrera elastomérico en lugar contra el movimiento del perno. (C) plato de grabado que se utiliza para grabar la mitad de los pernos. Para construir un plato grabado, cuatro piezas de vidrio se adhieren con adhesivo de silicona. Se dibuja un contorno patrón de adhesivo de silicona en el plato, seguido por la colocación de los pernos en el plato tal como se muestra en el dibujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Detección de la fluorescencia de la salida de un MCP reconfigurable a través de boquetes de pin. Imagen de fluorescencia del colorante fluorescente verde relleno microchannel reconfigurable es overlaid sobre una imagen de contraste de fase de la estructura del sello, que consiste en un solucionador de problemas (opaco) y barrera elastomérico (translúcido). Un borde de la barrera de elastómero es visible como menisco-como características y se denota por una línea punteada superior; la interfaz entre relleno de barrera y brecha de elastómero se muestra como menisco-como las características que en contacto con la zona negra y se indica por la línea punteada inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Crecimiento celular progresivo y continuo con el área de cultura celular variable en un microcanal reconfigurable. (A) crecimiento de las células COS-7 en un área de la cultura de célula confinado por paredes laterales en movimiento. (B) crecimiento curva y tiempo de evolución de la densidad de células COS-7 confinadas en áreas de tamaño variable de la cultura en la MCP reconfigurable que se muestra en el A). Tres flechas verticales denotan expansión del área de cultura de la célula en 2, 5 y 6 d, respectivamente. Además de recuento de células, densidad celular se muestra para las mismas áreas de la cultura, equipadas individualmente para cada curva de crecimiento exponencial y para estimar el tiempo de duplicación local (td [h]) se muestra en los cuadros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El microchannel discretizar pin es un canal microfluídico completa, y creemos que tiene reconfigurabilidad evidentemente alta en forma de canal en comparación con los existentes canales de microfluidos. El protocolo que nos proporciona aquí permitirá dispositivos de microfluidos capaces de cultivo celular con expandiendo gradualmente la superficie de la célula cultura para mantener los cultivos bajo confluencia para una duración larga. El dispositivo también ofrece en el canal dibujos de células sin patrones de proteínas en el substrato previamente o cualquier otra consideración en el momento del diseño o de fabricación. Además, este dispositivo de microfluidos reconfigurable fácilmente genera flujo fuerte desplazamiento en el canal, lo cual ayudaría a implementar el manejo de tales materiales de difícil-a-flow microfluídicos existentes que muy pocos dispositivos pueden manejar. Esto significa que puede evaluarse la interacción entre las células y otros microorganismos, gases y otros fluidos de no usar este dispositivo sin necesidad de grandes modificaciones en el diseño del dispositivo.
Hemos considerado aplicar presión de Laplace o la presión hidrostática a una entrada del canal como métodos de control de flujo externo. No se recomienda empujar líquido en un callejón sin salida porque va a generar flujo hacia el canal de ventilación de aire a través de las brechas entre pernos y piso y techo del canal. Muchas operaciones de líquido no requieren tales operaciones de pin. Por ejemplo, la mezcla puede lograrse mediante líquido de maceración por un pin (es decir, moviendo sólo uno de los pines y hacia atrás varias veces).
Las partes más importantes del dispositivo son las patillas. Precisión en longitud, paralelismo, perpendicularidad y calidad superficial son necesarios para los pasadores, ya que deben formar un MCP, deben moverse suavemente y deben guiar el movimiento de pernos adyacentes. Por lo tanto, recomendamos que los pines deben pedirse de una empresa especializada en el mecanizado de precisión mediante la presentación de un dibujo similar a la figura 2A. Puede haber empresas que requieren dimensionamiento geométrico adicional y direcciones explícitas rugosidad de la superficie. Sin embargo, los pernos son reutilizables si se manejan con cuidado y en ocasiones pasivadas con ácido nítrico.
La barrera elastomérica es otra característica fundamental, y su formación es el paso más crítico en los procesos de fabricación del dispositivo. Se necesitará una base trabajada a máquina precisión para obtener resultados confiables y repetibles. Colocar los pernos de la barrera es también un paso crucial. Los pernos se deben mantener bien alineada e incrustado en el solucionador de problemas y la barrera sin burbujas de aire. Estos pasos evitar fugas a través de los pines, que es un problema común con este dispositivo de microfluidos.
Otros problemas comunes en el uso de este dispositivo son alfileres a) holguras refrenadas y muerte de las células b) y tasa de crecimiento baja. Las posibles causas de estos en una) incluyen aguafuerte (cónica u ondulada) desigual de la calidad del medio, pobre de pin del grabado al agua fuerte desajuste superficial y dimensional entre la altura de punta de alfiler y la altura de la capa de photoresist en un molde para placas de silicona. Ajuste de la formulación de grabador, temperatura y agitación puede ayudar a mejorar el movimiento del perno. Además, juicio montaje sin usar cera o pegamento proporcionará pistas para resolver el problema. Posibles factores en b) son estabilización insuficiente de los pernos, errores en la selección de adhesivos elastoméricos barreras e incompleta polimerización de los adhesivos. Algunas células pueden requerir capa dentro de la MCP con fibronectina u otras proteínas o polímeros que promueven la adhesión celular. Además, optimización en la práctica de la cultura de célula como tripsinización y centrifugación disminuirá las células muertas en la MCP.
Una de las limitaciones del Protocolo de fabricación actual es que sólo uno de los flancos es discretizar. La reconfigurabilidad del canal mejorará aún más si ambos flancos están formados por matrices de pin. Aunque requiere el doble de la cantidad de pernos y pasos de fabricación más largos, esta es una opción técnicamente viable.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por KAKENHI (20800048, 23700543).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
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- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
- Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).
