Summary
En mikrovæskekanalen med deformerbare dekksider tilbyr flytkontroll, partikkel håndtering, kanal dimensjon tilpasning og andre detalj i bruk. Vi beskriver en metode for å fabrikere en mikrovæskekanalen med sideveggene laget av en rekke pinner som lar sine figuren for å endre.
Abstract
Microfluidic komponenter må ha forskjellige figurer å realisere ulike nøkkelen microfluidic funksjoner som blander, separasjon, partikkel overlapping eller reaksjoner. En mikrovæskekanalen som deformerer selv etter fabrikasjon samtidig beholde kanalutformingen kan høy spatiotemporal reconfigurability. Denne reconfigurability kreves i slike viktige microfluidic funksjoner som er vanskelig å oppnå i eksisterende systemer for "rekonfigurerbare" eller "integrert" microfluidic. Vi beskriver en metode for fabrikasjon av en mikrovæskekanalen med en deformerbare sidevegg bestående av en sidelengs justert matrise av rektangulære pinner. Actuating pinnene i deres langsgående retninger endrer pinnene endestilling og dermed form av discretized kanal sideveggene. PIN-huller kan forårsake uønskede lekkasje eller vedheft til tilstøtende pinnene skyldes menisk styrker. For å lukke pin hullene, har vi innført hydrokarbon-fluoropolymer suspensjon-baserte gapet filler ledsaget av en cellegummi barriere. Rekonfigurerbare microfluidic enheten kan generere sterk timelige i-kanal-forskyvning flyt, eller kan stoppe flyten i en region av kanalen. Denne funksjonen vil lette, på forespørsel, håndtering av celler, viskøse væsker, gassboblene og ikke-væsker, selv om deres eksistens eller atferd er ukjent på tidspunktet for fabrikasjon.
Introduction
Microfluidic enheter - mikro-størrelse enheter som kontrollerer små mengder av væske og deres renn - tilbyr miniatyrisering biomedisinsk prosedyrer til et "chip" med økt bærbarhet og, ofte kostnader. Som beskrevet i siste gjennomgang1, er forskjellige microfluidic komponenter består av mellomrom og positive egenskapene utviklet for å realisere grunnleggende og viktige fluidic funksjoner som blander, separasjon, partikkel overlapping eller reaksjoner.
Mens virkemåten til mange microfluidic enheter bestemmes på design-stadiet, tillate noen typer microfluidic enheter etter fabrikasjon endringer av strukturen eller atferd. Her kaller vi denne funksjonen "reconfigurability". Reconfigurability microfluidic systemer vanligvis reduserer tid og kostnader pålagt å utforme en enhet og/eller gjør tilpasning av microfluidic oppsett eller funksjoner over tid.
Tidligere beskrevet rekonfigurerbare microfluidic enheter falle i følgende tre kategorier. I først kan deformasjon av cellegummi kanaler flyt priser og retninger endres under bruk. For å få reconfigurability, er elastiske kanaler deformert ulike eksterne og kontrollerbar styrker som pneumatisk trykk kilder2, Braille aktuatorer3eller komprimering tetting4. I andre, rekonfigurerbare enheter stole på modulær design, som flerlags fluidic kretser, modulære kanaler med magnetiske sammenkoblinger, og rør-baserte microfluidics5. I tredje, selve enheten er ikke rekonfigurerbare, men microdroplet transport på elektroden matriser (ofte referert til som digital microfluidics)6,7 og hengende slipp-baserte microfluidic enheter8 Aktiver behovsbetinget slå av strømmen eller rute væske.
Likevel, mange av disse detalj er begrenset på topologisk og makroskopisk. For eksempel mange integrerte microfluidic enheter stoppe flyten eller endre flytretningen ved å skjule microchannels i forhåndsdefinerte områder. Posisjon og antallet regioner skjules er imidlertid ikke rekonfigurerbare. En rekke væske håndtering evner har den digitale microfluidics bør mulig renner hovedsakelig begrenses av volumet av hver dråpe. I tillegg når celler er kultivert i slike dråper av celle kultur medier, er ekstra innsats nødvendig for å hindre fordampning og gass spredning fra dråper og unngå osmolality sjokk og plutselig pH endring.
For å realisere kanal funksjonen nivå reconfigurability, foreslo vi en microfluidic enhet med bevegelige dekksider som besto av matriser av maskinen elementer til dynamisk omkonfigurere dem i bruk9. For å danne en deformerbare sidevegg, ble små rektangulære pinner stilt opp slik at hver ende av pinnene definert et segment av sideveggen. Skyve pinnene tillatt deformasjon av sideveggen som tillot transport eller mønster i celler, bobler og partikler i kanalen. For å minimere døde volum og maksimere reconfigurability, hadde avstanden mellom tilstøtende pinnene minimeres. Imidlertid sterk kapillær handling opptrer på lille gapene mellom pinnene koble innsiden og utenfor microchannel fører lekkasje av væske inn pin gapet, forårsaker media fordampning, bakterielle eller cytotoksiske forurensning og til slutt cellen død. Derfor har vi utviklet lekkasje discretized sideveggen-type rekonfigurerbare microfluidic kanaler som tåler syklisk pin handlinger og langsiktig celle kultur10.
I denne artikkelen gir vi en protokoll for å bygge microfluidic celle kultur enhet med en discretized sidevegg som kan konfigureres etter den gradvise økningen i celle kultur området. Airtightness av diskrete kanal sideveggene er testet med fluorescens imaging. Cellekultur kompatibilitet og evne til celle mønstre er vurdert på prosessoren cellekultur.
Microfluidic systemet er egnet når riktig kanal design ikke er angitt, og må endres på forespørsel. For eksempel dette systemet kan brukes å justere kanal bredde og flow rate basert på cellevekst eller overføring til flyt eller felle aktive nematoder eller andre små objekter som oppfører seg uventet i kanalen, eller godta ulike rå prøver eller bioproducts som var ikke ennå unnfanget ved design.
Protocol
1. etsing pins (figur 2A)
- Avfette rektangulære pins av nedsenking i aceton.
- Passivate pinnene ved immersing i 4 mL av 10% salpetersyre, så varme løsningen på 65 ° C i 30 min i en ovn.
- Sonicate pinnene i deionisert vann i 5 min å fjerne gjenværende syre og tørr med et papirhåndkle. Fordype pinnene i 0,5 mL av mold utgivelsen agent for 2 h.Sonicate pinnene i deionisert vann i 5 minutter.
- Dikte en etsning rett (figur 2C).
- Tegne eller dedisere to parallelle linjer med en 4 mm hull på et glass lysbilde ved hjelp av en hersker.
- Bruke et kjemisk bestandige og lav viskositet lim en overflaten av to rektangulære kutte coverglasses.
- Bånd de to cut coverglasses på glass lysbildet på en 4 mm hull. Bruk den parallelle linjen som en guide.
- Dispensere to linjer med silikon lim på etsing parabolen (se figur 2C for plasseringen og størrelsen på konturen).
Merk: En 3D-trykt mal (en modell STL-filen er inkludert som et supplerende materiale) vil hjelpe trekke linjer enkelt og nøyaktig. - Sette pinnene på etsing parabolen slik at 2 mm lange tips om rett endene er nedsenket inn selvklebende linjemønster. Dispensere limet igjen for å sikre at pinnene er helt dekket og tegn en kontur. Overføre etsing retten til en fuktet fermenter oppvarmet til 38 ° C. Vent overnatting å kurere limet.
- Legge til 0,2 mL 0,5 M salpetersyre 0,2 mL 5.0 M saltsyre langsomt i et hetteglass.
FORSIKTIG: Blandingen, også kjent som Kongevann, er svært etsende og potensielt eksplosiv. Wear syrefast gummihansker og vernebriller, og utøve ekstrem forsiktighet ved håndtering av syrer. Aldri lagre løsningen. Redusere salpetersyre som mulig å redusere sin aggressivitet. - Sette etsing rett på en kokeplate oppvarmet til 65 ° C. Hell 0,4 mL av syre blandingen over regionen avdekket av pinnene. Vent 10 min og overføre syre til et beger.
- Nøytralisere alle gjenværende syre inkludert etset regionen av pinnene med 5 mL 0,8 M natriumbikarbonat deionisert vann.
- Fjerne pinner fra etsing rett ved å trekke pinnene langs med pinsett. Sonicate pinnene i deionisert vann i 5 min etterfulgt av sonication i aceton i 5 min.
- Passivate regionen etset av pinnene som i trinn 1.2.
- Sjekk bredden av etset pinnene butikk mikroskop med en reticle. Justere etsing tiden beskrevet i 1.7 slik at regionen etset er 0,2 ± 0.02 mm.
- Overføre pinnene til et hetteglass med 5 ml av 70% etanol. Bringe ampullen laminær hette. Plukk opp pinnene av ampullen og la dem tørke.
2. fabrikasjon av silikon skive med reservoarer og plass til pinner.
- Dikte en mold kan pinner og en fast sidevegg av typiske litografisk prosesser.
- Lag et degreased glass lysbilde med 1 mL av negative epoxy photoresist bruker en spinn coater 1000 RPM. Tørr photoresist på en 95 ° C kokeplate i 15 min. Gjenta dette trinnet når.
- Spinne belegge det tredje laget av den samme photoresist på 2000 rpm i glass lysbildet med belagt photoresist. Tørr photoresist på en 95 ° C kokeplate i 30 min.
- Utsett photoresist laget til 450 mJ/cm2 av 365-nm ultrafiolett lys fra en UV spot lyskilde gjennom en photoplotted film. Bake den synlige photoresist på en 95 ° C kokeplate i 15 min. utvikle photoresist ved sprøyting et løsemiddel (2-metoksy-1-methylethyl acetate) bruker en hånd sprøyta, og Føne med nitrogen gass.
- Sett av objektglass med mønstret photoresist nederst i en plast rett.
- Hell prepolymer av polydimethylsiloxane (PDMS) på mold til en tykkelse på 3 mm. Debubble PDMS-prepolymer i et vakuum desiccator på – 800 kPa i 10 min.
- Herde den PDMS prepolymer i en ovn ved 65 ° C i 1 h. Demold den delvis herdet PDMS ved hjelp av en skalpell. Fullt cure PDMS i en ovn ved 120° C i 1 time.
- Langs retningslinje mønsteret, klippe bort uregelmessig kanter fra PDMS skive med den samme skalpell. Gjør så presis og rense et kutt som mulig, spesielt på overflaten som definerer innsetting sporet (se figur 1en) for pinnene.
- Perforere 2 mm-diameter hull for inn-/ utløp i endene av viktigste kanalen PDMS skive med biopsi slag. Tilsvarende måte 1 mm-dimeter hull i endene av luften lufthull kanalen. Se figur 1A for oppsettet kanal og plasseringen av disse hullene.
3. montering av enheten med stedet fabrikasjon av gapet Filler og barriere.
- Dikte en microchannel-samling.
- Legg en 10 × 20 mm nr 4 coverglass i et rengjøringsmiddel oppvarmet til 60 ° C i 10 min.
- Skyll coverglasses med deionisert vann to ganger og tørr ved 120 ° C i 10 min.
- Plasma-bond PDMS skive til en coverglass:
- Plass PDMS SKIVE (kanal funksjon siden opp) og renset 10 × 20 mm nr 4 coverglass i vakuum Mysteriekammeret en frese coater.
- Begynne å pumpe ned kammeret til 60 Pa. generere luft vakuum plasma (20 mA) for 30 s.
- Umiddelbart lufthull kammeret. Bond kanal funksjon siden av PDMS skive til coverglass med kantene mot justert.
- Plass limt lagene i en 65 ° C ovnen i 10 min.
- Bringe limt lagene laminær hette med en sterile containeren. Sperre med UV lys i 30 min.
- I laminær panseret, Sett pinnene inn i sporet, slik at endene danne andre sideveggen av microchannel. Tilstøtende pinner må være forskjellig lengde å unngå kontakt med begge loddrett ender (se figur 1B). Store avstanden mellom loddrette endene er å foretrekke. Løpet av (N-1) × (pin bredde) er mulig når N typer pins med forskjellige pin lengder (L i figur 2A) er forberedt.
- Dikte base ( figur 2B).
- Gjøre eller lese en del arkiv av base og gjøre to numerisk kontroll (NC) filer (som inneholder toolpaths, inkludert som supplerende materiale) bruker CAD/CAM programvare. Den første supplerende NC filen bruker en 4 mm-diameter slutten mill og den andre en 1 mm-diameter ende mill.
- Klemme en 3 mm tykt klart polymethylmethacrylate (PMMA) bord på en CNC mill.
- Åpne filen for første NC på kontrolleren på en datamaskin NC (CNC) mill. Installere en 4 mm slutten mill CNC mill og Finn delen null ved å berøre slutten møllen PMMA styret. Kjøre NC koden å kutte styret.
Merk: Noen ganger blåse slutten mill spissen med trykkluft for kjøling og chip fjerning. - Gjenta 3.2.3 bruker den andre NC-filen og en 1 mm slutten mill.
- Avfette maskinerte deler med vaskemiddel og tørr med et papirhåndkle. Spray deler med 70% etanol og bringe dem til laminær hette.
- Dikte en pin gapet filler og elastiske barriere:
Merk: Trinn 3.3.1 - 3.3.7 skal utføres tas aseptisk i laminær hette.- Forberede gapet filler ved å blande hvit petrolatum og polytetrafluoroethylene pulver på forholdet 2:1 vekt. Homogenize blandingen ved hjelp av en ultralyd homogenizer.
- Hell gapet filler dispenser sprøyter til. Sette inn en stempelholderen, og skyv den å fylle spissen av sprøyten. Feste en nål og skyv stempelet igjen til pinne-spissen er fylt. Likeledes forberede dispenser sprøyte med en stempelholderen og en nål og fyll med silikon.
- Koble hver sprøyten til en pneumatisk dispenser bruker en kort rør. Justere dispense presset for silikon og filler 250 kPa og 280 kPa.
- Dispensere silikon lim til kanten av en lomme base. Plassere en 10 × 20 mm No.4 coverglass på lommen og trykk det bestemt å obligasjonslån.
- Dispensere silikon lim til en dybde på ca 1 mm å trekke to segmenter langs to ytre spor av base. Dispensere gapet filler til en dybde på ca 1 mm, for å trekke deler langs det andre sporet.
- Dispensere silikon lim til kanten av en annen lomme. Plassere en microchannel forsamling (3.1) på lommen og trykk det bestemt å obligasjonslån.
- Gjenta 3.3.5 for å sikre at både gapet filler og silikon fullt embed pinnene og at det er ingen åpningen på sporene.
- Sette enheten i et sterilt beholder som en rustfritt stål boks med lokk. Overføre beholderen til en fuktet fermenter oppvarmet til 38 ° C. I laminær panseret, kurere cellegummi barrieren for en dag.
- Flytt hver pin inntil 1 mm langs tilstøtende pinner å løslate pinnene fra kurert cellegummi barrieren.
- Sterilisere enheten med UV lys 30 min.
4. evaluering av Microfluidic enheten
- Oppdage lekkasje bruker fluorescens
- Åpne microchannel bruker et fint verktøy eller en desktop robot. Gjøre kanal bredden som konsekvent for kanalen som mulig.
- Fortynne en grønn fluorescerende farge med deionisert vann på 10 µM gjøre fluorescens løsning.
- Legge fluorescens løsning til en av portene slutten på microchannel med en micropipettor. Dette trinnet vil fylle kanalen med løsningen.
- Sette microfluidic enheten og to stykker av tørkepapir våt med deionisert vann i en stor plast skål. Inkuber retten på 37 ° C og 5% CO2 for minst 24 timer.
- Registrere grønne fluorescens bilder av microchannel med en invertert fluorescerende mikroskop med et mikroskop kamera.
- Åpne fluorescerende med en riktig analyseprogramvare og bekreft det er ingen lekkasje (grønn fluorescens) på grensesnittet gapet filler og pinnene.
- Frø cellene på microchannel.
- Forberede en celle kultur fartøy med 70-80% confluent celler (avhengig av celletyper). Løsne og suspendere cellene i vekst medium.
- Sentrifuge cellene (fart og tid avhengig celletyper) og Sug opp mediet.
- Resuspend cellene med en liten mengde medium. Telle celler med en celle teller og justere celle tetthet 1,5 × 106 til 1,5 × 107 celler/mL.
- Åpne microchannel bruker et fint verktøy eller en desktop robot (figur 1B) for å gjøre en rett 400-µm bred kanal. Justere pin posisjoner for å gjøre sideveggen som flat gjennom kanalen som mulig. Legge til celle suspensjon i én på slutten havnen på microchannel og fyll kanalen.
- Finn en av pinnene som definerer sideveggen av regionen starte kultur. Under en invertert mikroskop, lukker du de to tilstøtende pinnene å vedlegge celler i regionen celle kultur.
- Lukk alle pinnene fra i rekkefølge fra indre til ytre å utvise alle cellene fra kanalen. Forsiktig Sug opp suspensjon fra slutten portene, og Legg til middels dem.
- Inkuber enheten som beskrevet i 4.1.4. Når cellene er ca 70-80% confluent, åpne sakte en PIN-kode for å utvide området kultur.
Representative Results
Byggingen av den rekonfigurerbare microchannel er vist i figur 1. Flere rektangulære pinner ble plassert på en barometer substrate og ble stilt opp slik at siden av pinnene var i kontakt. Et PDMS ark med slo hull og en fordypningen i samme dybde som pin høyden dekket endene av pinnene til kanal inn-/ utløp reservoarene, kanal taket og en annen sideveggen motsatt kanal veggen som besto av pinnene. Regionen omgitt av pinner, en vegg (en av ansiktene til PDMS arket) og glass underlaget danner en mikrovæskekanalen.
Som beskrevet tidligere oppnås reconfigurability av foreslåtte microfluidic ved mange små pinner plassert parallelt med svært liten, men null-huller. Problemet i tidligere rapporter var sterk flyten generert gjennom hullene av kapillær effekt. Du løser dette problemet, ble hullene først fylles med fugemasse gapet. I denne protokollen, ble en spre blandingen av flytende hydrokarboner og fluoropolymer pulver brukt som fyllmasse gapet. Men gapet filler seg er også underlagt kapillær effekten. Derfor, som vist i figur 1, den resulterende rekonfigurerbare microchannel har både hydrokarbon/fluoropolymer gap filler og en cellegummi barriere dannet rundt ytre omkretsen av gapet filler. Tynning midten av pinnene er nødvendig for å imøtekomme en tilstrekkelig mengde gapet filler å sikre tykkelsen og styrke av cellegummi barrieren mellom to pinner.
Figur 2 En viser en tegning av en PIN-kode som danner en sidevegg segmentet. Rustfritt stål klasse 316L ble valgt som materiale pga korrosjonsbestandig og lav utvasking egenskaper. En ekstra passivation-prosessen var imidlertid nødvendig slik pins cellekultur. En må ha en nøyaktig rektangulære tips uten grader til vellykket en sidevegg segmentet. I tillegg må en pin ha en "håndtak" slik at pin kan enkelt flyttes ved å trykke på håndtaket. Fordi hver pin har en smal midten, var tykkelsen på elastomer mellom pinnene nok til å tåle skjær forårsaket av pin bevegelse. I motsetning til andre deler består av enheten, bør fabrikasjon av pinnene, unntatt midten tynning, bestilles fra et selskap som spesialiserer seg på elektrisk utladning maskinering (EDM) fordi det er en av de mest nøyaktige og kostnadseffektive metodene for maskinering liten deler laget av hard metaller. Utføre midten fortynning av etsing selv reduserer kostnadene ved maskinering og bøying eller bryte løpet maskinering.
For å bekrefte at gapet filler, elastiske barrieren og til slutt watertightness av rekonfigurerbare microchannel fungere skikkelig, ble lekkasje deteksjon av fluorescens brukt. Figur 3 viser en fluorescens bilde av området nær kanten av cellegummi barrieren 3 dager etter microchannel var fylt med vann som inneholder fluorescerende tracer fargestoff. Fluorescens bildet viser at væsken fylle kanalen nådd en dybde på ca 200 µm fra den synlige kanten av cellegummi barrieren. Men nådde væsken ikke gapet filler. I tillegg ble ingen lekkasje av gapet filler gjennom cellegummi barriere observert. Denne observasjonen angir at match mellom smale midten av pinner og elastiske barriere hindret migrering av væske gjennom hullene.
Til slutt, vi utført langsiktige cellekultur med kultur området av gradvis utvide sideveggen rekonfigurerbare microfluidic enheten som vist i Figur 4A. På 0 d, var et lite antall celler begrenset løpet lik én pin bredde og andre celler var pustende. På 2 d, cellene var festet til bunnen og begynte voksende. To pinner ble trukket tilbake slik at alle celler var tydelig, selv om confluency var fortsatt lav. Cellene fortsatte å spre 5 d, og confluency økt. 6 og 9 d, var to andre pinner trukket for å holde celler underconfluent. Effekten av gradvis utvidelse av området kultur er vist i Figur 4B. Det var plutselige endringer i celle tettheten på dag i pin(s) ble trukket. Men ble veksten av celletall holdt konstant, mens det i typisk cellekultur er eksponentiell.
Figur 1 : Rekonfigurerbare microfluidic enhet med en pin-discretized sidevegg. (A) deler og bygging av en rekonfigurerbare microfluidic enhet. Enheten har en direkte kanal med en sidevegg av endene av 10 rustfritt stål pinnene inn PDMS/glass microchannel funksjoner. Gapet filler og en cellegummi barriere forhindrer væske lekker gjennom pin-huller. Coverglasses gap filler og elastomer barrieren er festet til en polymethylmethacrylate (PMMA) base. (B) automatisert pin manipulator. En slutt effektor av et ark av metall er festet til en 3-akse desktop robot. Hvis du vil flytte en pin, skyver slutten effektor loddrett enden. Pinner med forskjellige lengder, plasseres på et intervall på tre ganger pin bredden. Intervallet sikrer at slutten effektor kameratene en pin samtidig med plass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Mekanisk tegning av maskinerte deler som brukes i protokollen. Enheter er i millimeter; R angir en radius dimensjon; firkantet viser (□) kvadratiske funksjoner; t Angir tykkelsen. (A) en 316 L rustfritt stål pin som en del av sideveggen. Pinner kan bestilles og maskinert som beskrevet. Fortynning av pin midten hunden bein som figurer som ikke gjenspeiles i denne tegningen fordi dette ikke var bestilt som en del av maskinering, men ble utført som del av protokollen. (B) en polymethylmethacrylate (PMMA) base som holder coverglasses, gap filler og elastiske barriere på plass mot pin-bevegelsen. (C) en etsning rett til å etse midten av pinnene. For å bygge en etsning rett, er fire biter av glass bundet med silikon. Et profilmønster av silikon trekkes på parabolen etterfulgt av plassering av pinnene på retten som vises på tegningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Fluorescens påvisning av lekkasje fra en rekonfigurerbare microchannel gjennom pin-huller. Fluorescens bilde av grønne fluorescerende farge fylle rekonfigurerbare microchannel er kledde på en fase kontrast av segl, som består av en gapet filler (ugjennomsiktig) og elastiske barriere (gjennomsiktig). En kant av elastomer barrieren som menisk-liknende funksjoner og er merket med en øvre prikket linje; grensesnittet mellom elastomer barriere og gapet filler vises som menisk-lignende funksjoner som kontakt det svarte området og indikeres med lavere punktert linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Progressive og kontinuerlig cellevekst variabelcelle kultur området i en rekonfigurerbare microchannel. (A) COS-7 cellevekst i en celle kultur området begrenset av flytte sideveggene. (B) vekst kurve og tid utviklingen av tettheten av COS-7 celler i variabelt kultur områder i rekonfigurerbare microchannel vises i A). Tre loddrette piler betegne utvidelse av celle kultur området 2, 5 og 6 d, henholdsvis. I tillegg til celletall vises cellen tettheter for samme kultur områdene, utstyrt individuelt til hver eksponentiell vekstkurve, og brukes til å beregne den lokale dobling tid (td [h]) vises i rammene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Microchannel pin-discretized er et funksjonsrikt mikrovæskekanalen, og vi tror at den har selvfølgelig høy reconfigurability i kanalutformingen sammenlignet med alle eksisterende microfluidic kanaler. Protokollen vi gitt her kan microfluidic enheter i stand til cellekultur med gradvis utvide celle kultur areal for å holde kulturer under confluency for en lang varighet. Enheten vil også gi i-kanal mønstre av celler uten mønstre proteiner på underlaget på forhånd eller andre hensyn på tiden av design eller fabrikasjon. I tillegg genererer rekonfigurerbare microfluidic enheten enkelt sterk i-kanal-forskyvning flyt, noe som ville bidra til å implementere håndtering av slike vanskelige-å-flow materialer som svært få eksisterende microfluidic enheter kan håndtere. Dette betyr at samspillet mellom cellene og andre mikroorganismer, gasser, og andre ikke-væsker kan evalueres ved hjelp av denne enheten uten store endringer i konstruksjon.
Vi har vurdert bruke Laplace press eller hydrostatisk trykk ett inntak av kanalen som eksterne flyt metoder. Vi anbefaler ikke skyve væske på et blindspor fordi det vil generere flyt mot luft vent kanalen gjennom hullene mellom pinner og taket/gulvet av kanalen. Mange væske operasjoner krever ikke slike pin-operasjoner. For eksempel kan blande oppnås ved mose væske med en knappenål (dvs. flytte eneste pin frem og tilbake flere ganger).
De viktigste delene av enheten er pins. Presisjon i lengde, parallellitet, perpendicularity og overflate kvalitet kreves for pinner, som de må danne en microchannel, må flytte jevnt, og må lede bevegelsen av tilstøtende pinner. Vi anbefaler derfor at pinnene skal bestilles fra et selskap som spesialiserer seg på presisjon maskinering ved å sende inn en tegning ligner på figur 2A. Det kan være selskaper som krever ekstra Geometrisk dimensjonering og eksplisitt overflateruhet retninger. Men er pinnene gjenbrukbare hvis de håndteres med forsiktighet og noen ganger paddivert med salpetersyre.
Cellegummi barrieren er en annen viktig funksjon dannelsen er det viktigste trinnet i fabrikasjon prosessene av enheten. En nøyaktig maskinert base vil være nødvendig å få repeterbare og pålitelige resultater. Plassere pinnene på uherdet barrieren er også et avgjørende skritt. Pinnene skal holdes godt justert, og innebygd i gapet filler og barrieren uten luftbobler. Denne fremgangsmåten hindrer lekkasje gjennom pinner, som er et vanlig problem med denne microfluidic enheten.
Andre vanlige problemer i å bruke denne enheten er en) frictionally behersket pinner og b) celledød, og lav vekst. Mulige årsaker til dette i en) inkluderer ujevn (konisk eller bølget) etsing av pin midten, dårlige kvaliteten på etset overflate, og dimensjonale passe mellom pin tips høyden og høyden på det photoresist laget på en mold av silikon slabs. Justering av etsematerialer formulering, temperatur og agitasjon kan forbedre pin bevegelsen. I tillegg vil prøve montering uten voks eller selvklebende gi hint for å løse problemet. Mulig faktorer i b) er utilstrekkelig passivation av pinnene, feil i valget av lim for cellegummi barrierer og ufullstendig herding av lim. Noen celler kan kreve belegg på innsiden microchannel med fibronectin eller andre proteiner eller polymerer som fremmer celleadhesjon. I tillegg reduseres optimalisering i celle kultur praksis som trypsinization og sentrifugering døde celler i microchannel.
En av begrensningene av presentert fabrikasjon-protokollen er at bare én av sideveggene er discretized. Reconfigurability av kanalen vil forbedre hvis begge sideveggene er bygget av pin matriser. Selv om det krever doble av pinner og lengre fabrikasjon skritt, er dette et teknisk levedyktig alternativ.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av KAKENHI (20800048, 23700543).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Araci, I. E., Brisk, P. Recent developments in microfluidic large scale integration. Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).
- Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -C., Meiners, J. -C., Takayama, S. Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays. Appl Phys Lett. 90 (3), 033505 (2007).
- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
- Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).
