Summary
Protokollen beskriver hvordan å en perfusable vaskulære nettverket i en spheroid. Den formet rundt microenvironment er utviklet for å indusere angiogenese og koble formet til microchannels i en microfluidic enhet. Den tillater perfusjon av spheroid, som er en etterlengtet teknikk i tredimensjonale kulturer.
Abstract
En spheroid (en flercellet samlet) regnes som en god modell av levende vev i kroppen. Til tross for betydelige fremme i spheroid kulturer fortsatt en perfusable vaskulære nettverket i spheroids en kritisk utfordring for langsiktig kultur kreves for å opprettholde og utvikle sine funksjoner som protein uttrykk og morphogenesis. Protokollen presenterer en ny metode for å integrere et perfusable vaskulære nettverk i formet i en microfluidic enhet. For å indusere en perfusable vaskulære nettverket i spheroid, ble angiogenic spirer koblet til microchannels guidet av formet ved å benytte angiogenic faktorer fra menneskelige lunge fibroblaster kultivert i formet. Angiogenic spirer nådde spheroid, sammen med endotelceller co kultivert i spheroid, og dannet et kontinuerlig vaskulære nettverk. Vaskulære nettverket kan perfuse interiøret spheroid uten noen lekkasje. Konstruert vaskulære nettverket kan brukes som en rute ytterligere tilførsel av næringsstoffer og fjerning av avfallsprodukter, etterligne blod sirkulasjon i vivo. Metoden gir en ny plattform i spheroid kultur mot bedre recapitulation av levende vev.
Introduction
Skifte fra en monolayer (todimensjonal) kultur til en tredimensjonal kultur er motivert av behovet for å arbeide med kultur modeller som etterligner de cellulære funksjonene levende vev1,2,3. Flat og hard plast underlag brukte i cellekultur ligner ikke de fleste av de ekstracellulære miljøene i menneskekroppen. Faktisk viser mange studier at tredimensjonale kultur gjenopprette vev-spesifikke arkitektur, mekaniske og biokjemiske signaler og celle-celle kommunikasjon, som ikke er observert i konvensjonelle todimensjonal kultur4, 5,6,7,8.
En flercellet samlet eller spheroid, er en av de mest lovende teknikkene for å realisere denne tredimensjonale kultur9,10. Celler skiller den ekstracellulære matrisen (ECM) og kan kommunisere med andre i formet. Selv om noen andre bioteknologi tilnærminger11,12,13,14, som cellen stabling, gjenskape romlige kompleksiteten av menneskekroppen, disse metodene har to eller tre typer celler for enkel analyse og fokusert på bare en funksjon av målet organer. Derimot utsatt celler i spheroids for annen kultur miljøer avhengig av sine posisjoner i spheroid på grunn av heterogene tilførselen av næringsstoffer, oksygen, og paracrine og autocrine signalnettverk molekyler i formet. Denne funksjonen i spheroids etterligner delvis i vivo kultur tilstand og Aktiver cellene i spheroids å skape mye mer kompleks, organisert vevet struktur i vitro enn kultivert i stabling vev9, 15 , 16. Hvis en spheroid består av en enkelt type celler, funksjonen til cellene i spheroid er ikke ensartet på grunn av heterogene miljø i formet. I de siste årene, formet kulturer tillatt embryonale stamceller (ESCs), indusert pluripotent stamceller (iPSCs) eller vev-resident stilk celler å etterligne i vivo utviklingsmessige sekvenser og gjenskape mini-organer som hjernen17, leveren18og nyre19,20.
Til tross for betydelige fremskritt i spheroid kultur teknikker er dyrking store spheroids lenge fortsatt problematisk. I en tredimensjonal vev må celler være plassert innenfor 150-200 µm av en blodåre på grunn av den begrensede tilgangen på oksygen og næringsstoffer21. Vaskulære nettverk innenfor spheroid er nødvendig å recapitulate utveksle stoffer mellom blod og vev i vivo. For å oppnå dette, har andre grupper co kultivert endotelceller med målet cellene22,23,24 eller indusert differensiering av pluripotent celler i CD31-positive celler20. Rapporterte fartøy-lignende strukturer har imidlertid ikke de åpne endene lumina å levere oksygen og næringsstoffer til midten av formet. For å etterligne vaskulær rollen ernære celler i tredimensjonale kultur, må åpent og perfusable vaskulære nettverket utvikles i formet.
De siste årene, noen forskningsgrupper i feltet microengineering rapportert metoder for å konstruere et perfusable vaskulære nettverk, spontant dannet i en microfluidic-enhet ved å benytte angiogenic faktorer fra cocultured fibroblast celler25 ,26. Disse vaskulære nettverk har en lignende morfologi for motpartene i vivo og kan bli ombygd av miljømessige faktorer, gjør dem egnede til å etterligne vaskulær funksjoner i en spheroid kultur. Formålet med denne protokollen er å bygge en perfusable vaskulære nettverket i en spheroid bruker en microfluidic plattform27. Microfluidic enheten er endret fra tidligere rapportert enheten25 slik at en spheroid kan innlemmes. Regi angiogenic utskillelsen fra fibroblast celler i en spheroid til endotelceller i microchannels, angiogenic spirer fra microchannels anastomosed med formet og dannet en perfusable vaskulære nettverk. Denne metoden gir en direkte levering av en rekke stoffer, som fluorescerende molekyler og mikrometer skala perler i indre av en spheroid, som inneholder fundamentet for en langsiktig vev kultur med vaskulære nettverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av Microfluidic enheten Mold
- Design mønster av microfluidic enheten bruker kommersielt tilgjengelig programvare (Clewin5 eller AutoCAD 2016, etc.). Hvis funksjonen av Clewin5, kan du se brukerhåndboken (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
Merk: Filen design er tilgjengelige i supplerende fil 1. - Overføre filen design til en mikro mønster generator og laste verktøyet med en krom maske belagt med den positive photoresist.
- Utsette den positive photoresist i mønsterområdet ved hjelp av en mikro mønster generator.
- Utvikle den positive photoresist bruker utvikleren (Tabell for materiale) og skyll maske med deionisert (DI) vann.
- Bruker krom etsematerialer (Tabell for materiale), etch krom i eksponert område hvor den positive photoresist ble fjernet. Skyll maske med Ionisert vann.
- Fjerne de gjenværende photoresist på masken med aceton.
Merk: Gjennomsiktighetsmaske kan være et alternativ for Cr masken. - Forberede en ren silisium wafer (4 tommers, P(100)) og spinn pels hexamethyldisilazane (HMDS) på 3000 rpm for 30 s.
- Softbake HMDS i 5 min på 120 ° C og kald kjeks i 5 minutter ved romtemperatur.
- Spincoat den negative photoresist (tabell av materialer) på 500 rpm for 10 s og 1200 rpm for 30 s.
Merk: Spinn belegg tilstanden skal gi photoresist lag med en tykkelse på ca 100 µm på wafere etter klima og jordsmonn. - Prebake de negative photoresist for 45 min ved 95 ° C og kul kjeks for 60 min ved romtemperatur.
- Sjekk UV lysintensiteten på hvert eksperiment og beregne eksponeringstid for en total eksponering energi dose på 250 mW/cm2. Plasser photomask (trinn 1.1-1.6) på kjeks og utsette dem for UV-lyset.
- Postbake den negative photoresist for 1 min på 65 ° C og 5 minutter til 95 ° C. At kjeks avkjølt i 1 min i romtemperatur.
- Utvikle negativ photoresist laget i 15 min i den første utvikler (Tabell for materiale) bad og 2 minutter i andre bad. Skyll kjeks i den første isopropanol (IPA) bad for 10 s og andre IPA badekaret for 10 s.
- Hardbake den negative photoresist i 30 minutter ved 200 ° C og kald kjeks i 5 minutter ved romtemperatur.
- Måle tykkelsen på negativ photoresist laget med en overflate profiler.
- Plasser kjeks i en desiccator koblet til en vakuumpumpe og legge til 200 µL av silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Slå på pumpen for 10 min, og slå den av og holde kjeks i desiccator 4 h.
2. fabrikasjon trinn og montering av PDMS lag
- Felles polydimethylsiloxane (PDMS) før polymer (PDMS base: herding agent = 10:1 (w/w)) og degas i et vakuum kammer for 2T.
- Cure PDMS på 80° C i luften-ventilerte ovn over natten.
- Løsner PDMS fra silicon kjeks.
- Punch hull 1A - 3B (figur 1) og formet kultur godt. Bruke 2 mm diameter sparke hull 1A - 3B og 1 mm diameter slag for spheroid godt.
- Rengjør PDMS skive og en glass cover slip (24 mm × 24 mm) med teip, ved gjentatte ganger stikker og peeling av båndet. Behandler PDMS skive med luft plasma for 40 s (40 mW, 50 sccm).
- Bånd PDMS hellen på glass cover slip å utvise eventuelle luftbobler fra overflaten mellom PDMS plate og cover slip og cure på 80 ° C i minst 12 h.
3.-formet forberedelse
Merk: I studien, røde fluorescerende protein uttrykke menneskelige umbilical vene endotelceller (RFP-HUVECs) og grønne fluorescerende protein uttrykke HUVECs (GFP-HUVECs) brukes i formet og microchannels, henholdsvis, å skille opprinnelse HUVECs etter et perfusable vaskulære nettverk. Hvis opprinnelsen til HUVECs ikke er nødvendig, er umerket HUVECs nok for eksperimentet.
- Tine RFP-HUVECs (3.0 × 105 celler/medisinglass) og menneskelige lunge fibroblast (hLF) (1.0 × 106 celler/medisinglass) og legge dem inn i 10 mL av medium for endotelceller og fibroblast celler, henholdsvis (Tabell for materiale). Kultur dem i en 100 mm rett på 37 ° C og 5% CO2 i 2-3 dager for sub confluent RFP-HUVECs og hLFs. Dette preparatet vil gi ~ 200 spheroids.
- Koble den RFP-HUVECs og hLFs fra retter med 2 mL 0,05% trypsin-EDTA og stoppe trypsin reaksjon med 4 mL DMEM med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS) og 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
- Fjerne nedbryting sentrifugering 220 x g for 3 min, og resuspend den RFP-HUVECs og hLFs på endothelial mellomlang til siste celle konsentrasjoner på 2,5 × 104 og 1.0 × 105 celler/mL, henholdsvis.
- Forsiktig legge 200 µL av cellen suspensjon (5000 cellene for RFP-HUVECs) og 20 000 for hLFs per brønn i en 96-brønns plate med ultra-lav bindende overflate.
- Inkuber 96-brønns platen på 37 ° C og 5% CO2 for en periode på 2-4 dager.
Merk: Siden spheroid diameter er avhengig av kultur perioden og første celle nummer i 96-brønnen platen, kan det være kontrollert av disse to parametere.
4. celle såing til Microfluidic-enheten
Merk: Navnekonvensjonen for hullene, kanaler og spheroid godt er demonstrert i figur 1. Vi definerer dag 0 som dagen når cellen høsting i microfluidic enheten er fullført. Skjematisk av eksperimentelle tidslinjene er vist i figur 2.
- Dag −1) Spheroid lasting
Merk: Følgende trinn skal utføres på is for å hindre gelation av kollagen og fibrin.- Løs opp fibrinogen i fosfat bufret saltvann (PBS) for en siste konsentrasjon av 2,80 mg/mL.
- Forberede men kollagen (3.0 mg/mL i PBS) i henhold til produsentens protokollen.
- Kombinere 107,2 µL fibrinogen løsning (2,80 mg/mL), 8.0 µL av men kollagen (3.0 mg/mL) og 3,6 µL av aprotinin (5 U/mL) per reaksjon i et rør. Denne løsningen er merket "master mix løsning" (MS).
Merk: Volumet er nok for lasting en spheroid. Hvis det er flere spheroid, Multipliser hvert volum med antall spheroids. - Oppløse trombin i PBS for en siste konsentrasjon av 50 U/mL.
Merk: Dele 50 U/mL trombin (20 µL/rør) lagres på −30 ° C og er tint før hvert eksperiment. - Plass 96-brønns plate inneholder spheroids inne biosikkerhet kabinett.
- Forberede to 35 mm Petri retter i biosikkerhet skap, med en rett på is (parabolen 1) og andre rett på Borstemmaskin (dish 2). Pipetter 99 µL av MS i sentrum av parabolen 1 (figur 3a) å danne et slippverktøy.
- Trim tips 2 gul (10-100 µL) og 3 Fjern pipette-spisser (1-100 µL) for innsamling av spheroids fra 96-brønns platen, blande trombin med MS, presis samling av spheroids, injisering av spheroids i enheten, og injisere medier i enheten , henholdsvis. Porestørrelse tips skal være litt større enn diameteren på hull 1A - 3B kanaler 1 og 3 eller formet i kanal 2 for en tettsittende passform.
Merk: Heretter, ikke annet bruk pipette tips i dette trinnet. Fotografiet av kuttet tips finnes i Figur 4. - Samle en spheroid med 100 µL av medium fra 96-brønns platen og legge den til dish 2 (figur 3a).
- Plukke opp formet med minimum volum av media fra parabolen 2. Mens du holder på å hindre oppreist, bør spheroid flytte mot bunnen av Pipetter spissen av tyngdekraften. Løse ut formet ved å berøre Pipetter spissen på meniscus av MS slippverktøyet i parabolen 1 (figur 3a).
Merk: Følgende 4.1.10 og 4.1.11 skal utføres raskt. - Legg 1 µL av trombin (50 U/mL) og bland forsiktig med gule Pipetter spissen.
- Med Pipetter satt til 7 µL, plukke opp formet og sakte plassere den i spheroid brønnen (figur 3b).
- Inkuber i 15 min ved 37 ° C i gelation av fibrin.
- Injiser sakte endothelial mediet hull 1A og 3A og fyll kanaler 1 og 3 med media (20 ~ 30 µL/kanal).
- Plass enheten i en 100 mm parabol med en våt Kimwipe å hindre fordampning av media fra enheten (Figur 3 c).
- Plass enheten på 37 ° C og 5% CO2 24 h fjerne bobler på grensesnittet mellom media og fibrin.
- Dag 0) HUVECs innlasting
- Tine GFP-HUVECs (3.0 x 105 celler/medisinglass) og legge dem til 10 mL av endothelial medium. Kultur dem i en 100 mm rett på 37 ° C og 5% CO2 i 2-3 dager til sub-confluency. En rett av sub confluent GFP-HUVECs er nok for å forberede 8-10 enheter.
- Koble GFP-HUVECs fra retter med 2 mL 0,05% trypsin-EDTA og stoppe trypsin reaksjon med 4 mL DMEM med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS) og 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
- Etter sentrifugering 220 x g for 3 min, resuspend GFP-HUVECs i endothelial medium på 5.0 x 106 celler/mL.
- Injisere HUVECs celle suspensjon i kanal 1 gjennom hull 1B (20 µL/kanal).
- Vipper microfluidic enheten 90°, Legg den på siden og ruge på 37 ° C i 30 min å sikre at HUVECs følge fibrin i kanal 2.
- Bekreft feste HUVECs på fibrin. Når antall HUVECs festet på grensesnittet mellom den gel og medium ikke er nok, kan er blodkar kobles vaskulær rot etter noen dager av enheten kultur (figur 5). I protokollen, suksessrate på perfusjonen er > 50%.
- Gjenta trinn 4.2.4 og 4.2.5 kanal 3.
- Kultur cellene i en 100 mm parabol med en fuktig Kimwipe på 37 ° C og 5% CO2 7-14 dager.
- Dag 1 ~) Media utveksling
- Utveksle halvparten av media i kanaler 1 og 3 hver dag.
5. kjerner flekker
- Forberede 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS.
- Fjern utskriftsmaterialet fra kanal 1 og 3 og legge til 20 µL av 4% PFA per kanal. Erstatte løsningen i 4% PFA, gjenta fjerner løsningen fra enheten og legge til 4% PFA tre ganger.
- Inkuber enheten mot 4 ° C over natten.
- Fjerne 4% PFA fra enheten og vask kanalene tre ganger med PBS.
- Legge til 20 µL av 10 µg/mL fluorescerende fargestoff (Tabell for materiale) per kanal stain mobilnettet kjerner. Hvis du vil utveksle løsningen i enheten, gjenta fjerner løsningen fra enheten og legge 10 µg/mL fluorescerende fargestoff tre ganger.
- Lagre enheten på 4 ° C for 24 timer.
6. væske perfusjon av en Spheroid
- Forberede formet etter dyrking i mer enn 7 dager på enheten 37 ° C og 5% CO2 på fullføringen av en sammenhengende vaskulær sti.
- Fjerne mediet fra hull 1A, 1B, 3A og 3B.
- Innføre 10 µL av 10 µM løsning av fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran i PBS hull 1A og 1B.
- Overvåke flyten av microbeads eller FITC fargestoff under en invertert mikroskop.
7. kvantifisering av spire lengde
Merk: ImageJ ver. 1,49 programvare brukes for alle analyse av bildet i denne studien.
- Overlappe bilder av GFP-HUVECs dager 0, 1, 3, 5 og 7.
- Trekk plasseringen av blodkar spissen av dagen 0 fra den samme plasseringen på bilder tatt på dager 1, 3, 5 og 7.
- Bestemme veksten av vaskulær spissen fra roten posisjonen (figur 6). Avstanden mellom vaskulær tips og rot ble definert som spire lengden i denne studien (figur 7b).
8. kvantifisering av vaskulær vinkler
Merk: Vaskulær vinkel ble definert som vinkelen besto av vaskulær vinkel, rot og midten av spheroid (figur 7 c).
- Binarize fluorescerende bilder av coculture-formet som inneholder RFP-HUVECs og måle "centroid" posisjon av analysefunksjonen i ImageJ. I denne studien er målte "centroid" posisjon definert som formet (figur 6).
- Bestemme plasseringen av vaskulær tips og røtter på samme måte i trinn 7.
- Måle vaskulær vinkler analyse funksjonen i ImageJ programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en design og bilde av den microfluidic enheten. Den har tre parallelle kanalene, i hvilken kanal 2 inneholder spheroid godt. Kanaler 1 og 3 brukes for HUVEC kultur og kanal 2 er for formet. Hver kanal er separert trapesformet microposts for mønster PDMS. Microposts forhindre hydrogel i kanal 2 lekker inn i 1 og 3 av overflatespenning og tillate utveksling av stoffer mellom formet og HUVECs i microchannels28.
Figur 7a viser midt i en microfluidic enhet etter celle seeding. Lysende felt og fluorescerende bilder tatt på dag 0 viser at fibrin gel fylt bare kanal 2 uten noen lekkasje i kanaler 1 og 3, og HUVECs er knyttet til sideveggen av fibrin gel. Lyse feltet bildet er i fokus på det både den lastet formet og microposts, som indikerer at spheroid riktig avgjort på bunnen av enheten. Angiogenic spirer er observert på dag 1 og lengden av spirer øker med tiden (figur 7b). Dag 3, lengste spire nådde formet og dag 7, de fleste av angiogenic spirer nådd spheroid (gjennomsnittlig avstand fra kanalene 1 og 3 til spheroid < 500 µm). I beste fall, kan etter 4 dager i enhet kultur, strømme gjennom de vaskulære lumen observeres. Vaskulær vinkelen ble definert som retninger av vaskulær spissen og midten av formet fra vaskulær roten. Figur 7 viser kvantifisert vaskulær vinkelen i 7 dager i enhet kulturen. Vaskulær vinkler ned i en tidsavhengige måte, som indikerer at angiogenic spirer overføres mot formet.
Figur 8 viser delen av det vaskulære nettverket der RFP-HUVECs og GFP-HUVECs har flettet. RFP-HUVECs og GFP-HUVECs dannet coordinately en enkelt vaskulær lumen som vist ved pilen hoder, som tydelig angir angiogenic spirer fra kanaler 1 og 3 anastomosed til RFP-HUVECs i formet og dannet et kontinuerlig vaskulære nettverk. For å bekrefte perfusability av vaskulære nettverket, ble FITC-dekstran sprøytet inn kanal 1. FITC-dekstran i kanal 1 rant inn i konstruert vaskulære nettverk og interiør av formet og endelig nådd kanal 3 (figur 9). Under perfusjon av FITC-dekstran løsning er det ingen lekkasje fra vaskulære nettverket i ekstravaskulær overvåking av plass. Det ble tidligere vist at små molekyler injisert i den vaskulær lumen passere vaskulære veggen og reagerer med cellene i ekstravaskulær overvåking av regionene. I tillegg ble permeabilitet koeffisient vaskulære nettverket vist å være nær den i vivo-27. Disse resultatene antyde at integrert vaskulære nettverket kan gi næring til formet og fjerne avfallet produktet.
Figur 1 : Design og et bilde av den microfluidic enheten. (a) oversikt over utformingen av microfluidic enheten. Grå området viser tre microfluidic kanaler med trapesformet microposts. Kanal 2 har en godt for en spheroid kultur. Høyre figuren viser den forstørrede visningen i den røde firkanten til venstre. (b) fotografi av microfluidic enheten som kanaler er fylt med rødt blekk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksperimentell tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Metode for å laste en spheroid i microfluidic enheten. (a) gjør en dråpe MS og media med en spheroid i to separate retter. Deretter overføre spheroid i MS med trombin. (b) skjematisk inndelingsvisning enheten under injeksjon av formet. Overskytende beløp av gel renner ut gjennom hull 2A og 2B. Men forblir spheroid på bunnen av enheten på grunn av den fysiske confinement. (c) skjematisk av enhetene når de er i en inkubator. Våt Kimwipe ble plassert i en 100 mm parabol og to 35 mm retter med enheten ble satt på Kimwipe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Fotografier av pipette-spisser kuttet for celle såing til enheten. Den venstre hvite tipset er for hull 1A, 1B, 3A og 3C og overføre formet til en dråpe fibrin gel (trinn 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 og 4.2.6). Midten gul spissen er for innsamling av formet fra 96-brønnen (trinn 4.1.7). Den høyre hvite tipset er for spheroid well (trinn 4.1.11). Tips før kutt vises også i fotografiet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Ikke-perfusable blodkar. Angiogenic spirer fra microchannels koble ikke til åpningen mellom microposts og mistet forbindelsen mellom lumen og microchannels (svarte piler). Den forårsakes av utilstrekkelig HUVECs seeded kanaler 1 og 3. Rød: RFP-HUVECs i spheroid, grønn: GFP-HUVECs fra microchannels. Cellene ble kultivert enheten i 14 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Definisjon av vaskulær roten, tips og midten av spheroid. (a) metode for å bestemme plasseringen av vaskulær roten og tips for å måle hvor spire. Etter justert time-lapse fluorescerende bildene, trekkes fluorescerende bildet tatt et par dager etter dyrking i enheten ved bildet på dag 0. Vi målte lengden av spirer etter subtraksjon av ImageJ programvare. (b) definisjon av sentrum av formet. Fluorescerende bilder av RFP-HUVECs er binarized og målt på sin centroid ved ImageJ programvare. Vi definerer centroid som formet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Dannelsen av vaskulære nettverk i microfluidic enheten. (a) time-lapse bilder av et senter for en microfluidic enhet etter celle seeding. Rød: RFP-HUVECs kultivert i spheroid, grønn: GFP-HUVECs høstes i kanaler 1 og 3. Kvantitativ analyse av spire lengden (b) og vaskulær vinkel (c) (n = 42 spirer i 3 enheter, feilfeltene angi standardfeil (S.E.)). Hvor skudd ble definert som avstanden fra plasseringen av HUVECs på 0 å vaskulære spissen (b, topp). Vinkelen (∠TRS) ble definert av vaskulær roten (R), tips (T) og sentrum av spheroid (S) (c, øverst). Se figur 6 for definisjonen av vaskulær rot, tips og midten av formet. Disse dataene ble innhentet med ImageJ programvare. Schematics forklarer definisjonen av spire lengden og vaskulær vinkelen er endret fra Nashimoto, Y. et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Dannelsen av vaskulær lumen av HUVECs fra microchannels og spheroid. (a) fluorescerende bilde av en oversikt over utvalget etter 14 dager i enhet kultur. Gul rektangel angir x-y plasseringen av optisk delen vises i (b). (b) x-y, y-z og x-z optisk delen av konstruert vaskulære nettverket. Hvite pilene indikerer vaskulær lumen. Rød: RFP-HUVECs kultivert i spheroid, grønn: GFP-HUVECs kultivert i microchannels, blå: Cellular kjerner. (a) viser ingen blå fluorescens fordi (a) er bildet før fiksering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Perfusjon av en spheroid bruke et konstruert vaskulære nettverk. Lysende felt (a) og lysrør (b) bilder av formet etter 7 dager i enhet kultur. (c) fluorescerende bilde av den samme formet etter FITC-dekstran (70 kDa) lasting. Rød: RFP-HUVECs i spheroid og kanal 1 og 3, grønn: FITC-dekstran, blue: Cellular kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende fil 1: utformingen av den microfluidic enheten. Filen er i dxf format. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere rapporter viser at hLFs skiller en cocktail av flere angiogenic faktorer, slik som angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte vekstfaktor, omforming vekst faktor-α, tumor nekrose faktor og noen ekstracellulær matrix proteiner29, 30. Denne analysen er avhengig av angiogenic utskillelsen fra hLFs i en coculture-formet, som er begrensning av teknikken. Derfor er det avgjørende for en stabil vaskulær formasjon å sette en coculture-formet nederst på en slik at avstanden mellom coculture-formet og HUVECs kanaler 1 og 3 kan forkortes. Vaskulær lengden fra fibroblaster var omvendt proporsjonal med avstanden mellom endotelceller og fibroblaster31, slik at kortere avstanden er fordelaktig for stabil vaskulær formasjon. For å åpne formet hull (1 mm i diameter) uten skadelige kanaler 1 og 3, var imidlertid minimumsbredden for kanal 2 1,5 mm.
Selv om spheroid bosetter seg på bunnen av brønnen, var vaskulære røtter noen ganger koblet fra microposts eller microchannels (figur 5). I dette tilfellet kunne ikke reagens nå det vaskulære lumen gjennom microchannels (kanaler 1 eller 3). Selv om vi ikke kunne løse problemet helt, antar vi at problemet skyldes utilstrekkelig antall HUVECs på overflaten av fibrin gel (trinn 4.2.1-4.2.6). Kontroller at HUVECs stabilt knytte sideveggen på kanal 2.
Mot vellykket injeksjon av en spheroid i brønnen, optimalisere indre og ytre diameteren brønnene tips i trinn 4.1.7 er viktig: 1) den indre diameteren bør være større enn formet. 2) på ytre dimeter skal passe til kanten av brønnen slik at ingen lekkasje av gel oppstår på toppen av brønnen under injeksjon og spissen kan lett fjernes etter gel injeksjon. I den nåværende protokollen (φ1 mm med en spheroid godt) er rundt 700 µm maksimale diameter for injeksjon-formet. Hvis godt diameter er utformet større enn i denne protokollen, kan større spheroids injiseres fordi spissen kan kuttes for å ha større indre diameter. Spheroid diametere kan kontrolleres enkelt ved å endre celle tallet høstes i 96-brønnen plate.
Denne protokollen først viser romanen microfluidic plattform for å bygge en perfusable vaskulære nettverket i en spheroid. Selv om coculture med HUVECs tillater dannelse av fartøyet-lignende strukturer i en spheroid18,23,24, var dette ikke perfusable på grunn av døde ender i lumina. Fordi fibroblast celler finnes i allsidig vev (bein, adipocyte og kreft, osv.), med tillegg av noen andre målretting celler til coculture-formet, en endometrial blodkar av en ulike slags spheroids kan forventes, som kan etterligne i vivo miljø bedre enn konvensjonelle spheroid kulturen. For å utvide bruken av teknikken, omfatter fremtidige arbeidet endometrial blodkar av spheroids uten tilsetning av fibroblast celler. Noen nyere verk rapporten benmarg stromal celler32 og muskel celler33 kan indusere angiogenese i microfluidic enheter. Utnytte stromal eller muskel celler i stedet for de fibroblast cellene vil øke antall vev som kan være Stangeriaceae microfluidic enheten. Denne protokollen gir en grunnleggende plattform for endometrial blodkar vev, som er en etterlengtet teknikk innen tre dimensjonale kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CREST JST (bevilgning nummer JPMJCR14W4), Society for det fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHI (bevilgning nummer 25600060, 16K 16386), The Center of innovasjon Program fra MEXT og JST, prosjektet fokusert på utvikling nøkkelen evaluering teknologi fra Japan byrå for medisinsk forskning og utvikling, AMED, Mizuho Foundation for fremme av vitenskap. Microfabrication ble støttet av Kyoto University Nano teknologien Hub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
