הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.
ספרואיד (צבירה multicellular) נחשב מודל של חיים רקמות בגוף האדם. למרות קידום משמעותי בתרבויות ספרואיד, רשת כלי הדם perfusable ב spheroids עדיין אתגר קריטי לתרבות לטווח ארוך נדרש לשמור ולפתח את הפונקציות שלהם, כגון חלבון ביטויים מורפוגנזה. הפרוטוקול מציג שיטה להשתלב רשת כלי הדם perfusable בתוך ספרואיד התקן microfluidic. כדי לגרום לרשת כלי הדם perfusable ספרואיד, הונחו נבטים האנגיוגנזה מחובר microchannels כדי ספרואיד ניצול גורמי אנגיוגנזה של אמבריולוגיה fibroblasts תרבותי ב ספרואיד. נבטים האנגיוגנזה הגיעו ספרואיד, התמזגה עם תאי אנדותל ותרבותית משותפת ב- ספרואיד, ויצרו רשת כלי דם רציפה. רשת כלי הדם יכול perfuse את הפנים של ספרואיד ללא דליפה כלשהי. נבנה לרשת כלי הדם ניתן להשתמש עוד יותר עבור אספקה של חומרים מזינים והסרה של חומרי פסולת, מחקה את זרימת הדם בתוך vivoכמו מסלול. השיטה מספקת פלטפורמה חדשה בתרבות ספרואיד לכיוון נעלה יותר של רקמות החי.
המעבר בין תרבות (דו מימדי) חד שכבתי לתרבות תלת מימדי מונע ע י צורך לעבוד עם מודלים תרבות המחקים את הפונקציות הסלולר של חיים רקמות1,2,3. מצעים פלסטיק שטוחה וקשה נפוץ תרבית תאים לא דומים ביותר של סביבות חוץ-תאית בגוף האדם. למעשה, מחקרים רבים להפגין ארכיטקטורה תלת מימדי התרבות הזו של רקמות ספציפיות לשחזר מכני וביוכימי רמזים, תקשורת, אשר לא נצפו תרבות דו מימדי קונבנציונאלי4, 5,–6,–7,–8.
צבירה multicellular ספרואיד, הוא אחד של טכניקות המבטיחים ביותר להבין זה תלת מימדי התרבות9,10. התאים המפרישים את מטריצה חוץ-תאית (ECM), יכולים לקיים אינטראקציה עם אחרים ספרואיד. למרות כמה אחרים בביו-הנדסה מתקרב11,12,13,14, כגון תא בערימה, בהצלחה לשכפל את המורכבות המרחבי של הגוף האנושי, הגישות הללו יש רק שניים או שלושה סוגים של תאים עבור להקל על ניתוח ממוקד רק תפקיד אחד של אברי המטרה. לעומת זאת, תאים spheroids חשופים לסביבות תרבות שונים בהתאם עמדותיהם ספרואיד בשל הטרוגניות אספקת חומרים מזינים, חמצן, ואת paracrine autocrine מולקולות ב ספרואיד איתות. תכונה זו של spheroids מחקה באופן חלקי ויוו תרבות תנאי, ומאפשרים התאים spheroids ליצירת רקמות מורכבים הרבה יותר, מאורגנת מבנה במבחנה מאלה תרבותי הערימה רקמות9, 15 , 16. הערה אם ספרואיד מורכבת מסוג אחד של תאים, תפקוד התאים ספרואיד אינו אחיד עקב בסביבה הטרוגנית ספרואיד. בשנים האחרונות, ספרואיד תרבויות מותר בתאי גזע pluripotent בתאי גזע עובריים (ESCs), המושרה (iPSCs) או בתאי גזע רקמות תושב לחקות ויוו רצפים התפתחותיים ואף ליצור מיני-איברים כגון המוח17, הכבד18ו כליות19,20.
למרות התקדמות משמעותית בשיטות תרבות ספרואיד, culturing spheroids גדול במשך זמן רב הוא עדיין בעייתי. טישו תלת מימדי, תאים צריך להיות ממוקם בתוך 150-200 מיקרומטר של כלי דם בגלל אספקת חמצן וחומרים מזינים21מוגבלת. רשתות כלי דם בתוך ספרואיד נחוצים לסכם החלפת חומרים בין הדם ורקמות בתוך vivo. כדי להשיג זאת, קבוצות אחרות משותף תרבותי תאי אנדותל עם היעד תאים22,23,24 או המושרה את הבידול של תאים pluripotent לתוך תאים CD31-חיוביות20. ובכל זאת, המבנים כלי דמוי דווח על אין סוף פתוח לומינה לאספקת חמצן וחומרים מזינים למרכז ספרואיד. כדי לחקות את תפקיד כלי הדם לטפח תאים בתרבות תלת מימדי, פתוח, perfusable רשת כלי הדם חייב להיות שפותחה ב- ספרואיד.
במהלך השנים האחרונות, כמה קבוצות מחקר בתחום microengineering דיווח שיטות לבנות רשת כלי דם perfusable, באופן ספונטני הנוצרת במכשיר microfluidic על-ידי ניצול גורמי אנגיוגנזה מתאי פיברובלסט cocultured25 ,26. רשתות אלה כלי הדם יש של המורפולוגיה דומה לכלים המקבילים ויוו , יכול להיות שופצה על ידי גורמים סביבתיים, שהופך אותם למתאימים עבור מחקה פונקציות וסקולרית בתרבות ספרואיד. המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד באמצעות פלטפורמה של microfluidic27. המכשיר microfluidic הוא שונה התקן שדווחה בעבר25 כך ספרואיד ניתן לשלב. על ידי הפניית הפרשה אנגיוגנזה של תאי פיברובלסט ספרואיד לתאי אנדותל של microchannels, האנגיוגנזה נבטים של microchannels את anastomosed עם ספרואיד ויצרו רשת כלי הדם perfusable. שיטה זו מאפשרת משלוח ישיר של מגוון רחב של חומרים, כגון פלורסנט מולקולות וחרוזים מיקרומטר-סולם אל פנים ספרואיד, אשר מספקת את המסגרת תרביות רקמה לטווח ארוך עם רשתות כלי דם.
דיווחים קודמים מראים כי hLFs מפרישים קוקטייל של מספר גורמי אנגיוגנזה, angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte פקטורי גדילה, שינוי צורה של גורם גדילה-α, הגידול נקרוזה מקדם, כמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים29, 30. Assay הזה מסתמך על הפרשה האנגיוגנזה מ hLFs ב ספרואיד coculture, אשר הוא המגבלה של הט?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרסט JST (גרנט מספר JPMJCR14W4), החברה עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI (גרנט מספר 25600060, 16K 16386), מרכז של חדשנות תוכנית MEXT, JST, התמקד בפיתוח טכנולוגיה הערכה מפתח מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED, Mizuho קרן לקידום מדעי. מיקרו-מלאכותית נתמכה על ידי אוניברסיטת קיוטו ננו טכנולוגיה Hub.
AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
Aceton | Wako | 012-00343 | |
Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
2-propanol | Wako | 163-04841 | |
Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
Collagen I | Corning | 354236 | |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |