Summary
Protokollen beskriver, hvordan du ingeniør en perfusable vaskulære netværk i en klumpformet. Den sfæroide omkringliggende mikromiljø er udtænkt for at fremkalde angiogenese og forbinde sfæroide til microchannels i en mikrofluid enhed. Metoden tillader perfusion af den sfæroide, der er en længe ventet teknik i tre-dimensionelle kulturer.
Abstract
En klumpformet (en flercellet samlet) betragtes som en god model for levende væv i den menneskelige krop. Trods betydelige avancement i klumpformet kulturer forbliver en perfusable vaskulære netværk i spheroids en kritisk udfordring til langtidskulturer forpligtet til at opretholde og udvikle deres funktioner, såsom protein udtryk og morfogenese. Protokollen præsenterer en ny metode for at integrere en perfusable vaskulære netværk inden for klumpformet i en mikrofluid enhed. For at fremkalde en perfusable vaskulære netværk i sfæroide, blev angiogene spirer tilsluttet microchannels guidet til sfæroide ved at udnytte angiogene faktorer fra menneskelige lunge fibroblaster kulturperler i sfæroide. Angiogene spirer nåede sfæroide, fusioneret med i endothelial celler Co kulturperler i sfæroide, og dannede en kontinuerlig vaskulære netværk. Den vaskulære netværk kunne perfuse indre af sfæroide uden enhver lækage. Den beregnede vaskulære netværk kan anvendes yderligere som en rute til levering af næringsstoffer og fjernelse af affaldsprodukter, efterligne blod omløb in vivo. Metoden giver en ny platform i klumpformet kultur mod bedre sammenfatning af levende væv.
Introduction
Flytte fra en éncellelag (todimensional) kultur til en tre-dimensionel kultur er motiveret af behovet for at arbejde med kultur-modeller, der efterligner de cellulære funktioner af levende væv1,2,3. Fladt og hårdt plast substrater almindeligt anvendt i cellekultur ligner ikke de fleste af de ekstracellulære miljøer i den menneskelige krop. I virkeligheden, viser mange undersøgelser, at tre-dimensionelle kultur genskabe væv-specifikke arkitektur, mekaniske og biokemiske stikord og cell-celle kommunikation, som ikke er blevet observeret i konventionelle to-dimensionelle kultur4, 5,6,7,8.
En flercellet aggregat eller sfæroide, er en af de mest lovende teknikker til at realisere denne tre-dimensionelle kultur9,10. Celler udskiller den ekstracellulære matrix (ECM) og kan kommunikere med andre i sfæroide. Selv om nogle andre bioteknologi tilgange11,12,13,14, såsom celle stabling, med held kopiere rumlige kompleksiteten af det menneskelige legeme, disse tilgange har kun to eller tre former for celler for lethed af analyse og fokuseret på kun én funktion af målorganer. Derimod udsættes celler i spheroids for forskellige kultur miljøer afhængig af deres positioner i klumpformet på grund af de heterogene levering af næringsstoffer, ilt, og paracrine og autocrine signalering molekyler i sfæroide. Denne funktion af spheroids efterligner delvist i vivo kultur tilstand og aktivere celler i spheroids at skabe langt mere komplekse, organiseret væv struktur i vitro end kulturperler i stabling væv9, 15 , 16. Bemærk, at hvis en klumpformet består af en enkelt slags celler, funktionen af cellerne i sfæroide ikke er ensartet på grund af de heterogene miljø i sfæroide. I de sidste par år, klumpformet kulturer tilladt embryonale stamceller (økonomiske), induceret pluripotente stamceller (iPSCs) eller væv-resident stamceller til at efterligne i vivo udviklingsmæssige sekvenser og genskabe mini-organer som hjerne17, leveren18og nyrerne19,20.
Trods betydelige fremskridt i klumpformet kultur teknikker er dyrkning store spheroids i lang tid stadig problematisk. I en tre-dimensionel væv skal celler være placeret inden for 150-200 µm i en blodåre på grund af det begrænsede udbud af ilt og næringsstoffer21. Vaskulære netværk inden for sfæroide er nødvendige for at sammenfatte udveksle stoffer mellem blod og væv in vivo. For at opnå dette, har andre grupper Co kulturperler endotelceller med target celler22,23,24 eller induceret pluripotente celler differentiering i CD31-positive celler20. De rapporterede fartøj-lignende strukturer har dog ikke de åbne ender af lumina at levere ilt og næringsstoffer til midten af sfæroide. For at efterligne den vaskulære rolle for at nære cellerne i de tre-dimensionelle kultur, skal åben og perfusable vaskulære netværk udvikles i sfæroide.
I løbet af de sidste par år, nogle forskningsgrupper i feltet microengineering rapporteret metoder til at konstruere en perfusable vaskulære netværk, spontant dannet i en mikrofluid enhed ved at udnytte angiogene faktorer fra cocultured fibroblastceller25 ,26. Disse vaskulære netværk har en lignende morfologi til deres i vivo modparter og kan være ombygget af miljømæssige faktorer, hvilket gør dem egnede til efterligne vaskulære funktioner i en klumpformet kultur. Formålet med denne protokol er at konstruere en perfusable vaskulære netværk i en sfæroide, ved hjælp af en mikrofluid platform27. Enhedens mikrofluid er ændret fra de tidligere rapporterede enhed25 , så en klumpformet kan indarbejdes. Ved at lede angiogene sekretion fra fibroblastceller i en klumpformet i endothelial celler i microchannels, angiogene spirer fra microchannels anastomosed med sfæroide og dannet en perfusable vaskulære netværk. Denne metode giver mulighed for en direkte levering af en lang række stoffer, som fluorescerende molekyler og mikrometer skala perler ind i indre af en sfæroide, som danner rammen for en langsigtet vævskultur med vaskulære netværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikation af formen mikrofluid enhed
- Design mønster af mikrofluid enheden ved hjælp af kommercielt tilgængelige software (Clewin5 eller AutoCAD 2016, osv.). Funktionen af Clewin5, se brugsanvisning (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
Bemærk: Filen design er tilgængelig i supplerende fil 1. - Overføre filen design til en mikro mønster generator og indlæse værktøjet med en krom maske belagt med den positive photoresist.
- Udsætte den positive photoresist i området mønster ved hjælp af en mikro mønster generator.
- Udvikle de positive photoresist ved hjælp af udvikleren (Table of Materials) og skyl maske med deioniseret vand (DI) vand.
- Ved hjælp af chrom TIPkan (Table of Materials), etch chrom i det eksponerede område hvor de positive photoresist blev fjernet. Skyl maske med Deioniseret vand.
- Fjern de resterende photoresist på masken ved hjælp af acetone.
Bemærk: Gennemsigtighedsmaske kan være et alternativ til Cr masken. - Forberede en ren silicium wafer (4 tommer, P(100)) og spin pels hexamethyldisilazane (HMDS) ved 3000 rpm for 30 s.
- Softbake HMDS for 5 min. ved 120 ° C og cool wafer i 5 min ved stuetemperatur.
- Spincoat de negative photoresist (tabel af materialer) på 500 rpm i 10 s og 1.200 rpm for 30 s.
Bemærk: Spin coating tilstand bør give photoresist lag med en tykkelse på ca 100 µm på vafler efter fotolitografi. - Prebake den negative photoresist for 45 min. ved 95 ° C og cool wafer for 60 min. ved stuetemperatur.
- Kontrollere UV lysintensiteten i hvert eksperiment og beregne eksponeringstid for en samlede eksponering energi dosis på 250 mW/cm2. Placer photomask (trin 1.1-1.6) på wafer og udsætte dem for UV-lys.
- Postbake den negative photoresist i 1 min. ved 65 ° C og 5 min. ved 95 ° C. Tillad wafer at køle ned i 1 minut ved stuetemperatur.
- Udvikle laget negative photoresist for 15 min i den første forfatter (Table of Materials) bad og 2 min i det andet bad. Skyl wafer i den første isopropanol (IPA) bad for 10 s og i den anden IPA bad for 10 s.
- Hardbake den negative photoresist for 30 min. ved 200 ° C og cool wafer i 5 min ved stuetemperatur.
- Måle tykkelsen af laget negativ photoresist ved hjælp af en overflade profiler.
- Placer wafer i en ekssikkator tilsluttet en vakuumpumpe og tilføje 200 µL af silan (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Drej på pumpen i 10 min., derefter slukke den og holde wafer i ekssikkator til 4 h.
2. fabrikation trin og samling af PDMS lag
- Støbt Polydimethylsiloxan (PDMS) før polymer (PDMS base: hærdning agent = 10:1 (w/w)) og degas i et vakuumkammer i 2 timer.
- Kur PDMS ved 80° C i en luft-ventilerede ovnen natten over.
- Skrælle PDMS fra silicon wafer.
- Punch huller 1A - 3B (figur 1) og den sfæroide kultur godt. Bruge en 2-mm diameter punch for huller 1A - 3B, og en 1-mm diameter punch for sfæroide godt.
- Ren PDMS slab og et glas dækning slip (24 mm × 24 mm) med selvklæbende tape, ved at gentagne gange stikke og skrælning off båndet. Derefter behandle PDMS slab med luft plasma for 40 s (40 mW, 50 sccm).
- Bond PDMS slab på glas dækning slip at udvise nogen luftbobler fra overfladen mellem PDMS plade og cover slip og helbredelse ved 80 ° C i mindst 12 timer.
3. klumpformet forberedelse
Bemærk: I undersøgelsen, rødt fluorescerende proteiner udtryk for menneskets umbilical vene endotelceller (RFP-HUVECs) og grøn fluorescerende proteiner udtrykker HUVECs (normal god landbrugspraksis-HUVECs) bruges i klumpformet og microchannels, henholdsvis at skelne oprindelse HUVECs efter opførelsen af et perfusable vaskulære netværk. Hvis oprindelsen af HUVECs ikke er nødvendig, er umærket HUVECs nok for eksperimentet.
- Tø RFP-HUVECs (3,0 × 105 celler/vial) og menneskelige lunge fibroblast (hLF) (1,0 × 106 celler/vial) og tilføje dem til 10 mL af medium i endothelial celler og fibroblastceller, henholdsvis (Tabel af materialer). Kultur dem i en 100-mm parabol på 37 ° C og 5% CO2 for 2-3 dage for sub sammenflydende RFP-HUVECs og hLFs. Denne forberedelse vil give ~ 200 spheroids.
- Frigøre RFP-HUVECs og hLFs fra retter med 2 mL 0,05% trypsin-EDTA og stoppe trypsin reaktion med 4 mL af DMEM som indeholder 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS) og 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
- Efter centrifugering ved 220 x g i 3 min, Fjern supernatanten, og pelleten RFP-HUVECs og hLFs i endothelial mellemlangt til sidste celle koncentrationer på 2,5 × 104 og 1,0 × 105 celler/mL, henholdsvis.
- Forsigtigt tilføje 200 µL af cellesuspension (5.000 celler for RFP-HUVECs) og 20.000 celler til hLFs pr. brønd i en 96-brønd plade med ultralav bindende overflade.
- Inkuber 96-brønd pladen på 37 ° C og 5% CO2 for en periode på 2-4 dage.
Bemærk: Da klumpformet diameter afhænger af kultur periode og første celle nummer i 96-brønd plade, det kan kontrolleres af disse to parametre.
4. celle Seedning mikrofluid enheden
Bemærk: Navngivningskonvention for hullerne, kanaler og sfæroide godt er vist i figur 1. Vi definerer dag 0 som den dag, da cellen høst i mikrofluid enheden er færdig. Skematisk af den eksperimentelle tidslinjer er vist i figur 2.
- Dag 1) klumpformet lastning
Bemærk: Den følgende trin skal udføres på isen for at forhindre gellation af kollagen og fibrin.- Opløse fibrinogen i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til en slutkoncentration på 2,80 mg/mL.
- Forberede neutraliseret kollagen (3,0 mg/mL i PBS) efter producentens protokol.
- Kombiner 107.2 µL af fibrinogen løsning (2,80 mg/mL), 8,0 µL af neutraliseret kollagen (3,0 mg/mL) og 3,6 µL af aprotinin (5 U/mL) per reaktion i et reagensglas. Denne løsning er mærket "master mix løsning" (MS).
Bemærk: Lydstyrken er nok til at indlæse en klumpformet. Hvis der er mere end én sfæroide, multipliceres hver volumen med antallet af spheroids. - Opløse thrombin i PBS til en slutkoncentration på 50 U/mL.
Bemærk: Delprøver af 50 U/mL thrombin (20 µL/tube) gemmes på −30 ° C og er optøet før hvert forsøg. - 96-brønd pladen som indeholder spheroids inde biosikkerhed kabinet anbringes.
- Forbered to 35-mm petriskåle inde biosikkerhed kabinet, med en parabol på is (parabol 1) og de andre parabol på benchtop (parabol 2). Med pipette overfoeres 99 µL af MS i midten af skålen 1 (figur 3a) til at danne et slipværktøj.
- Trim tips 2 gule (10-100 µL) og 3 klare pipette tips (1-100 µL) til indsamling af spheroids fra 96-brønd plade, blande thrombin med MS, præcis samling af spheroids, indsprøjte spheroids i enheden, og indsprøjte medier i enheden , henholdsvis. Porestørrelse i spidsen skal være lidt større end diameteren af hullerne 1A - 3B i kanal 1 og 3 eller klumpformet godt i kanal 2 for en lun fit.
Bemærk: Herefter, medmindre andet er angivet, brug pipette tips skåret i dette trin. Fotografi af cut tips er tilgængelige i figur 4. - Indsamle en klumpformet med 100 µL af medium fra 96-brønd plade og føje det til parabol 2 (figur 3a).
- Afhente klumpformet med minimumsvolumen af medier fra parabol 2. Mens du holder pipette oprejst, bør sfæroide flytte mod bunden af afpipetteres spidsen af tyngdekraften. Skubbe sfæroide ved rørende afpipetteres tip på menisken af MS droplet i fad 1 (figur 3a).
Bemærk: Følgende trin 4.1.10 & 4.1.11 bør udføres hurtigt. - Tilføj 1 µL af thrombin (50 U/mL) og bland forsigtigt med gule afpipetteres spids.
- Med pipette sat til 7 µL, afhente sfæroide og langsomt placere det i klumpformet brønden (figur 3b).
- Inkuber i 15 min. ved 37 ° C i gellation af fibrin.
- Langsomt indsprøjtes i endothelial medium fra huller 1A og 3A og fyld kanal 1 og 3 med medier (20 ~ 30 µL/kanal).
- Placer enheden i en 100-mm skålen med et vådt Kimwipe at forhindre fordampning af medier fra enhed (figur 3 c).
- Placer enheden på 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer til at fjerne boblerne på grænsefladen mellem medier og fibrin.
- Dag 0) HUVECs indlæsning
- Tø normal god landbrugspraksis-HUVECs (3,0 x 105 celler/vial) og tilføje dem til 10 mL i endothelial medium. Kultur dem i en 100-mm parabol på 37 ° C og 5% CO2 for 2-3 dage at nå sub-confluency. En skål af sub sammenflydende normal god landbrugspraksis-HUVECs er nok til at forberede 8-10 enheder.
- Frigøre normal god landbrugspraksis-HUVECs fra retter med 2 mL 0,05% trypsin-EDTA og stoppe trypsin reaktion med 4 mL af DMEM som indeholder 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS) og 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
- Efter centrifugering ved 220 x g i 3 min, resuspend normal god landbrugspraksis-HUVECs i endothelial medium på 5,0 x 106 celler/mL.
- Injicere HUVECs cellesuspension i kanal 1 gennem hullet 1B (20 µL/kanal).
- VIP mikrofluid enheden 90°, placere den på siden og inkuberes ved 37 ° C i 30 min til at sikre, at HUVECs overholder fibrin i kanal 2.
- Bekræfte fastgørelse af HUVECs på fibrin. Når antallet af HUVECs fastgjort på grænsefladen mellem gel og medium ikke er tilstrækkelige, kan Vaskulaturen afbrudt vaskulære roden efter et par dage af enheden kultur (figur 5). I protokollen, er succesraten for perfusion > 50%.
- Gentag trin 4.2.4 og 4.2.5 for kanal 3.
- Kultur celler i en 100-mm parabol med en fugtig Kimwipe på 37 ° C og 5% CO2 til 7-14 dage.
- Dag 1 ~) medier udveksling
- Udveksle halvdelen af medierne i kanal 1 og 3 hver dag.
5. kerner farvning
- Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
- Fjerne medier fra kanal 1 og 3 og tilføje 20 µL af 4% PFA pr. kanal. At erstatte løsning i 4% PFA, gentage at fjerne løsningen fra enheden og tilføjer 4% PFA tre gange.
- Inkuber enheden ved 4 ° C natten over.
- Fjern 4% PFA fra enheden og vask kanaler tre gange med PBS.
- Tilføj 20 µL af 10 µg/mL den fluorescerende farvestof (Table of Materials) pr. kanal at plette cellulære kerner. For at udveksle løsning i enheden, Gentag fjerne løsningen fra enheden og tilføje 10 µg/mL den fluorescerende farvestof tre gange.
- Opbevares ved 4 ° C i 24 timer.
6. flydende Perfusion af en klumpformet
- Forberede sfæroide efter dyrkning for mere end 7 dage i enheden ved 37 ° C og 5% CO2 for færdiggørelsen af en kontinuerlig kar pathway.
- Fjern mediet fra huller 1A, 1B, 3A og 3B.
- Indføre 10 µL af 10 µM løsning af fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran i PBS i huller 1A og 1B.
- Overvåge strømmen af microbeads eller FITC farvestof i en inverteret mikroskop.
7. kvantificering af spire længde
Bemærk: ImageJ ver. 1,49 software bruges til alle analyse af billedet i denne undersøgelse.
- Overlap billederne af normal god landbrugspraksis-HUVECs dag 0, 1, 3, 5 og 7.
- Fratræk holdning af Vaskulaturen spidsen af dag 0 fra den samme holdning på billeder taget på dag 1, 3, 5 og 7.
- Bestemme væksten i vaskulære spidsen fra roden position (figur 6). Afstanden mellem den vaskulære tip og roden blev defineret som spire længde i denne undersøgelse (figur 7b).
8. kvantificering af vaskulære vinkler
Bemærk: Vaskulære vinkel var defineret som vinklen bestod af vaskulære vinkel, rod og midten af klumpformet (figur 7 c).
- Binarize de fluorescerende billeder af coculture klumpformet indeholdende RFP-HUVECs og måle "barycentrum" position af analysefunktion i ImageJ. I denne undersøgelse defineres den målte "barycentrum" position som centrum for klumpformet (figur 6).
- Fastlægge placeringen af vaskulære tips og rødder på samme måde i trin 7.
- Måle de vaskulære vinkler ved hjælp af analysefunktion i ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et design og foto af mikrofluid enheden. Det har tre parallelle kanaler, i hvilken kanal 2 indeholder sfæroide godt. Kanal 1 og 3 anvendes for HUVEC kulturen og kanal 2 er for sfæroide. Hver kanal er adskilt af trapezformet microposts designet til mønster PDMS. Microposts forhindre hydrogel i kanal 2 fra siver ud i kanal 1 og 3 af overfladespænding og give mulighed for udveksling af stoffer mellem klumpformet og HUVECs i microchannels28.
Figur 7a viser i midten af en mikrofluid enhed efter celle såning. Lysfelt og fluorescerende billeder taget på dag 0 vis at fibrin gel fyldt kun 2 kanal uden enhver lækage i kanal 1 og 3, og HUVECs blev tilknyttet dæksiden af fibrin gel. Lysfelt billedet er i fokus på de både den indlæste klumpformet og microposts, der angiver, at sfæroide ordentligt fast på bunden af enheden. Angiogene spirer er observeret på dag 1 og længden af spirer stiger med tiden (figur 7b). På dag 3, den længste spire nåede sfæroide og på dag 7, de fleste af angiogene spirer nåede klumpformet (gennemsnitlige afstand fra kanal 1 og 3 til klumpformet < 500 µm). I bedste fald, kan efter 4 dage i enheden kultur, flow gennem de vaskulære lumen observeres. Den vaskulære vinkel var defineret som retninger af det vaskulære tip og midten af klumpformet fra det vaskulære rod. Figur 7 c viser de kvantificerede vaskulære vinkel under 7 dage i enheden kultur. De vaskulære vinkler faldt i en tidsafhængig måde, der angiver, at angiogene spirer migreret mod sfæroide.
Figur 8 viser del af det vaskulære netværk hvor RFP-HUVECs og normal god landbrugspraksis-HUVECs har fusioneret. RFP-HUVECs og normal god landbrugspraksis-HUVECs dannet coordinately en enkelt vaskulære lumen, som det fremgår af pilespidser, som klart angiver angiogene spirer fra kanal 1 og 3 anastomosed til RFP-HUVECs i sfæroide og dannede en kontinuerlig vaskulære netværk. For at bekræfte perfusability af det vaskulære netværk, blev FITC-dextran sprøjtet ind i kanal 1. FITC-dextran i kanal 1 flød ind i konstrueret vaskulære netværk og indre af sfæroide og endelig nået til kanal 3 (figur 9). Under perfusion af FITC-dextran løsning er der ingen lækage fra det vaskulære netværk i den ekstravaskulære rum. Det var tidligere vist, at små molekyler injiceres i den vaskulære lumen passere gennem den vaskulære væg og reagere med cellerne i regionerne ekstravaskulære. Derudover blev permeabilitetskoefficienten for den vaskulære netværk vist sig at være tæt på at i vivo27. Disse resultater betyder at den integrerede vaskulære netværk kunne levere næringsstoffer til sfæroide og fjerne affald produkt.
Figur 1 : Design og et fotografi af enhedens mikrofluid. a en oversigt over design af mikrofluid enheden. Grå område angiver tre mikrofluid kanaler adskilt af trapezformet microposts. Kanal 2 har et godt for en klumpformet kultur. Højre figur vises den udvidede visning i den røde rektangel i venstre. (b) fotografi af den mikrofluid enhed hvis kanaler er fyldt med rødt blæk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Eksperimenterende tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Metode til at indlæse en klumpformet i enhedens mikrofluid. a at en dråbe af MS og medier med en klumpformet i to separate retter. Derefter, overføre sfæroide til MS med thrombin. b skematisk sektionsvisning enhed under injektion af sfæroide. Overskydende beløb af gel strømmer ud gennem huller 2A og 2B. Men sfæroide forbliver i bunden af enheden på grund af den fysiske indeslutning. c skematisk af enhederne, når de er i en inkubator. Våde Kimwipe blev placeret i en 100-mm parabol og to 35-mm retter med enheden blev sat på Kimwipe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fotografier af pipette tips skåret for celle Seedning til enheden. Den venstre hvide spids er huller 1A, 1B, 3A og 3C og overføre klumpformet at en dråbe af fibrin gel (trin 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 og 4.2.6). Den midterste gul spids er for indsamling af klumpformet fra 96-brønd (trin 4.1.7). Den højre hvid tip er for klumpformet godt (trin 4.1.11). Tips før cut er også vist på fotografiet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Ikke-perfusable Vaskulaturen. Angiogene spirer fra microchannels forbinde ikke til åbning mellem microposts og mistede forbindelsen mellem lumen og microchannels (sorte pile). Det er forårsaget af de utilstrækkelige HUVECs seedet i kanal 1 og 3. Rød: RFP-HUVECs i sfæroide, grøn: normal god landbrugspraksis-HUVECs fra microchannels. Cellerne var kulturperler i enheden for 14 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Definition af vaskulære roden, tip og midten af sfæroide. en a metode til at bestemme placeringen af vaskulære rod og tip til at måle den spire længde. Efter justering for time-lapse fluorescerende billeder, trækkes fluorescerende billedet taget et par dage efter dyrkning i enheden af billedet på dag 0. Vi målte længde af spirer efter subtraktion af ImageJ software. b definition af midten af sfæroide. De fluorescerende billeder af RFP-HUVECs er binarized og målt på dens barycentrum ImageJ software. Vi definerer barycentrum som centrum for sfæroide. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Dannelsen af en vaskulære netværk i enheden mikrofluid. a en time-lapse billeder af et center for en mikrofluid enhed efter celle såning. Rød: RFP-HUVECs kulturperler i sfæroide, grøn: normal god landbrugspraksis-HUVECs høstet i kanal 1 og 3. Kvantitativ analyse af spire længde (b) og vaskulære vinkel (c) (n = 42 spirer i 3 enheder, fejllinjer angive standardfejl (S.E.)). Spire længde blev defineret som afstanden fra placeringen af HUVECs på dag 0 til vaskulær spidsen (b, top). Vinkel (∠TRS) blev defineret af den vaskulære root (R), tip (T) og centrum af klumpformet (S) (c, øverst). Se figur 6 for definitionen af vaskulære rod, tip og midten af sfæroide. Disse data blev indhentet ved hjælp af ImageJ software. Skemaer forklare definitionen af spire længde og den vaskulære vinkel er ændret fra Nashimoto, Y. et al. 27. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Dannelsen af vaskulær lumen af HUVECs fra microchannels og sfæroide. (a) fluorescerende billedet af oversigt over prøven efter 14 dage i enheden kultur. Gul rektangel angiver x-y position i afsnittet optisk vist i (b). (b) x-y, y-z og x-z optisk sektion af den beregnede vaskulære netværk. Hvide pile angiver vaskulære lumen. Rød: RFP-HUVECs kulturperler i sfæroide, grøn: normal god landbrugspraksis-HUVECs kulturperler i microchannels, blå: cellulære kerner. (a) viser ingen blå fluorescens, fordi (a) er billedet før optagelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Perfusion af en sfæroide, ved hjælp af en konstrueret vaskulære netværk. Lysfelt (a) og fluorescerende (b) billeder af sfæroide efter 7 dage i enheden kultur. (c) fluorescerende billedet af den samme klumpformet efter FITC-dextran (70 kDa) indlæsning. Rød: RFP-HUVECs i klumpformet og kanal 1 og 3, grøn: FITC-dextran, blå: cellulære kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: design af enhedens mikrofluid. Filen er i dxf format. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere rapporter viser, at hLFs udskiller en cocktail af flere angiogene faktorer, såsom angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyt vækstfaktor, omdanne vækst faktor-α, tumor nekrose faktor og nogle ekstracellulære matrix proteiner29, 30. Denne analyse er afhængig af angiogene sekretion fra hLFs i en coculture sfæroide, der er begrænsningen i teknikken. Derfor er det afgørende for en stabil vaskulære formation til at fastsætte en coculture klumpformet i bunden af en brønd, så afstanden mellem coculture klumpformet og HUVECs i kanal 1 og 3 kan forkortes. Vaskulære længden fra fibroblaster var omvendt proportional med afstanden mellem i endothelial celler og fibroblaster31, således at den kortere afstand er fordelagtige for stabil vaskulære dannelse. Men for at åbne en klumpformet hul (1 mm i diameter) uden skadelige kanal 1 og 3, kanal 2 minimum bredde var 1,5 mm.
Selv om sfæroide afregner i bunden af brønden, var vaskulære rødder lejlighedsvis afbrudt fra microposts eller microchannels (figur 5). I dette tilfælde kunne ingen reagens nå den vaskulære lumen gennem microchannels (kanal 1 eller 3). Selv om vi ikke kunne løse problemet helt, formoder vi, at problemet skyldes det utilstrækkelige antal HUVECs på overfladen af fibrin gel (trin 4.2.1-4.2.6). Kontroller, at HUVECs stabilt vedhæfte sidevæg af kanal 2.
Mod den succesfulde injektion af en klumpformet i brønden, optimere mikropipette tips i trin 4.1.7 indre og ydre diameter er vigtigt: 1) den indre diameter skal være større end sfæroide. 2) den ydre dimeter skal passe til kanten af brønden, således at ingen lækage af gel opstår på toppen af brønden under injektion og spidsen let kan fjernes efter gel injektion. I denne protokol (φ1 mm af et godt klumpformet) er omkring 700 µm den maksimale diameter for den injicerbare klumpformet. Hvis godt diameter er større end i denne protokol, kan større spheroids injiceres, fordi spidsen kan skæres for at have større indvendige diameter. Klumpformet diametre kan styres let ved at ændre celle nummer høstet i 96-brønd plade.
For det første viser denne protokol roman mikrofluid platform til at konstruere en perfusable vaskulære netværk i en klumpformet. Selv om coculture med HUVECs tillader dannelsen af fartøj-lignende strukturer i en klumpformet18,23,24, var disse ikke perfusable på grund af lumina blindgyder. Fordi fibroblast celler findes i alsidige væv (knogle, adipocyt og kræft, osv.), ved tilsætning af nogle andre målretning celler til coculture sfæroide, en vascularization en forskellige slags spheroids kan forventes, som kan efterligne i vivo miljøet bedre end konventionelle klumpformet kultur. For at udvide anvendelsen af teknikken, ville fremtidige arbejde omfatte vascularization af spheroids uden tilsætning af fibroblastceller. Nogle nyere værker rapport knoglemarv stromale celler32 og muskel celler33 kan fremkalde angiogenese i mikrofluid enheder. Udnytte de stromale eller muskel celler i stedet for fibroblastceller ville øge antallet af væv, der kan være vaskulariserede i mikrofluid enhed. Denne protokol udgør en grundlæggende platform for væv vascularization, som er en længe ventet teknik inden for tre-dimensionelle kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CREST JST (grant nummer JPMJCR14W4), samfund for at fremme af videnskab (JSP'ER) KAKENHI (grant nummer 25600060, 16K 16386), The Center for Innovation Program fra MEXT og JST, projekt fokuseret på at udvikle nøglen evaluering teknologi fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling, AMED, Mizuho fundament til fremme af videnskab. Microfabrication blev støttet af Kyoto University Nano teknologi Hub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
