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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57242
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 1, 3, 2, 1
1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

Summary

Le protocole décrit comment un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde de l’ingénieur. Microenvironnement environnants de l’ellipsoïde est conçu pour induire l’angiogenèse et connecter l’ellipsoïde aux microcanaux dans un dispositif microfluidique. La méthode permet la perfusion de l’ellipsoïde, qui est une technique attendue dans les cultures en trois dimensions.

Abstract

Un sphéroïde (un agrégat multicellulaire) est considéré comme un bon modèle de tissus vivants dans le corps humain. Malgré l’avancement significatif dans les cultures de sphéroïde, un réseau vasculaire irrigables dans les sphéroïdes reste un défi crucial pour les cultures à long terme nécessaire pour maintenir et développer leurs fonctions, telles que les expressions de protéine et de morphogenèse. Le protocole présente une nouvelle méthode pour intégrer un réseau vasculaire irrigables dans l’ellipsoïde dans un dispositif microfluidique. Pour inciter un réseau vasculaire irrigables dans le sphéroïde, choux angiogénique connecté à microcanaux était guidés à l’ellipsoïde en utilisant des facteurs angiogéniques de fibroblastes pulmonaires humaines cultivées dans l’ellipsoïde. Les choux angiogénique atteint l’ellipsoïde, fusionnée avec les cellules endothéliales cultivées conjointement dans l’ellipsoïde et forment un réseau vasculaire continu. Le réseau vasculaire pourrait perfuse à l’intérieur de l’ellipsoïde sans aucune fuite. Le réseau vasculaire construit peut servir davantage comme une voie pour l’apport de nutriments et d’enlèvement des matières résiduelles, imitant de circulation de sang in vivo. La méthode fournit une nouvelle plate-forme dans la culture de sphéroïde vers mieux récapitulation des tissus vivants.

Introduction

Passer d’une culture (bidimensionnelle) monocouche à une culture en trois dimensions est motivée par la nécessité de travailler avec des modèles de culture qui imitent les fonctions cellulaires de la vie tissus1,2,3. Les substrats en plastique plats et durs couramment utilisés en culture cellulaire ne ressemblent pas à la plupart des environnements extracellulaires dans le corps humain. En effet, de nombreuses études démontrent cette architecture de tissu-spécifique de recréer en trois dimensions de la culture, des signaux mécaniques et biochimiques et communication de cellule-cellule, qui n’ont pas été observées dans la culture conventionnelle de deux dimensions4, 5,6,7,8.

Un agrégat multicellulaire ou ellipsoïde, est l’une des techniques plus prometteuses pour se rendre compte de cette culture en trois dimensions9,10. Les cellules sécrètent la matrice extracellulaire (ECM) et peuvent d’interagir avec d’autres de l’ellipsoïde. Bien que certains autre bioingénierie approches13,12,11,14, comme cellule d’empilage, répliquer avec succès la complexité spatiale du corps humain, ces approches ont seulement deux ou trois types de cellules pour la facilité d’analyse et concentré sur une seule fonction d’organes cibles. En revanche, les cellules en sphéroïdes sont exposées à des environnements de culture différente selon leurs positions dans l’ellipsoïde en raison de l’approvisionnement en nutriments, l’oxygène et paracrine et autocrine signalisation des molécules dans l’ellipsoïde hétérogène. Cette caractéristique des sphéroïdes reproduit partiellement en vivo condition de culture et d’activer les cellules en sphéroïdes à créer des tissus beaucoup plus complexe, organisé la structure in vitro que celles cultivées en empilement tissu9, 15 , 16. note que, si un sphéroïde est composé d’un seul type de cellules, la fonction des cellules de l’ellipsoïde n’est pas uniforme en raison de l’environnement hétérogène à l’ellipsoïde. En quelques années, cultures de sphéroïde autorisé des cellules souches embryonnaires (CSE), induite par les cellules souches pluripotentes (CISP) ou cellules souches de tissu-résident pour imiter les séquences de développement in vivo et recréer des mini-organes comme le cerveau17, du foie18et rein19,20.

Malgré des progrès importants dans les techniques de culture de sphéroïde, cultivant des sphéroïdes grands pendant une longue période est toujours problématique. Dans un tissu en trois dimensions, les cellules doivent être localisés au sein de 150 à 200 µm d’un vaisseau sanguin en raison de la quantité limitée d’oxygène et nutriments21. Les réseaux vasculaires au sein de l’ellipsoïde sont nécessaires pour récapituler les échanges de substances entre le sang et les tissus in vivo. Pour y parvenir, les autres groupes ont conjointement mis en culture des cellules endothéliales avec cible les cellules22,23,24 ou induit la différenciation des cellules pluripotentes dans CD31-positive cellules20. Néanmoins, les structures de navire comme signalés n’ont pas les extrémités ouvertes de la lumina pour fournir l’oxygène et des nutriments vers le centre de l’ellipsoïde. Pour simuler le rôle vasculaire pour nourrir les cellules dans la culture tridimensionnelle, ouvertes à tous et pleins de réseau vasculaire doit être développé dans l’ellipsoïde.

Au cours des dernières années, certains groupes de recherche dans le domaine de la microtechnique ont déclaré méthodes pour construire un réseau vasculaire irrigables, formé spontanément dans un dispositif microfluidique en utilisant des facteurs angiogéniques de fibroblastes cocultured25 ,26. Ces réseaux vasculaires ont une morphologie similaire à leurs homologues en vivo et peut être transformé par des facteurs environnementaux, ce qui les rend appropriés pour imiter les fonctions vasculaires dans une culture de sphéroïde. Ce protocole vise à construire un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde utilisant une plate-forme de microfluidique27. Le dispositif microfluidique est modifié par l' appareil a déjà été indiqué25 afin qu’un ellipsoïde peut être incorporé. En orientant la sécrétion angiogénique des cellules fibroblastes dans un sphéroïde aux cellules endothéliales de microcanaux, angiogénique choux des microcanaux anastomosées avec l’ellipsoïde et formée un réseau vasculaire irrigables. Cette méthode permet une livraison directe d’un large éventail de substances, telles que des molécules fluorescentes et perles l’échelle du micromètre à l’intérieur d’un sphéroïde, qui fournit le cadre pour une culture de tissus à long terme avec les réseaux vasculaires.

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Protocol

1. fabrication du moule DISPOSITIF MICROFLUIDIQUE

  1. Concevoir le modèle du dispositif microfluidique à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce (Clewin5 ou AutoCAD 2016, etc..). Pour la fonction de la Clewin5, consultez le manuel de l’utilisateur (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
    Remarque : Le fichier de conception est disponible en fichier complémentaire 1.
  2. Transférer le fichier de conception d’un générateur de mires micro et charger l’outil avec un masque de chrome enduit avec la résine photosensible positive.
  3. Exposer le photoresist positif dans la région de modèle à l’aide d’un micro générateur.
  4. Développer la photorésine positive à l’aide du développeur (Table des matières) et rincer le masque avec de l’eau désionisée (DI).
  5. En utilisant le gel de mordançage de chrome (Table des matières), attaquer le chrome sur la surface exposée où la résine photosensible positive a été supprimée. Rincez le masque avec l’eau distillée.
  6. Enlevez le restant de la résine photosensible sur le masque à l’acétone.
    Remarque : Le masque de transparence peut être une alternative pour le masque de Cr.
  7. Préparer une plaquette de silicium pur (4 pouces, P(100)) et un essorage manteau hexaméthyldisilazane (HMDS) à 3 000 tr/min pendant 30 s.
  8. Softbake HMDS pendant 5 min à 120 ° C et laisser refroidir les tranches pendant 5 min à température ambiante.
  9. Spincoat la résine photosensible négative (Table des matières) à 500 tr/min pendant 10 s et 1 200 tr/min pendant 30 s.
    Remarque : La condition de revêtement spin devrait produire les couches de résine photosensible avec une épaisseur d’environ 100 µm sur les wafers après la photolithographie.
  10. Précuites la photosensible négative pendant 45 min à 95 ° C et laisser refroidir la plaquette pendant 60 min à température ambiante.
  11. Vérifier l’intensité de la lumière UV dans chaque expérience et calculer le temps d’exposition pour une dose d’énergie de l’exposition totale à 250 mW/cm2. Placez le photomasque (étape 1.1 à 1.6) sur la plaquette et de les exposer à la lumière UV.
  12. Postbake la photosensible négative pendant 1 min à 65 ° C et 5 min à 95 ° C. Permettre la gaufrette se refroidir pendant 1 min à température ambiante.
  13. Développer la couche de résine photosensible négative pendant 15 min dans le premier bain de développeur (Table des matières) et 2 min dans le second bain. Rincer la plaquette dans le premier bain d’isopropanol (IPA) pour 10 s et dans le second bain IPA pour 10 s.
  14. Hardbake la photosensible négative pendant 30 min à 200 ° C et laisser refroidir les tranches pendant 5 min à température ambiante.
  15. Mesurer l’épaisseur de la couche de résine photosensible négative à l’aide d’un profileur de surface.
  16. Placer les tranches dans un dessicateur relié à une pompe à vide et ajouter 200 µL de silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Mettre en marche la pompe pendant 10 min, puis éteignez-le et garder la plaquette dans le dessiccateur pendant 4 h.

2. étapes fabrication et l’assemblage de couches PDMS

  1. Monter le prépolymère polydiméthylsiloxane (PDMS) (base de PDMS : agent de polymérisation = 10:1 (w/w)) et dégazer dans une chambre à vide pendant 2 h.
  2. Cure PDMS à 80° C dans un four ventilé air toute la nuit.
  3. Décollez les PDMS de la plaquette de silicium.
  4. Percez les trous 1 - 3 b (Figure 1) et de la culture de sphéroïde bien. Utiliser un punch de 2 mm de diamètre pour les trous 1 a - 3 b et 1 mm de diamètre du poinçon pour l’ellipsoïde bien.
  5. Nettoyer la dalle de PDMS et une lamelle de verre (24 × 24 mm) avec du ruban adhésif, de colle et décolle la bande à plusieurs reprises. Considérez la dalle PDMS avec plasma air pour 40 s (40 mW, 50 sccm).
  6. Lier la dalle PDMS sur la lamelle de verre pour expulser les bulles d’air de la surface entre la dalle PDMS et la lamelle couvre-objet et la guérison à 80 ° C pendant au moins 12 h.

3. sphéroïde préparation

Remarque : Dans l’étude, les protéine fluorescente rouge exprimant ombilical humain veine des cellules endothéliales (DP-HUVECs) et expression de la protéine fluorescente verte HUVECs (GFP-HUVECs) sont utilisés dans le sphéroïde et de microcanaux, respectivement, pour distinguer l’origine de HUVECs après la construction d’un réseau vasculaire irrigables. Si l’origine des HUVECs n’est pas nécessaire, sans étiquette HUVECs suffisent pour l’expérience.

  1. Décongeler le DP-HUVECs (3,0 × 105 cellules/flacon) et les fibroblastes pulmonaires humaines (hLF) (1,0 × 106 cellules/flacon) et ajoutez-les dans 10 mL de milieu pour les cellules endothéliales et les cellules de fibroblaste, respectivement (Table des matières). Culture les dans un plat de 100 mm à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2-3 jours pour Sub anastomosé DP-HUVECs et BFVS. Cette préparation permettra d’obtenir 200 ~ sphéroïdes.
  2. Détacher le DP-HUVECs et BFVS de la vaisselle avec 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et arrêter la réaction de la trypsine avec 4 mL de DMEM contenant 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF) et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine.
  3. Après centrifugation à 220 x g pendant 3 min, retirez le surnageant et remettre en suspension les DP-HUVECs et BFVS à moyen endothélial et concentrations de la dernière cellule à 2,5 × 104 et 1,0 × 105 cellules/mL, respectivement.
  4. Doucement, ajouter 200 µL de la suspension cellulaire (5 000 cellules pour DP-HUVECs) et 20 000 cellules pour BFVS / puits dans une plaque à 96 puits avec surface de liaison ultra faible.
  5. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant une période de 2 à 4 jours.
    NOTE : Puisque le diamètre de sphéroïde dépend de la période d’élevage et le numéro de la cellule initiale dans la plaque à 96 puits, il peut être contrôlé par ces deux paramètres.

4. cellule ensemencement dans le dispositif microfluidique

Remarque : La convention de nommage pour les trous, canaux et l’ellipsoïde bien sont illustrés dans la Figure 1. Nous définissons le jour 0 comme le jour lorsque la cellule récolte dans le dispositif microfluidique est terminée. Schéma des délais expérimentales est illustré à la Figure 2.

  1. Chargement de sphéroïde jour −1)
    Remarque : L’étape suivante doit être effectuée sur la glace pour empêcher la gélification du collagène et de fibrine.
    1. Dissoudre le fibrinogène dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour une concentration finale de 2,80 mg/mL.
    2. Préparer le collagène neutralisée (3,0 mg/mL dans du PBS) selon le protocole du fabricant.
    3. Mélanger 107.2 µL de solution de fibrinogène (2,80 mg/mL), 8.0 µL de collagène neutralisée (3,0 mg/mL) et 3,6 µL d’aprotinine (5 U/mL) par réaction dans un tube. Cette solution est étiquetée « solution master mix » (MS).
      Remarque : Le volume est suffisant pour le chargement d’un sphéroïde. Si il n’y a plus d’un sphéroïde, multipliez chaque volume par le nombre des sphéroïdes.
    4. Dissoudre la thrombine dans du PBS pour une concentration finale de 50 U/mL.
      Remarque : Les aliquotes de 50 thrombine U/mL (20 µL/tube) sont stockés à −30 ° C et sont décongelées avant chaque expérience.
    5. Placer la plaque à 96 puits contenant les sphéroïdes à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
    6. Préparer deux plats de Pétri de 35 mm à l’intérieur de la biosécurité du cabinet, avec un plat sur la glace (1 plat) et l’autre plat sur la table (vaisselle, 2). Pipette 99 µL de MS au centre du plat 1 (Figure 3 a) pour former une goutte.
    7. Couper les pointes des 2 jaunes (10-100 µL) et 3 clair de pointes de pipette (1-100 µL) pour la collecte des sphéroïdes de la plaque à 96 puits, mélange de thrombine avec MS, collection précise des sphéroïdes, injectant les sphéroïdes dans l’appareil et l’injection de médias dans le dispositif , respectivement. La taille des pores de la pointe devrait être légèrement plus grande que le diamètre des trous 1 a - 3 b des voies 1 et 3 ou l’ellipsoïde à canal 2 pour un confortable ajustement.
      Remarque : Ci-après, sauf indication contraire, utiliser les pointes de pipette coupés dans cette étape. La photographie des bouts coupés est disponible dans la Figure 4.
    8. Recueillir un sphéroïde avec 100 µL de milieu de la plaque à 96 puits et ajouter au plat 2 (Figure 3 a).
    9. Ramasser l’ellipsoïde avec un volume minimum de support de plat 2. Tout en maintenant la pipette verticale, l’ellipsoïde doit se déplacer vers le bas de l’embout de la pipette par gravité. Éjectez l’ellipsoïde en touchant l’extrémité de la pipette sur le ménisque de la gouttelette de MS dans plat 1 (Figure 3 a).
      Remarque : Les étapes suivantes 4.1.10 & 4.1.11 devraient être effectuées rapidement.
    10. Ajouter 1 µL de la thrombine (50 U/mL) et mélanger doucement avec la pointe de pipette jaune.
    11. Avec la pipette, la valeur 7 µL, ramasser la sphéroïde et placez-le lentement dans le puits de sphéroïde (Figure 3 b).
    12. Incuber pendant 15 min à 37 ° C pour la gélification de la fibrine.
    13. Injecter lentement le milieu endothélial de trous 1 a et 3 a, remplir les canaux 1 et 3 avec les médias (20 ~ 30 µL/canal).
    14. Placez l’appareil dans un plat de 100 mm avec un Kimwipe humide pour éviter une évaporation des médias de l’appareil (Figure 3C).
    15. Placez l’appareil à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h enlever les bulles à l’interface entre les médias et la fibrine.
  2. Jour 0) HUVECs chargement
    1. Dégel GFP-HUVECs (3,0 x 105 cellules/flacon) et les ajouter à 10 mL de milieu endothélial. Leur culture dans un plat de 100 mm à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2-3 jours atteindre sub-confluence. Un plat de GFP-HUVECs Sub confluentes est suffisant pour la préparation de 8 à 10 appareils.
    2. Détacher la GFP-HUVECs de la vaisselle avec 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et arrêter la réaction de la trypsine avec 4 mL de DMEM contenant 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF) et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine.
    3. Après centrifugation à 220 x g pendant 3 min, remettre en suspension les GFP-HUVECs dans le milieu de l’endothélium à 5,0 x 106 cellules/mL.
    4. Suspension de cellules HUVEC d’injecter dans le canal 1 à l’aide de trou 1 b (20 µL/canal).
    5. Le dispositif microfluidique à 90° d’inclinaison, placez-le sur le côté et incuber à 37 ° C pendant 30 min à faire en sorte que les HUVECs respectent la fibrine dans le canal 2.
      1. Confirmer l’attachement des HUVECs sur la fibrine. Lorsque le nombre des HUVECs attaché à l’interface entre le gel et le milieu n’est pas suffisant, le système vasculaire peut-être être déconnecté à l’origine vasculaire Après quelques jours de la culture de l’appareil (Figure 5). Dans le protocole, le taux de réussite de la perfusion est > 50 %.
    6. Répétez les étapes 4.2.4 et 4.2.5 du canal 3.
    7. Cellules en culture dans un plat de 100 mm avec un Kimwipe humide à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 7 à 14 jours.
  3. Jour 1 ~) échange des médias
    1. La moitié des médias dans les canaux 1 et 3 échanger tous les jours.

5. coloration des noyaux

  1. Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS.
  2. Retirez le support des canaux 1 et 3 et ajouter 20 µL de 4 % PFA par canal. Pour remplacer la solution à 4 % PFA, répéter enlever la solution de l’appareil et ajouter 4 % PFA trois fois.
  3. Incuber le dispositif à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  4. Enlever les 4 % PFA l’appareil et le nettoyer les canaux trois fois avec du PBS.
  5. Ajouter 20 µL de 10 µg/mL le colorant fluorescent (Table des matières) par canal pour colorer les noyaux cellulaires. Pour échanger la solution dans l’appareil, répétez supprimant la solution de l’appareil et en ajoutant 10 µg/mL le colorant fluorescent trois fois.
  6. Rangez l’appareil à 4 ° C pendant 24 h.

6. liquide Perfusion d’un sphéroïde

  1. Préparer l’ellipsoïde après mise en culture pendant plus de 7 jours dans le dispositif à 37 ° C et 5 % de CO2 pour accomplir un parcours vasculaire continu.
  2. Retirez le support de trous 1 a, 1 b, 3 a et 3 b.
  3. Introduire 10 µL de solution de 10 µM d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran dans du PBS dans les trous 1 a et 1 b.
  4. Surveiller les mouvements de microbilles ou un colorant FITC sous un microscope inversé.

7. la quantification de la longueur de la pousse

Remarque : Logiciel ver. 1,49 ImageJ est utilisé pour l’ensemble de l’analyse de l’image dans cette étude.

  1. Superposer les images de GFP-HUVECs jours 0, 1, 3, 5 et 7.
  2. Soustraire la position de l’extrémité de la vascularisation du jour 0 de la même position à images prises aux jours 1, 3, 5 et 7.
  3. Déterminer la croissance de la pointe vasculaire de la position de la racine (Figure 6). La distance entre la pointe vasculaire et de la racine a été définie comme la longueur de la pousse dans cette étude (Figure 7 b).

8. quantification des Angles vasculaires

NOTE : Angle vasculaire a été défini comme l’angle se composait d’angle vasculaire, racine et le centre de l’ellipsoïde (Figure 7 c).

  1. Binarize les images fluorescentes de l’ellipsoïde de coculture contenant DP-HUVECs et mesurer la position « centroïde » en fonction de l’analyse dans ImageJ. Dans cette étude, la position mesurée « centroïde » est définie comme le centre de l’ellipsoïde (Figure 6).
  2. Déterminer la position des conseils vasculaires et des racines de même manière à l’étape 7.
  3. Mesurer les angles vasculaires en utilisant la fonction d’analyse dans logiciels ImageJ.

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Representative Results

La figure 1 illustre une conception et une photo du dispositif microfluidique. Il a trois canaux parallèles, dans quel canal 2 contient l’ellipsoïde bien. Canaux 1 et 3 sont utilisés pour la culture HUVEC et canal 2 est pour l’ellipsoïde. Chaque canal est séparé par trapézoïdale microposts conçu pour modèle PDMS. Les microposts empêcher l’hydrogel en canal 2 d’une fuite dans les canaux 1 et 3 de la tension superficielle et permettre l’échange de substances entre sphéroïde les HUVECs en microcanaux28.

Figure 7 a montre le centre d’un dispositif microfluidique après l’ensemencement de la cellule. Champ lumineux et fluorescents images prises au jour 0 montrent que la fibrine rempli de gel que le canal 2 sans fuite vers les circuits 1 et 3, et HUVECs correctement attaché à la paroi latérale de la gel de fibrine. L’image du champ lumineux est mise au point sur le deux l’ellipsoïde chargé et microposts, indiquant que l’ellipsoïde est correctement réglé au bas de l’appareil. Les choux angiogéniques sont observées le jour 1 et la longueur du choux augmente avec le temps (Figure 7 b). Le jour 3, la plus longue pousse atteint l’ellipsoïde et le jour 7, la plupart des germes angiogénique atteint l’ellipsoïde (distance moyenne entre les voies 1 et 3 et le sphéroïde < 500 µm). Dans le meilleur des cas, après 4 jours de culture de l’appareil, écoulement à travers les lumières vasculaires peut être observé. L’angle vasculaire a été défini comme les directions de la pointe vasculaire et le centre de l’ellipsoïde de la racine vasculaire. C de la figure 7 montre l’angle vasculaire chiffré pendant 7 jours dans la culture de l’appareil. Les angles vasculaires ont diminué de manière dépendante du temps, ce qui indique que les choux angiogénique migrent vers l’ellipsoïde.

Figure 8 indique la section du réseau vasculaire où DP-HUVECs et GFP-HUVECs ont fusionné. DP-HUVECs et GFP-HUVECs coordonnée forment une simple lumière vasculaire comme indiqué par les flèches, qui clairement indiquer angiogénique germes des canaux 1 et 3 anastomosés à DP-HUVECs dans l’ellipsoïde et forment un réseau vasculaire continu. Pour confirmer la perfusability du réseau vasculaire, FITC-dextran a été injecté dans le canal 1. FITC-dextran dans la voie 1 se jette dans le réseau vasculaire construit et l’intérieur de l’ellipsoïde et finalement atteint au canal 3 (Figure 9). Au cours de la perfusion de solution FITC-dextran, il n’y a pas de fuite provenant du réseau vasculaire dans l’espace extravasculaire. Il a été démontré précédemment que les petites molécules injectées dans la lumière vasculaire traversent la paroi vasculaire et réagissent avec les cellules dans les régions extravasculaires. En outre, le coefficient de perméabilité du réseau vasculaire s’est avéré être à proximité de cette in vivo27. Ces résultats impliquent que le réseau vasculaire intégré pourrait fournir les nutriments à l’ellipsoïde et retirer le produit des déchets.

Figure 1
Figure 1 : Conception et une photo du dispositif microfluidique. (a) vue d’ensemble de la conception du dispositif microfluidique. Zone grise indique trois canaux microfluidiques séparés par microposts trapézoïdale. Canal 2 est doté d’un puits pour une culture de sphéroïde. Figure de droite montre la vue agrandie dans le rectangle rouge à gauche. (b) photo du dispositif microfluidique dont les canaux sont remplis à l’encre rouge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Temps expérimental. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Méthode pour charger un sphéroïde dans le dispositif microfluidique. (a) faire une goutte de MS et des médias avec un sphéroïde dans deux plats séparés. Ensuite, transférer l’ellipsoïde dans MS avec la thrombine. (b) vue en coupe schématique de l’appareil pendant l’injection de l’ellipsoïde. Excédent de gel s’écoule à travers les trous 2 a et 2 b. Cependant, l’ellipsoïde reste au bas de l’appareil en raison du confinement physique. (c) schéma des appareils quand ils sont dans un incubateur. Kimwipe humide a été placé dans un plat de 100 mm et deux plats de 35 mm avec le dispositif ont été mis sur la Kimwipe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les photographies de pointes de pipette couper pour cellule ensemencement à l’appareil. La pointe blanche gauche est pour les trous 1 a, 1 b, 3 a et 3C et sphéroïde transférant à une goutte de gel de fibrine (étapes 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 et 4.2.6). La pointe jaune moyenne est pour la collection de l’ellipsoïde de 96 puits (étape 4.1.7). La pointe droite blanche est pour le bien de l’ellipsoïde (étape 4.1.11). Les pointes avant coupe figurent également dans la photographie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Système vasculaire non irrigables. Choux d’angiogénique de microcanaux ne s’est pas connecté à l’espace compris entre microposts et perdu la connexion entre la lumière et les microcanaux (flèches noires). Elle est causée par les HUVECs insuffisantes ensemencées dans les canaux 1 et 3. Rouge : DP-HUVECs dans la sphéroïde, vert : GFP-HUVECs de microcanaux. Les cellules ont été cultivés dans l’appareil pendant 14 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Définition de la racine vasculaire, la pointe et au centre de l’ellipsoïde. (a) la méthode pour déterminer la position de la racine vasculaire et l’astuce pour mesurer la longueur de la pousse. Après avoir aligné les images fluorescentes Time-lapse, l’image fluorescente prise quelques jours après la mise en culture dans le dispositif est soustraite par l’image le jour 0. Nous avons mesuré la longueur des germes après la soustraction de logiciels ImageJ. b définition du centre de l’ellipsoïde. Les images fluorescentes des DP-HUVECs sont binarisées et mesurées à son centre de gravité de logiciels ImageJ. Nous entendons le centre de gravité au centre de l’ellipsoïde. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Formation d’un réseau vasculaire dans le dispositif microfluidique. (a) les images en Time-lapse de centre d’un dispositif microfluidique après l’ensemencement de la cellule. Rouge : DP-HUVECs cultivées dans l’ellipsoïde, vert : GFP-HUVECs récoltés dans les canaux 1 et 3. Analyse quantitative de la germination (b) et vasculaire angle (c) (n = 42 germes dans 3 appareils, les barres d’erreur indiquent les écarts-types (S.E.)). La longueur de la pousse a été définie comme la distance entre la position des HUVECs jour 0 jusqu'à l’extrémité vasculaire (b, top). L’angle (∠TRS) a été défini par la racine vasculaire (R), tip (T) et le centre de l’ellipsoïde (S) (c, en haut). Voir la Figure 6 pour la définition de la racine vasculaire, la pointe et au centre de l’ellipsoïde. Ces données ont été obtenues à l’aide de logiciels ImageJ. Les schémas expliquant la définition de la longueur de la pousse et l’angle vasculaire sont modifiés de Nashimoto, Y. et al. 27. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Formation de la lumière vasculaire par les HUVECs de microcanaux et l’ellipsoïde du. b image fluorescent de la vue d’ensemble de l’échantillon après 14 jours de culture de l’appareil. Rectangle jaune indique la position x-y de la section optique montrés dans (b). (b) x-y, y-z et x-z coupe optique du réseau vasculaire construit. Flèches blanches indiquent la lumière vasculaire. Rouge : DP-HUVECs cultivées dans l’ellipsoïde, vert : GFP-HUVECs cultivées dans les microcanaux, bleus : noyaux cellulaires. (a) ne montre aucune fluorescence bleue parce que (a) correspond à l’image avant la fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Perfusion d’un sphéroïde utilisant un réseau vasculaire construit. Champ lumineux (un) et fluorescents (b) des images de l’ellipsoïde après 7 jours de culture de l’appareil. (c) image fluorescent de l’ellipsoïde même après FITC-dextran (protéine de 70 kDa) chargement. Rouge : DP-HUVECs dans le sphéroïde et les voies 1 et 3, vert : FITC-dextran, bleu : noyaux cellulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

1 de fichier supplémentaire : la conception du dispositif microfluidique. Le fichier est au format dxf. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les rapports précédents montrent que BFVS sécrètent un cocktail de multiples facteurs angiogéniques angiopoietin-1, angiogenin, facteur de croissance des hépatocytes, transformant le facteur de nécrose tumorale et une matrice extracellulaire protéines29, facteur de croissance-α, 30. Cette analyse se fonde sur la sécrétion d’angiogénique de BFVS dans un sphéroïde de co-culture, qui est la limitation de la technique. Par conséquent, il est essentiel pour une formation vasculaire stable définir un sphéroïde de coculture au fond d’un puits pour que la distance entre la sphéroïde de co-culture et les HUVECs en voies 1 et 3 peut être raccourcie. La longueur vasculaire de fibroblastes était inversement proportionnelle à la distance entre les cellules endothéliales et les fibroblastes31, alors que la plus courte distance est avantageuse pour la formation vasculaire stable. Cependant, pour ouvrir un trou de sphéroïde (1 mm de diamètre) sans endommager voies 1 et 3, la largeur minimale du canal 2 a 1. 5 mm.

Bien que l’ellipsoïde se dépose au fond du puits, racines vasculaires ont été parfois déconnectés de le microposts ou de microcanaux (Figure 5). Dans ce cas, aucun réactif ne pourrait atteindre la lumière vasculaire par l’intermédiaire de microcanaux (canaux 1 ou 3). Bien que nous ne pourrions pas résoudre ce problème complètement, nous supposons que le problème est dû à l’insuffisance du nombre des HUVECs à la surface du gel de fibrine (étape 4.2.1-4.2.6). Assurez-vous que les HUVECs Fixez solidement la paroi latérale du canal 2.

Vers l’injection réussie d’un sphéroïde dans le puits, optimiser le diamètre interne et externe de conseils de la micropipette dans étape 4.1.7 est important : 1) le diamètre interne doit être supérieur à celle de l’ellipsoïde. 2) le dimeter externe doit enfoncer jusqu’au bord du puits jusqu'à ce qu’aucune fuite du gel se produit dans la partie supérieure du puits pendant l’injection et la pointe peut être facilement retirée après l’injection de gel. Dans le présent protocole (φ1 mm d’un sphéroïde bien), environ 700 µm correspond au diamètre maximal pour l’ellipsoïde injectable. Si le diamètre du puits est conçu plus élevé que dans le présent protocole, sphéroïdes plus grandes peuvent être injectés, parce que la pointe peut être coupée pour avoir de plus grands diamètres intérieurs. Diamètres de sphéroïde peuvent être contrôlées facilement en changeant le nombre de cellules récolté dans la plaque à 96 puits.

Ce protocole indique tout d’abord microfluidique nouvelle plate-forme pour construire un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde. Bien que la coculture avec HUVECs permet la formation de structures ressemblant à des navires à un sphéroïde de23,18,24, ceux-ci n’étaient pas pleins en raison les impasses des lumière des vaisseaux. Parce que les fibroblastes cellules existent dans polyvalents tissus (OS, adipocytes et cancer, etc.), par l’ajout de certaines autres cellules ciblage à l’ellipsoïde de co-culture, une vascularisation des différents types des sphéroïdes peuvent s’y attendre, qui peut imiter la en vivo environnement mieux que la culture conventionnelle sphéroïde. Afin d’élargir l’application de la technique, les travaux futurs comprendrait la vascularisation des sphéroïdes sans l’ajout de cellules fibroblastes. Quelques récentes œuvres rapport moelle cellules stromales32 et muscle cellules33 peut induire l’angiogenèse dans les dispositifs microfluidiques. Utilisant les cellules stromales ou musculaire plutôt que les cellules fibroblastes augmenterait le nombre de tissus qui peuvent être vascularisé dans le dispositif microfluidique. Ce protocole fournit une plate-forme pour la vascularisation des tissus, qui est une technique attendue dans le domaine des trois cultures dimensionnelles.

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Disclosures

L’auteur déclare qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par CREST JST (numéro de licence JPMJCR14W4), société pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (numéro de licence 25600060, 16K 16386), le centre du programme d’Innovation de MEXT et JST, projet axé sur le développement clé évaluation technologique de Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, Mizuho Fondation pour la Promotion des Sciences. Microfabrication était soutenue par Kyoto University Nano technologie Hub.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD 2017 Autodesk AutoCAD 2017
A chromium mask coated with AZP 1350. CLEAN SURFACE TECHNOLOGY CBL2506Bu-AZP
Micro pattern generator Heidelberg uPG101
MF CD-26 developer Rohm and haas electronic materials - Developer in protocol 1.4
S-Clean Sasaki Chemical S-24 Chromium etchant in protocol 1.5
Aceton Wako 012-00343
Silicon Wafer Canosis SiJ-4
Spin Coater MIKASA 1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS) Tokyo Ohka Kogyo H0089
SU-8 3050 MicroChem - Negative photoresist in protocol 1.9
UV Exposure Nanometric Technology Inc LA310s
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Developer for the negative photoresist in protocol 1.13
2-propanol Wako 163-04841
Surface profiler Veeco Veeco Dektak XT-S
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma 448931
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Toray 184W/C
Biopsy Punch (1.0mm)  Kai Industries BP-10F
Biopsy Punch (2.0mm)  Kai Industries BP-20F
Plasma System Femto Science COVANCE
Cover glass MATSUNAMI GLASS C024241
Culture Dishes Iwaki 1000-035
RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell Angio Proteomie cAP-0001RFP
Normal Human Lung Fibroblasts Lonza CC-2512
Endothelial Cell Growth Medium Lonza CC-3162
Fibroblast Growth Media Kits Lonza CC-3132
DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Solution Wako 168-23191
0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red Wako 204-16935
PBS (Phosphate Buffered Salts) Takara bio T900
96-well plate Sumitomo bakelite 631-21031
1000ul Chip NIPPON Genetics FG-402
200ul  Chip NIPPON Genetics FG-301
10ul Chip NIPPON Genetics 37650
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Model 370
GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell Angio Proteomie cAP-0001GFP
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Aprotinin from bovine lung Sigma A6279
Collagen I Corning 354236
Thrombin from bovine plasma Sigma T4648
Hoechst 33342 Invitrogen H21492 Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5
Paraformaldehyde Solution Wako 163-25983
Inverted Fluorescence Microscope OLYMPUS IX71
Degital CCD Camera OLYMPUS ORCA-R2
Confocal Laser Scanning Biological Microscope OLYMPUS FV1000
Inverted Fluorescence Microscope OLYMPUS IX-83
Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma FD70S

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References

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Bio-ingénierie numéro 134 réseau vasculaire dispositif microfluidique culture de tissus orgue-on-a-chip angiogenèse sphéroïde culture en trois dimensions
Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique
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Nashimoto, Y., Teraoka, Y., Banan Sadeghian, R., Nakamasu, A., Arima, Y., Hanada, S., Kotera, H., Nishiyama, K., Miura, T., Yokokawa, R. Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (134), e57242, doi:10.3791/57242 (2018).

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